毛貽璽，劉鳳軍，張玉玲，付曉森，董文亞

(河南科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，河南 洛陽 471003)

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鉬對(duì)白消安致小鼠不孕不育癥模型繁殖障礙的影響

毛貽璽，劉鳳軍，張玉玲，付曉森，董文亞

(河南科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，河南 洛陽 471003)

為了研究鉬對(duì)白消安致小鼠不孕不育癥模型繁殖障礙的影響，通過單次腹腔注射30 mg/kg白消安構(gòu)建昆明白小鼠不孕不育癥模型。將不孕不育癥的雄鼠和雌鼠隨機(jī)各分為4組，雄鼠飲用水中鉬質(zhì)量濃度為0 mg/L、12.5 mg/L、25.0 mg/L和50.0 mg/L，雌鼠飲用水中鉬質(zhì)量濃度為0 mg/L、2.5 mg/L、5.0 mg/L和10.0 mg/L。飲鉬后第1～4周剖取雄鼠睪丸、附睪及雌鼠卵巢，計(jì)算附睪及卵巢系數(shù)，同時(shí)對(duì)睪丸及卵巢切片用蘇木精-伊紅(HE)染色法染色。研究結(jié)果表明：雄鼠12.5 mg/L鉬組的睪丸形態(tài)結(jié)構(gòu)恢復(fù)速度較快，附睪系數(shù)顯著提高，各級(jí)精原細(xì)胞的層數(shù)增多，排列緊密有序；雌鼠2.5 mg/L鉬組的卵巢形態(tài)結(jié)構(gòu)恢復(fù)較好，卵巢內(nèi)率先出現(xiàn)卵母細(xì)胞。鉬在適宜劑量12.5 mg/L(雄鼠)或2.5 mg/L(雌鼠)時(shí)，對(duì)不孕不育小鼠睪丸或卵巢功能有明顯恢復(fù)作用。

鉬；繁殖障礙；白消安；不孕不育；睪丸；卵巢

0　引言

隨著社會(huì)的發(fā)展，不孕不育癥的發(fā)病率越來越高[1]，全世界約有15%的夫婦患有不孕不育癥[2]。這可能是由于環(huán)境、食物或其他消費(fèi)品中存在的一些物質(zhì)，干擾了與機(jī)體正常生殖機(jī)能有關(guān)的激素合成與代謝[3]。導(dǎo)致不孕不育的原因包括生精障礙、排卵障礙、子宮畸形、輸卵管阻塞、腹膜因素和宮頸因素等[4]。迄今為止，許多技術(shù)已被應(yīng)用于治療不孕不育癥，如輔助生殖技術(shù)[5]、體外受精技術(shù)、胚胎移植技術(shù)[6]和精原干細(xì)胞移植技術(shù)[7-8]等。盡管治療不孕不育癥的研究取得了很大的進(jìn)展，但總體治愈率(<41%)仍然較低。因此，仍需進(jìn)一步探索高效的治療方法。

鉬(Mo)是機(jī)體必需的微量元素之一，對(duì)人類及動(dòng)物保持正常代謝有重要作用[9-10]。鉬可以通過催化羥基化、氧原子轉(zhuǎn)移和其他氧化還原反應(yīng)，促進(jìn)機(jī)體內(nèi)物質(zhì)的新陳代謝和某些代謝產(chǎn)物的排出[11-12]，能對(duì)機(jī)體的多種組織或器官產(chǎn)生影響。在本課題組前期的研究中發(fā)現(xiàn)：鉬對(duì)小鼠雌性及雄性生殖器官(卵巢和睪丸)具有正反兩方面的作用[13-14]。文獻(xiàn)[13]報(bào)道：小鼠飲用鉬質(zhì)量濃度高于20 mg/L后，卵巢充血，并伴有MII期卵母細(xì)胞形態(tài)異常及卵巢質(zhì)量減輕；然而，飲用鉬質(zhì)量濃度為5 mg/L時(shí)，能夠顯著提高排卵數(shù)量和MII期卵母細(xì)胞質(zhì)量。文獻(xiàn)[14]的研究表明：小鼠飲用鉬質(zhì)量濃度為25 mg/L時(shí)，能夠顯著提高雄性小鼠的多個(gè)生殖參數(shù)。上述研究表明：適當(dāng)劑量的鉬可以改善哺乳動(dòng)物雌性及雄性的生殖功能。據(jù)此，可以推測：鉬有可能有治療不孕不育癥的功效，但目前尚未見到相關(guān)研究。

本文用白消安[15-16]制作了不孕不育癥的小鼠試驗(yàn)動(dòng)物模型，然后，對(duì)模型小鼠實(shí)施飲鉬處理，通過觀察雄性和雌性生殖器官組織形態(tài)結(jié)構(gòu)及其參數(shù)的變化，探索了鉬對(duì)小鼠不孕不育癥模型繁殖障礙的影響。

1　材料和方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)動(dòng)物為5～6周齡、體質(zhì)量25～30 g的雌性和雄性昆明白小鼠，購自山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室(生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK魯20130001、SPF級(jí)昆明種小鼠)。小鼠自由采食飲水，飼養(yǎng)環(huán)境溫度(25±2) ℃，濕度40%～70%。每天光照時(shí)間10～12 h。

1.2主要試劑

白消安(C6H14O6S2)、二甲基亞砜(DMSO，購自鄭州鼎國生物公司)、鉬酸鈉(Na2MoO4·2H2O，購自天津化學(xué)試劑四廠)、透明質(zhì)酸酶、孕馬血清促性腺激素(PMSG 1 000 UI/支，購自寧波市三生藥業(yè)有限公司)、人絨毛膜促性腺激素(HCG 1 000 UI/支，購自寧波市三生藥業(yè)有限公司)，其他試劑均購自Sigma公司。

1.3試驗(yàn)方法

通過單次腹腔注射30 mg/kg的白消安構(gòu)建昆明白小鼠不孕不育癥模型，注射白消安后的第30 天，將雄鼠和雌鼠隨機(jī)各分為4組，每組140只。雄鼠飲水中分別添加0 mg/L、12.5 mg/L、25.0 mg/L和50.0 mg/L的鉬，雌鼠飲水中分別添加0 mg/L、2.5 mg/L、5.0 mg/L和10.0 mg/L的鉬，開始持續(xù)飲鉬試驗(yàn)。在飲鉬開始后的第1周、第2周、第3周和第4周，剖取雄鼠睪丸、附睪及雌鼠卵巢，計(jì)算附睪及卵巢系數(shù)，同時(shí)對(duì)睪丸及卵巢切片用蘇木精-伊紅(hematoxylinand eosin,HE)染色法染色。與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組相關(guān)生殖參數(shù)的恢復(fù)程度為生殖功能恢復(fù)的判定依據(jù)。

1.4數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)，用Duncan法進(jìn)行多重比較，P<0.01表明差異極顯著，P<0.05表明差異顯著，P>0.05表明差異不顯著，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。

2　結(jié)果

2.1白消安對(duì)雄性小鼠生殖參數(shù)的影響

白消安對(duì)雄性小鼠生殖參數(shù)的影響見表1，對(duì)睪丸形態(tài)的影響見圖1。由表1可知：注射30 mg/kg白消安30 d后，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組附睪系數(shù)極顯著降低(P<0.01)；附睪中無可見精子，精子密度和精子活力為0，無精子畸形率。與對(duì)照組睪丸形態(tài)(見圖1a)相比，注射白消安后第10天，睪丸內(nèi)基底膜生殖細(xì)胞開始減少，精子未受影響(見圖1b)。注射白消安后第20天，睪丸內(nèi)基底膜的生精細(xì)胞幾乎消失，曲細(xì)精管內(nèi)有脫落的生殖細(xì)胞，精子數(shù)量明顯減少(見圖1c)。注白消安后第30天，睪丸曲細(xì)精管呈薄空管狀，基底膜的生殖細(xì)胞消失，無精子(見圖1d)。

表1　白消安對(duì)雄性小鼠生殖參數(shù)的影響

注：同列上標(biāo)字母不同表示差異極顯著(P< 0.01)。

圖1　白消安對(duì)睪丸形態(tài)的影響

2.2白消安對(duì)雌性小鼠生殖參數(shù)的影響

白消安對(duì)雌性小鼠生殖參數(shù)的影響見表2，對(duì)卵巢形態(tài)的影響見圖2。由表2可知：注射 30 mg/kg

表2　白消安對(duì)雌性小鼠生殖參數(shù)的影響

注：同列上標(biāo)字母不同表示差異極顯著(P<0.01)。

白消安30 d后，卵巢系數(shù)、排卵數(shù)和畸形率情況均有顯著變化。與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組卵巢系數(shù)明顯降低，差異極顯著(P<0.01)，此時(shí)卵巢中無卵子。與對(duì)照組的卵巢形態(tài)(見圖2a)相比，注射白消安后第10天，卵巢內(nèi)出現(xiàn)空洞，卵細(xì)胞有受損跡象(見圖2b)；第20天，卵巢內(nèi)的空洞面積顯著增大，無卵細(xì)胞(見圖2c)；第30天，卵巢內(nèi)空洞充滿整個(gè)卵巢，無卵細(xì)胞(見圖2d)。

圖2　白消安對(duì)卵巢形態(tài)的影響

2.3鉬對(duì)不育雄鼠附睪系數(shù)的影響

鉬對(duì)不育雄鼠附睪系數(shù)的影響見表3。由表3可看出：飲鉬后的第1周和第2周，與對(duì)照組相比，50 mg/L組的附睪系數(shù)明顯降低(P<0.01)，12.5 mg/L組和25.0 mg/L組的附睪系數(shù)雖有升高，但無顯著變化。第3周試驗(yàn)各組與對(duì)照組相比差異不顯著。第4周與對(duì)照組相比，12.5 mg/L 組附睪系數(shù)極顯著升高(P<0.01)，25.0 mg/L組和50.0 mg/L組無顯著差異。

表3　鉬對(duì)不育雄鼠附睪系數(shù)的影響

注：同列上標(biāo)字母不同表示差異極顯著(P<0.01)。

2.4鉬對(duì)不育雄鼠睪丸組織的影響

不育雄鼠飲鉬后，睪丸曲細(xì)精管變化見圖3。圖3中：第1組鉬質(zhì)量濃度為0 mg/L；第2組鉬質(zhì)量濃度為12.5 mg/L；第3組鉬質(zhì)量濃度為25.0 mg/L；第4組鉬質(zhì)量濃度為50.0 mg/L。第1組：第1～2周睪丸曲細(xì)精管呈薄空管狀(見圖3中a1和a2)；第3周曲細(xì)精管內(nèi)部分生精細(xì)胞開始增殖(見圖3中a3)；第4周，管腔中出現(xiàn)生精細(xì)胞層(見圖3 中a4)。第2組：第1周，曲細(xì)精管呈薄的空管狀，曲細(xì)精管內(nèi)無生精細(xì)胞(見圖3 中b1)；第2周，管腔內(nèi)生殖細(xì)胞開始增殖(見圖3中 b2)；第3周，生精細(xì)胞增殖緩慢，為1～2層(見圖3中b3)；第4周，生殖細(xì)胞層數(shù)增加到3～5層(見圖3中b4)，排列緊密，整齊有序。第3組：第1周，管腔呈薄空管狀，曲細(xì)精管內(nèi)無生殖細(xì)胞(見圖3 中c1)；第2～3周，管腔中見1～2層生殖細(xì)胞，排列紊亂松散(見圖3中c2和c3)；第4周，生殖細(xì)胞增殖0～4層，排列不均勻、紊亂松散(見圖3中 c4)；第4組：第1～3周管腔呈薄空管狀，生精細(xì)胞層無恢復(fù)，睪丸曲細(xì)精管內(nèi)無生精細(xì)胞層(見圖3 中d1～d3)；第4周，生殖細(xì)胞增殖1～2層，層數(shù)分列不均，稀疏散亂(見圖3中d4)。

2.5鉬對(duì)不孕雌鼠卵巢系數(shù)的影響

鉬對(duì)不孕雌鼠卵巢系數(shù)的影響見表4。由表4可看出：第1～3周，0 mg/L、2.5 mg/L、5.0 mg/L和10.0 mg/L組間卵巢系數(shù)差異不顯著；第4周，2.5 mg/L、5.0 mg/L和10.0 mg/L組對(duì)卵巢系數(shù)均有恢復(fù)作用，5.0 mg/L組的卵巢系數(shù)極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。

表4　鉬對(duì)不孕雌鼠卵巢系數(shù)的影響

注：同列上標(biāo)字母不同表示差異極顯著(P<0.01)。

2.6鉬對(duì)不孕雌鼠卵巢組織的影響

不孕雌鼠飲鉬后第1～4周，卵巢組織HE染色結(jié)果如下：第1組質(zhì)量濃度為0 mg/L；第2組質(zhì)量濃度為2.5 mg/L；第3組質(zhì)量濃度為5.0 mg/L；第4組質(zhì)量濃度為10.0 mg/L。第1組：第1～3周，卵巢組織的空洞逐漸減少，卵巢組織逐漸恢復(fù)，但無卵泡細(xì)胞；第4周，卵巢組織大面積恢復(fù)，仍無卵泡細(xì)胞。第2組：第1～3周卵巢組織的空洞逐漸減少，卵巢組織慢慢恢復(fù)，無卵泡細(xì)胞；第4周，卵巢組織中有少許空洞，幾乎全部恢復(fù)且可見卵泡細(xì)胞。第3組和第4組：恢復(fù)程度與第1組類似，空洞減少，卵巢組織漸漸恢復(fù)，無卵泡細(xì)胞。

3　討論

本文研究結(jié)果顯示：適宜劑量的鉬對(duì)不孕不育癥模型小鼠的生殖功能有治療作用。對(duì)雄性不育小鼠，在本文研究的4個(gè)質(zhì)量濃度中，12.5 mg/L的鉬附睪系數(shù)顯著高于對(duì)照組，這表明附睪損傷得到了明顯的恢復(fù)，精子成熟場所在逐步改善。12.5 mg/L 鉬增加了睪丸生精功能，管腔中各級(jí)生精細(xì)胞也有所增加，從基底膜開始恢復(fù)，增殖到3～5層，排列整齊有序。文獻(xiàn)[14]的研究結(jié)果顯示：給健康小鼠飲用質(zhì)量濃度為 25.0 mg/L 的鉬，降低了睪丸過氧化損傷程度，睪丸質(zhì)量得到明顯改善，這與本文研究結(jié)果一致。

鉬是人與動(dòng)物所需的微量營養(yǎng)元素，有重要的生物學(xué)作用。適量鉬能提高機(jī)體內(nèi)細(xì)胞免疫力，增加細(xì)胞對(duì)病毒的抵抗力，對(duì)生殖系統(tǒng)有積極作用，可以提高生殖參數(shù)。文獻(xiàn)[17]飼喂小鼠鉬后發(fā)現(xiàn)：可以提高睪丸中超氧化物歧化酶的活性，顯著降低丙二醛含量，使睪丸組織氧化程度下降，睪丸功能增強(qiáng)。

對(duì)雌性不孕小鼠，飲鉬質(zhì)量濃度在2.5 mg/L時(shí)顯著增加了卵巢系數(shù)，這表明卵巢組織功能得到了明顯的恢復(fù)。卵巢組織切片結(jié)果表明，2.5 mg/L組卵巢組織恢復(fù)顯著比其他組的卵巢組織恢復(fù)快，至第4周，卵巢組織中剩余少許空洞，卵巢內(nèi)率先出現(xiàn)卵泡細(xì)胞。這有可能是由于鉬降低了不孕癥小鼠卵巢的氧化損傷，恢復(fù)了卵巢的功能。氧化應(yīng)激是造成卵巢損傷，卵母細(xì)胞畸形，最終導(dǎo)致雌性不孕的原因之一。文獻(xiàn)[13]研究發(fā)現(xiàn)：5 μg/mL的鉬能夠降低小鼠卵巢的氧化損傷，改善卵巢的功能，顯著提高排卵的數(shù)量并降低卵母細(xì)胞畸形率，這與本研究結(jié)果接近。

綜上所述，鉬在適宜的劑量(雄鼠12.5 mg/L，雌鼠2.5 mg/L)時(shí)，對(duì)不孕不育癥小鼠的生殖機(jī)能障礙有明顯的治療作用，有可能成為治療不孕不育癥的一種新的候選藥物。

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國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30901026);河南省高等學(xué)校青年骨干教師基金項(xiàng)目(2010GGJS-071)

毛貽璽(1988-),女,河南新鄉(xiāng)人,碩士生;劉鳳軍(1979-),男,通信作者,內(nèi)蒙古赤峰人,副教授,博士,碩士生導(dǎo)師,主要研究方向?yàn)閯?dòng)物生殖疾病與生殖調(diào)控.

2015-10-20

1672-6871(2017)01-0073-05

10.15926/j.cnki.issn1672-6871.2017.01.015

S854

A