陳燕玲*，羅 婷，吳秀香，凡 棟，李海洲，曾洪敏，康 毅，王曉玲，黃霜枝

（遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)病理生理學(xué)教研室，廣東 珠海 519041）

6-姜酚對丙酮醛誘導(dǎo)的HK-2腎小管上皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

陳燕玲*，羅 婷，吳秀香，凡 棟，李海洲，曾洪敏，康 毅，王曉玲，黃霜枝

（遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)病理生理學(xué)教研室，廣東 珠海 519041）

目的探討6-姜酚對丙酮醛誘導(dǎo)的HK-2腎小管上皮細(xì)胞（HK-2細(xì)胞）損傷的保護(hù)作用。方法采用丙酮醛誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞構(gòu)建細(xì)胞損傷模型，并用6-姜酚進(jìn)行干預(yù)。應(yīng)用CCK-8法檢測HK-2細(xì)胞的存活率；DAPI染色法檢測HK-2細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)變化。Western blot法檢測活化的caspase-3蛋白表達(dá)。結(jié)果與對照組相比，模型組細(xì)胞存活率下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），并出現(xiàn)明顯凋亡特征；而加入6-姜酚處理后，細(xì)胞存活率及活化的caspase-3蛋白水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論6-姜酚對丙酮醛誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。

6-姜酚；丙酮醛；HK-2細(xì)胞

糖尿病腎病（Diabetic Nephropathy，DN）是糖尿病的一種主要并發(fā)癥，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，包括糖脂代謝紊亂、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、腎臟血流動力學(xué)異常等。近年來，研究發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)非酶糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）是DN發(fā)生的重要原因。AGEs可通過改變腎小球基底膜結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致蛋白尿及腎小球硬化，加快DN的發(fā)展[1]。丙酮醛（methylglyoxal, MG）作為糖基化終末產(chǎn)物的前體，可以快速生成AGEs，從而引起系膜細(xì)胞及小管上皮細(xì)胞損傷[2]。

6-姜酚是由干姜提取出來的主要有效成分，研究發(fā)現(xiàn)其有抗炎、抗氧化、降壓以及抗腫瘤等藥理作用[3]。目前在臨床上沒有專門針對DN的特效藥物，只能通過控制血糖、血壓及改善微循環(huán)等措施，但療效欠佳。因此，本研究旨在通過MG誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞構(gòu)建細(xì)胞損傷模型，研究6-姜酚對抗丙酮醛誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞的損傷作用，為臨床治療DN提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1 材料及試劑

1.1.1 細(xì)胞株

由中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室提供。

1.1.2 藥品與主要試劑

6-姜酚購自上海同田生物技術(shù)有限公司（純度＞98%），丙酮醛購自上海源葉生物科技有限公司。細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒CCK-8購于同仁化學(xué)研究所，活化的caspase-3抗體及β-actin抗體均購自Cell Signaling Technology。

1.2 主要方法

1.2.1 6-姜酚對HK-2細(xì)胞存活率的影響

取對數(shù)生長期細(xì)胞，以2×108/L的細(xì)胞密度接種于96孔板，每孔100 μL，分為對照組（Control）、MG（400 μmol/L）處理組、MG+6-姜酚（1，10，50，100，200 μmol/L）共處理組。每組設(shè)5個復(fù)孔，培養(yǎng)24 h。酶標(biāo)儀測定450 nm處吸OD值，計(jì)算細(xì)胞存活率的方法：細(xì)胞存活率（%）=（處理組OD值-空白孔OD值）/（對照組OD值-空白孔OD值）×100%。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2 6-姜酚對HK-2細(xì)胞凋亡的影響

實(shí)驗(yàn)分為對照組、MG處理組、MG+6-姜酚組以及6-姜酚組，取對數(shù)生長期細(xì)胞，按3×107/L的細(xì)胞密度均勻接種于6孔培養(yǎng)板內(nèi)，經(jīng)相應(yīng)藥物處理24h后，加入1μg/L DAPI試劑，室溫避光孵育20 min后，熒光顯微鏡下隨機(jī)選取10個不重復(fù)區(qū)拍照。

1.2.3 Western blot 法檢測活化的caspase-3蛋白表達(dá)水平

HK-2細(xì)胞接種于100mm培養(yǎng)皿中，經(jīng)相應(yīng)藥物處理24 h后，加入RIPA細(xì)胞裂解液，冰上裂解細(xì)胞，提取蛋白。每組蛋白上樣量為50 μg，電泳：恒壓80V 30 min，100V60 min。電轉(zhuǎn)：恒流200mA 1h。5%脫脂奶粉封閉，加入caspase-3一抗，4℃搖床孵育過夜，加入二抗。β-actin作為內(nèi)參。在暗室曝光、顯影及定影后，使用ImageJ軟件對條帶進(jìn)行灰度分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以“±s”表示，采用t檢驗(yàn)；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 6-姜酚對MG誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞存活率的影響

如圖1所示，與對照組相比，MG處理后HK-2細(xì)胞細(xì)胞活力明顯降低，而加入6-姜酚后，細(xì)胞活力明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 6-姜酚對MG誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞存活率的影響**P＜0.01與對照組相比（± s，n=5）

2.2 6-姜酚對MG誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞凋亡的影響

如圖2所示，對照組細(xì)胞核染色均勻，核呈圓形；經(jīng)MG處理后，部分HK-2細(xì)胞出現(xiàn)典型的凋亡特征，即細(xì)胞核固縮以及變得不規(guī)則，而加入6-姜酚處理后HK-2細(xì)胞凋亡細(xì)胞數(shù)目減少。

圖2 6-姜酚的抗凋亡作用

2.3 6-姜酚對MG誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞活化caspase-3蛋白表達(dá)的影響

如圖3所示，HK-2細(xì)胞經(jīng)MG處理后，活化caspase-3蛋白的表達(dá)水平均明顯增高，而加入6-姜酚處理后caspase-3蛋白表達(dá)水平明顯降低。

圖3 6-姜酚對MG誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞活化caspase-3蛋白表達(dá)的影響*P＜0.05與對照組相比（± s，n=3）

3 討 論

糖尿病腎?。―N）是臨床上最常見的糖尿病并發(fā)癥，在歐洲約20～40%糖尿病患者最終發(fā)展為DN，這也是臨床上患者進(jìn)行透析治療的首要原因[4]。DN的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，近年來研究發(fā)現(xiàn)糖基化終產(chǎn)物（AGEs）的前體丙酮醛的過度生成，導(dǎo)致糖尿病患者靶器官損傷，是糖尿病并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展的核心環(huán)節(jié)[2]。丙酮醛作為葡萄糖代謝的副產(chǎn)物，其水平在糖尿病患者中明顯升高[5]。丙酮醛對腎小管上皮細(xì)胞有直接的損傷作用，這種損傷作用會加重糖尿病腎病的嚴(yán)重程度。

6-姜酚是從傳統(tǒng)的藥食兩用植物干姜中提取出來的成分，具有抗氧化、抗動脈粥樣硬化、抗炎等廣泛的藥理學(xué)作用[3]。本研究顯示，丙酮醛可以抑制HK-2細(xì)胞的存活率并誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞發(fā)生凋亡，而6-姜酚可以對抗丙酮醛對HK-2細(xì)胞的毒性作用。本實(shí)驗(yàn)將為干姜在臨床上的進(jìn)一步應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1] 李敏州,高彥彬,馬鳴飛,朱智耀,鄒大威,李 勤.糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制研究進(jìn)展[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2012,22:344-349.

[2] Ramasamy R,Yan SF,Schmidt AM,Methylglyoxal comes of AGE. Cell,2006,124(2):258-60..

[3] Chen YL,Zhuang XD,Xu ZW,et al.Higenamine Combined with 6-Gingerol Suppresses Doxorubicin-Triggered Oxidative Stress and Apoptosis in Cardiomyocytes via Upregulation of PI3K/Akt Pathway,Evid Based Complement Alternat Med.2013;2013:970490.

[4] Dronavalli S,Duka I,Bakris GL,The pathogenesis of diabetic nephropathy,Nat Clin Pract Endocrinol Metab,2008,4(8):444-52.

[5] McLellan AC,Thornalley PJ,Benn J,et al.glyoxalase system in clinical diabetes mellitus and corelation with diabetic complications.Clin Sci (Lond),1994,87(1):21-9.

6- gingerol protects HK-2 cells against injury induced by methylglyoxal

CHEN Yan-ling, LUO Ting, WU Xiu-xiang, FAN dong, LI Hai-zhou, ZENG Hong-min, KANG Yi,WANG Xiao-ling, HUANG Shuang-zhi
(Department of Pathophysiology, Zhuhai Campus of Zunyi Medical University, Guangdong Zhuhai 519041, China)

ObjectiveTo observe the protective effect of 6- gingerol on the injury of HK-2 cells induced by methylglyoxal.MethodsHK-2 cells were incubated with 400μmol/L methylglyoxal for 24h and treated with different concentrations of 6- gingerol (1,10,50,100,200μmol/L).Cell viability was measured by CCK-8 assay.The morphological changes in apoptotic cells were evaluated by DAPI.The protein level of activated caspase-3 was tested by western blot.ResultsCompared with control group, cell viability of HK-2 cells were significant reduced by methylglyoxal;moreover,the apoptotic cells and protein level of activated caspase-3 was increased after incubated with methylglyoxal, which was inhibited by treatment of 6- gingerol.Conclusion6- gingerol had a protective effect on HK-2 cells against the injuries induced by methylglyoxal through raising cell viability and inhibiting apoptosis.

6- ginger phenol; acetone aldehyde; HK-2 cell

R285.5

A

ISSN.2095-8242.2017.057.11095.03

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（NO.：81560133）；貴州省科技合作計(jì)劃項(xiàng)目（NO.：黔科合LH字[2015]7529號）；遵義醫(yī)學(xué)院博士科研啟動基金

陳燕玲，E-mail：546475534@qq.com

本文編輯：趙小龍