殷萌清, 馮建祥, 黃小芳, 蔡中華, 林光輝,*, 周進(jìn),*

1.清華大學(xué), 地球系統(tǒng)科學(xué)研究中心, 北京100084 2.清華大學(xué)深圳研究生院, 海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)部, 深圳518055

天然及人工紅樹林土壤微生物群落結(jié)構(gòu)分析

殷萌清1,2, 馮建祥2, 黃小芳2, 蔡中華2, 林光輝1,2,*, 周進(jìn)2,*

1.清華大學(xué), 地球系統(tǒng)科學(xué)研究中心, 北京100084 2.清華大學(xué)深圳研究生院, 海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)部, 深圳518055

應(yīng)用高通量測序和OTU分析法比較了紅樹植物人工修復(fù)區(qū)(Transplant-, TP)與天然區(qū)(Natural-, NA)土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)差異。結(jié)果顯示: 從群落組成來看, 細(xì)菌在天然林和人工林主要由27個(gè)門類的菌群組成, 優(yōu)勢菌群包括變形桿菌(Proteobacteria)、擬桿菌(Bacteroidetes)、綠彎菌(Chloroflexi)、酸桿菌(Acidobacteria)、浮霉菌(Planctomycetales)。古菌的組成在綱的水平上主要以鹽桿菌(Halobacteria)、熱原體(Thermoplasmata)和甲烷菌(甲烷微菌Methanomicrobia、甲烷桿菌 Methanobacteria、甲烷球菌 Methanococci)為主, 其中鹽桿菌占的比重最大(約 19%—37%)。從結(jié)構(gòu)來看, 多樣性指數(shù)(H)和豐富度指數(shù)(Schao)表明: 天然林和人工林細(xì)菌的多樣性和豐度均高于古菌, 天然林多樣性及豐度均高于人工林(NA＞TP)。此外, 對(duì)采集的樣本進(jìn)行主成分分析(PCA)顯示細(xì)菌聚成兩大類: 源自外周土壤的菌群聚成一類, 源自根際土壤的菌群聚成另一類; 古菌則按生境聚成三類: 分別是天然林、人工林和采自非紅樹區(qū)的基圍魚塘。對(duì)細(xì)菌來說, 經(jīng)長時(shí)間修復(fù)的人工林與天然林的外周土壤群落結(jié)構(gòu)差異不大, 顯示出了趨同性; 但同一環(huán)境下的根際與外周土壤群落結(jié)構(gòu)差異較大, 體現(xiàn)了明顯的根際效應(yīng)。古菌結(jié)構(gòu)受根際效應(yīng)的影響較小, 受環(huán)境因素影響較大。

天然林; 人工林; 土壤微生物; 群落結(jié)構(gòu); 根際效應(yīng); 秋茄

1 前言

紅樹林是生長在熱帶、亞熱帶潮間帶的木本植物群落, 擁有五倍于熱帶雨林的生態(tài)服務(wù)價(jià)值, 與珊瑚礁、上升流、鹽沼濕地組成了海洋四大高生產(chǎn)力生態(tài)系統(tǒng)[1]。然而, 隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展, 人為活動(dòng)的頻繁和環(huán)境的惡化造成了紅樹植被的大面積退化。過去的50年中已有三分之一的紅樹林消失, 2015年的最新統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明, 全球紅樹林面積僅為4.0萬hm2[2]。我國擁有有限的紅樹林資源, 其總面積不到1.5萬 hm2,95%以上分布在北部灣沿岸和海南島?；诩t樹林在濱海生態(tài)系統(tǒng)中的調(diào)節(jié)能力和全球變化中的重要作用, 近年來紅樹林的保護(hù)和資源修復(fù)越來越受到重視, 世界各國紛紛開展了相應(yīng)的保護(hù)措施[3], 我國也啟動(dòng)了紅樹林濕地行動(dòng)計(jì)劃, 將人工種植作為資源修復(fù)的重要方式[4]。

植物的移栽和修復(fù)效果受多種因素的影響, 包括溫度、鹽度、營養(yǎng)以及土壤介質(zhì)等。其中, 土壤環(huán)境是紅樹植物存活和成功移栽的一大關(guān)鍵[5]。而對(duì)于土壤環(huán)境的量化評(píng)價(jià)除了傳統(tǒng)的理化指標(biāo)以外,土壤中微生物的組成和群落結(jié)構(gòu)也是影響土壤質(zhì)量的重要因子。已有的研究表明, 紅樹植物與其土壤微生物之間存在密切的互作關(guān)系。一方面, 微生物通過能量循環(huán)和物質(zhì)轉(zhuǎn)化(氮、碳、磷、硫、鐵)促進(jìn)植物生長, 從而為生態(tài)系統(tǒng)中的其它生物提供生態(tài)位和營養(yǎng)來源[6]; 另一方面, 紅樹林的健康狀況也影響微生物的多樣性和群落結(jié)構(gòu)。“植物-微生物”的相互關(guān)系在探明物質(zhì)平衡、闡述氣候變化以及揭示紅樹濕地起源上具有重要意義[7-8]。在探討紅樹修復(fù)過程中微生物的變化方面也有過諸多嘗試。Gomes等[8]利用短期的胚軸實(shí)驗(yàn)(3-6個(gè)月), 驗(yàn)證了根際微生物在植物健康移栽中的作用, 推薦將微生物組成作為評(píng)估紅樹保育效果的參照指標(biāo)。此外, 一些作者證實(shí)了濕地環(huán)境下不同植物的根際微生物群落各異[10], 且不同修復(fù)林齡的植株根際微生物的組成也存在明顯的差異[11]; 這些差異的產(chǎn)生與土壤營養(yǎng)狀況、pH、土壤呼吸強(qiáng)度、以及土壤有機(jī)質(zhì)的多寡等有關(guān)[11]。本實(shí)驗(yàn)室前期的工作也發(fā)現(xiàn)修復(fù)林的微生物組成與時(shí)間(4-8年)呈現(xiàn)一定的正相關(guān), 即林齡越長微生物組成越趨同[12]。然而, 更長時(shí)間尺度上(25年以上)的微生物差異還未見報(bào)道。

為此, 本次工作以雷州紅樹林保護(hù)區(qū)秋茄的天然林和人工林為研究對(duì)象(移栽時(shí)間大于 25年), 通過 16S高通量測序和 OTU(Operational Taxonomic Units, 操作分類單元)分析法對(duì)這兩種生境下的根際及外周土壤中的細(xì)菌和古菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了比較,旨在認(rèn)識(shí)不同紅樹林土壤微環(huán)境下的微生物群落組成, 為評(píng)估修復(fù)效果、認(rèn)識(shí)植物根際群落的自然演化進(jìn)程提供科學(xué)認(rèn)識(shí)。

2 材料與方法

2.1 樣地介紹

采樣地點(diǎn)位于中國廣東省雷州市附城鎮(zhèn)海岸帶芙蓉村東北部(110°09′46″E, 20°56′26″N)(圖 1), 該樣地年平均氣溫為22.9 ℃, 最高氣溫出現(xiàn)在7月(28.4 ℃),最低氣溫出現(xiàn)在1月(15.5 ℃), 年降雨量為1711 mm。作為廣東省紅樹林面積最大的區(qū)域, 雷州半島自1991年以來成立了紅樹林保護(hù)區(qū), 該區(qū)一方面進(jìn)行野外現(xiàn)有資源的保護(hù), 另一方面也進(jìn)行紅樹林人工修復(fù)和增植, 形成了自然林和人工林共存的自然景觀[13]。

本次研究的紅樹植物為秋茄(Kandelia obovata)。采集的樣品為秋茄林的外周土壤和根際土壤。采樣點(diǎn)的環(huán)境參數(shù)為: 鹽度20.84‰—24.89‰, 溫度23.4—24.1 ℃, pH 6.71—6.86。

圖1 樣地地理位置及采樣點(diǎn)分布圖(a為總覽圖, b、c為放大圖)Fig.1 The map of the sampling sites (Picture a is the overview map; picture b & care the enlarged view)

2.2 樣品采集

根據(jù)采樣區(qū)紅樹林的分布情況, 2015年1月7日, 選擇秋茄天然林(Natural-, NA)和人工林(Transplant-, TP)進(jìn)行根際土壤和外周土壤的采集。根際土壤(Rhizosphere, 簡稱 R)的采集利用滅菌鏟小心挖取 3段同株植物根系, 抖落根表面的多余土壤, 小心裝入無菌樣品袋中。外周土壤(Surrounding-,簡稱S)的獲取則利用無菌采集器在同株植物周圍多點(diǎn)采樣混合裝入無菌樣品袋。每份樣品設(shè)三個(gè)重復(fù),置于冰盒于當(dāng)天帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行預(yù)處理。實(shí)驗(yàn)中將無紅樹生長區(qū)的基圍魚塘(Fish Pond, 簡稱 FP)土壤樣品作為非紅樹區(qū)的對(duì)照。所有采樣位點(diǎn)及標(biāo)記如圖1c所示。

2.3 樣品預(yù)處理

根際土壤的處理: 將天然林和人工林的秋茄根樣等量稱取后裝入滅菌的、預(yù)裝有無菌水的50 mL離心管中, 充分震蕩1 min, 超聲45 s, 交替三次, 使根際的土壤充分懸浮在無菌水中。隨后13000 r? min–1離心 20 min, 將懸浮的微生物通過離心力沉降, 收集沉淀用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。外周土壤的處理: 外周土壤于冰浴環(huán)境帶回實(shí)驗(yàn)室保存于–80℃冰箱, 用于環(huán)境DNA的提取和微生物多樣性分析。

2.4 環(huán)境DNA的提取

分別稱取等量(0.25 g)離心得到的根際土壤和外周土壤, 采用土壤專用 DNA提取試劑盒(MOBIO PowerSoil DNA Isolation Kit, USA)提取土壤樣品DNA, 提取過程參照試劑盒說明書進(jìn)行。

2.5 PCR擴(kuò)增與Miseq文庫制備

根據(jù) Illumina Miseq高通量測序要求, 在 16S V4-V5區(qū)設(shè)計(jì)引物。細(xì)菌擴(kuò)增引物為: 515F和926R (正向引物序列 5’-TCCCTACACGACGCTCTTCCG ATCT-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’, 反向引物序列(5’-GAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA- CCGTCAATTCMTTTGAGTTT-3’), 古菌擴(kuò)增引物為:Arch519F 和 Arch915R(正向引物序列 5’-CAGC CGCCGCGGTAA-3’, 反 向 引物序列 5’-GTGCTCC CCCGCCAATTCCT-3’)。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系為50 μL,其中 5×Buffer(10 μL), dNTP(10 mmol·L-1, 1 μL),Phusion 超保真 DNA 聚合酶(1 μL), 引物 1 μL(10 μmol·L-1), 模板(20—50 ng), ddH2O 補(bǔ)至 50 μL。反應(yīng)體系為94 ℃ 2.5 min; 94 ℃ 30 s, 56 ℃ 1.5 min, 72 ℃ 30 s,72 ℃ 2 min, 25個(gè)循環(huán); 10 ℃延伸。所用設(shè)備為: 擴(kuò)增用晶格T960智能梯度PCR儀, 膠回收使用AXYGEN公司的 AxyPrepDNA 凝膠回收試劑盒, PCR 產(chǎn)物濃度檢測采用微量熒光核酸定量儀Qubit 2.0進(jìn)行。

2.6 Miseq第二代測序及數(shù)據(jù)分析

高通量測序數(shù)據(jù)通過NGS Illumina MiSeq 2 ×300 bp平臺(tái)進(jìn)行(上海微基生物科技有限公司)。對(duì)得到的序列數(shù)據(jù)進(jìn)行優(yōu)化和序列比對(duì)之后再按照97%的相似度進(jìn)行 OTU的劃分、α多樣性分析、PCA分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建。分析軟件包括mothur V.1.33.3、PC-ORD、MEGAN、Excel、shannon-ace-table.pl及BioLinker的自編程序。進(jìn)化樹用Neighbor-joining的方法進(jìn)行構(gòu)建, 用Bootstrap(1000次重復(fù))進(jìn)行檢驗(yàn)。

OTU分析作為本次測序數(shù)據(jù)的分析基礎(chǔ), 其反應(yīng)的生物學(xué)意義在于: 研究系統(tǒng)發(fā)生學(xué)或群體遺傳學(xué)時(shí), 為了便于分析而給某一個(gè)分類單元(品系、種、屬等)設(shè)置的同一標(biāo)志。在生物信息分析中, 測序得到的每一條序列來自一個(gè)物種或一個(gè)菌株。在本研究的分析中, 取序列相似度97%進(jìn)行 OTU歸類, 其中細(xì)菌得到的OTU總數(shù)為5865個(gè), 古菌為1193個(gè)。

3 結(jié)果

3.1 各樣點(diǎn)細(xì)菌及古菌群落豐度及多樣性

本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了秋茄天然林、人工林的根際、外周土壤和基圍魚塘土壤的細(xì)菌及古菌 16S-rRNA基因文庫。經(jīng)去重復(fù)和去冗余獲得了30000條以上的有效序列, 保證了數(shù)據(jù)分析的有效性。根據(jù)OTU歸類的結(jié)果計(jì)算了多樣性指數(shù)(H)和物種豐富度指數(shù)(Schao)。結(jié)果表明: 各樣點(diǎn)細(xì)菌的多樣性和豐度均高于古菌; 天然林微生物多樣性指數(shù)和豐度均高于人工林, 非紅樹區(qū)的基圍魚塘兩項(xiàng)指標(biāo)都最低; 采自同一環(huán)境下的外周土壤的細(xì)菌多樣性高于根際, 豐度則是根際略高于外周(表1)。

3.2 天然林與人工林細(xì)菌、古菌的組成與結(jié)構(gòu)特征

表1 不同樣點(diǎn)土壤細(xì)菌/古菌16S rRNA基因文庫的多樣性指數(shù)Tab.1 Bacterial and archaea diversity index in rhizosphere soil and surrounding soil of different sample sites

從總體上看細(xì)菌在天然林和人工林主要由 27個(gè)門類的物種組成, 居前 5位的優(yōu)勢菌群為變形桿菌(Proteobacteria)、擬桿菌(Bacteroidetes)、綠彎菌(Chloroflexi)、酸桿菌(Acidobacteria)、浮霉菌(Planctomycetales), 其中變形桿菌(Proteobacteria)占絕對(duì)優(yōu)勢, 在所有樣點(diǎn)中所占比例均超過 50%, 最高達(dá)到70.4%(出現(xiàn)在人工林根際R-TP)(圖2A)。其它主要菌群如黏膠球形菌(Lentisphaerae)、梭桿菌(Fusobacteria)、硝化螺旋菌(Nitrospira)、芽單胞菌(Gemmatimonadetes)、藍(lán)細(xì)菌(Cyanobacteria)、脫鐵桿菌(Deferribacteres)、綠硫菌(Chlorobi)、放線菌(Actinobacteria)、螺旋體(Spirochaetae)、疣微菌(Verrucomicrobia)、厚壁菌(Firmicutes)、纖維桿菌(Fibrobacteres)、軟壁菌(Tenericutes)、異常-棲熱菌(Deinococcus-Thermus)和互養(yǎng)菌(Synergistetes)也在各樣點(diǎn)中檢出, 約占OTU總數(shù)的15%—5%。此外,一些低豐度物種(OTU tags＜1%)亦存在于紅樹土壤細(xì)菌家族中, 包括待分類的候選家族(Candidate division)OD1、OP3、OP8、OP10、OP11、WS3、TM7和 Elusimicrobia(Termite Group 1)等(圖 2B)。分析不同生境的細(xì)菌組成可以看出, 雖然小的波動(dòng)存在于天然林和人工林, 但兩者在總體的菌群組成上沒有顯著差異。值得注意的是, 占比最多的變形桿菌(Proteobacteria)在兩種環(huán)境下都是根際比外周豐富(圖 2A); 非紅樹區(qū)的基圍魚塘中的螺旋體(Spirochaetae)高于紅樹環(huán)境(圖2B)。

相比于細(xì)菌, 古菌的多樣性明顯偏低。所檢測到的古菌在門的水平上主要包括兩大門類—奇古菌門(Thaumarchaeota)和廣域古菌門(Euryarchaeota)。在綱的水平上如圖 3, 主要包括鹽桿菌(Halobacteria)、熱原體菌(Thermoplasmata)、甲烷微菌(Methanomicrobia)、甲烷桿菌(Methanobacteria)以及甲烷球菌(Methanococci)。其中, 鹽桿菌為絕對(duì)優(yōu)勢菌,占比 19%—37%, 其次為熱原體菌(1.2%—8.5%),再次為甲烷菌(0.1%—2.1%), 未鑒定出的物種約50%以上。樣點(diǎn)間的比較發(fā)現(xiàn), 天然林與人工林的古菌群落組成趨同; 同一采樣環(huán)境中外周土壤與根際土壤的比較發(fā)現(xiàn)鹽桿菌偏愛于根際環(huán)境; 非紅樹區(qū)熱原體菌和甲烷微菌占更高比例, 與紅樹區(qū)樣品有較大差異(圖3)。

3.3 樣品中細(xì)菌和古菌群落組成的主成分分析

利用軟件mothur、PC-ORD進(jìn)行計(jì)算分別得到不同樣點(diǎn)細(xì)菌(圖 4)和古菌(圖 5)群落組成的主成分分析圖(PCA)。細(xì)菌群落組成的PCA圖(兩個(gè)主坐標(biāo)解釋 91.0%)顯示, 所有樣品大體歸為兩個(gè)群集, 第一個(gè)群集為根際土壤(R-)樣品(藍(lán)色圈), 第二個(gè)群集為外周土壤(S-)樣品(紅色圈)。同時(shí)該結(jié)果也可看到經(jīng)過長時(shí)間的修復(fù), 外周(S-, 林區(qū)內(nèi))土壤的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)趨同, 根際樣點(diǎn)(R-)相對(duì)分散, 而非紅樹區(qū)(FP)的魚塘樣點(diǎn)則偏離其它兩個(gè)環(huán)境。

圖2 門水平不同樣點(diǎn)主導(dǎo)細(xì)菌相對(duì)數(shù)量。圖A示占主導(dǎo)的前5類菌株, 圖B示其它類菌株。S表示外周菌, R表示根際菌, NA為天然林, TP為人工林, FP為基圍魚塘.Fig.2 The relative abundance of the dominant bacterial phylum in different samples.A: top five dominated bacteria, B:other species.S-: surrounding, R-: rhizosphere, NA: natural, TP: transplant, FP: fish pond

古菌群落的PCA圖(圖5)顯示(兩個(gè)主坐標(biāo)解釋70.5%), 所分析的樣品可聚為三個(gè)群集, 第一個(gè)群集為基圍魚塘(FP)土壤樣品(藍(lán)色圈), 第二個(gè)群集為天然林(NA)根際和外周土壤樣品(紅色圈), 第三個(gè)群集為人工林(TP)根際和外周土壤樣品(綠圈)。該結(jié)果表明古菌群落結(jié)構(gòu)受不同的土壤環(huán)境(NA, TP, FP)影響較大, 而同一環(huán)境下根際(R-)和外周(S-)樣品的古菌群落組成較為接近。

3.4 細(xì)菌及古菌系統(tǒng)發(fā)育分析

為進(jìn)一步了解樣品中微生物的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)地位, 繪制了主要細(xì)菌(圖6)和古菌(圖7)的系統(tǒng)進(jìn)化樹。從進(jìn)化樹的結(jié)果可以看出, 細(xì)菌和古菌分屬17個(gè)門和 3個(gè)門類, 細(xì)菌中占主導(dǎo)地位的變形桿菌(Proteobacteria)構(gòu)成第一大分支, 包括 α-, β-, γ-,δ-和 ε-亞族。其次擬桿菌(Bacteroidetes)和酸桿菌(Actinobacteria)作為相對(duì)優(yōu)勢菌構(gòu)成第二和第三大分支。古菌在進(jìn)化關(guān)系上則主要分成兩支, 即鹽桿菌(Halobacteria)家族和甲烷菌家族—甲烷微菌(Methanomicrobia)、甲烷桿菌(Methanobacteria)、甲烷球菌(Methanococci), 這兩大類群在古菌中占主導(dǎo)可能與紅樹植物的泌鹽特性和土壤中甲烷富集能力有關(guān)。

圖3 不同樣點(diǎn)古菌群落(綱分類水平)的結(jié)構(gòu)組成。R-根際菌, S-外周菌, NA-天然林, TP-人工林, FP-基圍魚塘。Fig.3 The relative abundance of the dominant archaea in different samples at class level.R-: rhizosphere, S-:surrounding, NA: natural, TP: transplant, FP: fish pond

圖4 不同樣點(diǎn)細(xì)菌群落組成的主成分分析。R-根際菌, S-外周菌, NA-天然林, TP-人工林, FP-基圍魚塘。Fig.4 PCA plot for bacterial community structure of all samples.R-: rhizosphere, S-: surrounding, NA: natural, TP:transplant, FP: fish pond; 1, 2 are two repeated samples.

圖5 不同樣點(diǎn)古菌群落組成的主成分分析。R-根際菌, S-外周菌, NA-天然林, TP-人工林, FP-基圍魚塘。Fig.5 PCA plot for archaea community structure in all samples.R-: rhizosphere, S-: surrounding, NA: natural, TP:transplant, FP: fish pond; 1, 2 are two repeated samples.

4 討論

4.1 根際和非根際土壤中微生物組成差異及原因

根際的概念最先由德國微生物學(xué)家 Lorenz Hiltne提出, 是指在根系周圍受根系生長影響的土體范圍,包括根際土壤和外周土壤[14]。在植物中針對(duì)根際微生物和外周微生物的組成差異進(jìn)行了不少研究, 包括蘆葦[10]、濕地紅樹[15]以及小麥(野生植株與種植植株)[16]等。這些實(shí)驗(yàn)證實(shí)了根際的細(xì)菌有較高的多樣性, 體現(xiàn)明顯的根際效應(yīng)。形成這一特征的原因可能有: 一是植物光合作用產(chǎn)生的氧通過植物組織輸送到根部, 使得根際周圍的氧氣比外周土壤的豐富,增加了根部環(huán)境對(duì)一些細(xì)菌(尤其是好氧菌)的選擇性; 二是根際分泌物為微生物提供了營養(yǎng)和能量來源, 從而增加了微生物類群對(duì)根的趨向性[17]。此外,Srensen[18]從生態(tài)位(Niche)的角度也給出了解釋,他認(rèn)為植物的根際創(chuàng)造了一個(gè)有別于其它土壤的微生境(microhabitat), 該環(huán)境為部分微生物提供了生態(tài)位平臺(tái), 使得它們具有了競爭優(yōu)勢而得以大量繁殖, 成為優(yōu)勢類群, 從而使得物種的組成多樣性減少。本次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了Srensen的觀點(diǎn), 表1中, 同樣的環(huán)境條件下, 土壤的細(xì)菌多樣性高于根際(S-NA:8.4345＞R-NA: 7.9625; S-TP: 8.1505＞R-TP: 7.45)。從PCA的分布上(圖4)可以看出, 外周土壤微生物的分布相對(duì)集中, 而根際微生物的分布則相對(duì)分散, 這說明根際環(huán)境的種群結(jié)構(gòu)受到植物的影響較大, 體現(xiàn)了根際效應(yīng)[19]。除了結(jié)構(gòu)的多樣性, 對(duì)豐度的探討也是關(guān)注的熱點(diǎn)。Tang等[20]通過16S rRNA技術(shù)發(fā)現(xiàn)紅樹植物老鼠簕(Acanthus ilicifolius)根際微生物具有更高的豐度指數(shù), 與外周土壤相比體現(xiàn)明顯差異(P＜0.05)。本次實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)根際土壤的微生物量(Biomass)略高于外周土壤, 但未達(dá)到顯著水平(表1), 造成這一差異的原因相對(duì)多樣, 可能與植株個(gè)體、根系分泌物成分以及土壤類別有關(guān)[21]。最近Nature發(fā)文深入證實(shí)了根系微生物受土壤類型和植物基因型的影響, 且為根系微生物的定植找到了新的線索[22], 該研究進(jìn)一步驗(yàn)證了植物種類能影響根際微生物的數(shù)量和種類, 而且從分子層面驗(yàn)證了“植物-土壤-細(xì)菌”交互選擇、交互影響的復(fù)雜關(guān)系。

圖6 紅樹土壤主要細(xì)菌類群的系統(tǒng)發(fā)育樹。R-根際菌, S-外周菌, NA-天然林, TP-人工林, FP-基圍魚塘。Fig.6 Phylogenetic tree of bacterial at mangrove plant.R-: rhizosphere, S-: surrounding, NA: natural, TP: transplant, FP:fish pond

圖7 紅樹土壤古菌系統(tǒng)發(fā)育樹。R-根際菌, S-外周菌, NA-天然林, TP-人工林, FP-基圍魚塘Fig.7 Phylogenetic tree of archaeal at mangrove plant.R : rhizosphere, S-: surrounding, NA: natural, TP: transplant, FP:fish pond

對(duì)于一些主導(dǎo)性微生物, 其在根際高于外周土壤的原因可能是基于生態(tài)功能的需要。植物基于存活、抗逆以及對(duì)營養(yǎng)的需求會(huì)使特征性的菌群在根際富集, 如根瘤菌、伯克霍爾德氏菌、厚壁菌、硝化細(xì)菌等, 以滿足植物對(duì)氮、碳、病原抵抗和纖維素降解等的需要[23]。本次結(jié)果中我們發(fā)現(xiàn)綠硫菌(Chlorochromatium、脫鐵菌(Deferribacteraceae)、纖維桿菌(Fibrobacter)的OTU片段數(shù)在根際部分要高于土壤。依據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)(第八版)》的注解[24], 這些菌群的功能主要是氧化硫(提供電子供體進(jìn)行厭氧條件下的光合作用)、化能異養(yǎng)利用碳源、以及降解纖維素等。這些特性對(duì)幫助秋茄根系獲取能量有重要意義, 同時(shí)也進(jìn)一步印證了根系對(duì)微生物具有選擇性的理論[25]。Tarafdar等[26]用數(shù)學(xué)模型模擬了根系分泌物與根際微生物群落的關(guān)系, 證實(shí)根際主要微生物的數(shù)量和種類與可溶性碳的分布距離有關(guān)。因此, 根際和非根際主導(dǎo)性微生物的組成差異, 其驅(qū)動(dòng)力除了源自微生物個(gè)體的自身功能,根系分泌物也有一定的介導(dǎo)作用。

值得注意的是, 與細(xì)菌相比, 古菌的多樣性有些許不同。本次實(shí)驗(yàn)僅發(fā)現(xiàn)除了在外周土壤中的 OTU數(shù)量比根際高外, 其它古菌成員在根際和非根際區(qū)差別不大, 未體現(xiàn)明顯的根際效應(yīng), 這或許與古菌的生態(tài)功能、環(huán)境響應(yīng)力、以及種群基數(shù)有關(guān)[27]。

4.2 天然林與人工林土壤微生物的組成差異

從總體的微生物組成來看, 本次研究中發(fā)現(xiàn)兩種林地中占優(yōu)勢地位的細(xì)菌主要包括變形桿菌(Proteobacteria)、擬桿菌(Bacteroidetes)、酸桿菌(Acidobacteria)、綠彎菌(Chloroflexi)、脫鐵桿菌(Deferribacteres)、浮霉菌(Planctomycetales)、放線菌(Actinobacteria)、厚壁菌(Firmicutes)、疣微菌(Verrucomicrobia)以及硝化螺旋菌(Nitrospira)(圖 1),這與以往研究結(jié)果類似[28]。比較天然林與人工林的細(xì)菌差異發(fā)現(xiàn), 優(yōu)勢菌群未見顯著差異。值得注意的是, 天然林根際硝化螺旋菌(Nitrospira)的比例(0.66%—0.80%)約為人工林(0.31%—0.39%)的兩倍,其原因可能是天然林積累了更多的凋落物, 需要更多的硝化菌行使N源轉(zhuǎn)化功能。Thoms等[29]也指出凋落物的差異使得輸入到土壤中的有機(jī)質(zhì)存在差異, 進(jìn)而影響微生物的組成, 其中影響最大的就包括具有分解有機(jī)物能力的硝化細(xì)菌(桿菌、球菌和螺旋菌)。對(duì)于非紅樹區(qū)的基圍魚塘(圖2、3)存在一些與紅樹區(qū)的些許差異, 包括: 擁有更高比例的藍(lán)細(xì)菌(Cyanobacteria)和甲烷微菌(Methanomicrobium); 以及特征性的出現(xiàn)兩類革蘭氏陰性菌—互養(yǎng)菌(Synergistetes)和梭桿菌(Fusobacteria)。形成這一差異的原因可能是源自魚塘的底泥特征(NH4+的富余和偏厭氧環(huán)境), 氨是甲烷微菌的唯一氮源, 致使甲烷微菌在這一環(huán)境中的數(shù)量居多[30]; 而互養(yǎng)菌(Synergistetes)和梭桿菌(Fusobacteria)是低氧環(huán)境中的典型代表, 因而兩者在魚塘環(huán)境中常見。此外, 魚塘環(huán)境受人類活動(dòng)影響較大, 外界因素的擾動(dòng)也是驅(qū)動(dòng)微生物組成發(fā)生改變的原因之一[29]。

另一個(gè)值得我們注意的是, 植株根際微生物的組成與修復(fù)林齡有關(guān)。楊瓊等[11]證實(shí)人工修復(fù)林在1年林齡與天然林有顯著差異, 當(dāng)年份延長至7年時(shí)兩者差異最小; 而隨著時(shí)間的進(jìn)一步推演, 至14年時(shí)又可觀察到較大差異。造成這一現(xiàn)象的原因是種植初期由于紅樹進(jìn)入新環(huán)境, 微生物的適應(yīng)、演變和穩(wěn)定需要一個(gè)過程; 而隨著時(shí)間的進(jìn)一步延伸,植株葉片的生長阻擋了陽光對(duì)土壤的照射, 影響了土壤對(duì)光照的吸收; 此外, 葉片凋落物的增加和有機(jī)養(yǎng)分的積累也成為了導(dǎo)致細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)變化的推手[29]。這一生態(tài)過程受多個(gè)參數(shù)影響, 包括微生物生物量碳的多寡、呼吸強(qiáng)度的強(qiáng)弱、土壤有機(jī)質(zhì)的豐度等。本實(shí)驗(yàn)室前期也通過分析不同修復(fù)年限(4年、8年和 10年)根際微生物的小片段重復(fù)序列(Short Tandem Repeat, STR), 發(fā)現(xiàn)三個(gè)不同修復(fù)時(shí)間的紅樹林修復(fù)區(qū)和天然林存在差異, 10年修復(fù)林更加接近原生紅樹林。這些結(jié)果表明修復(fù)區(qū)紅樹林的根際微生物群落會(huì)逐步朝著原生紅樹林根際微生物群落結(jié)構(gòu)演替, 但這一過程并非簡單的加和式線性變化, 而是存在復(fù)雜性和年份突變性的可能[12]。本次實(shí)驗(yàn)中人工林的種植時(shí)間在25年以上, 未呈現(xiàn)人工林與天然林的顯著差異, 證明在更長的時(shí)間尺度上微生物的組成具有趨同效應(yīng), 這或許是共生系統(tǒng)在經(jīng)歷自然選擇過程中(營養(yǎng)獲取、生態(tài)位競爭、自身生存), 應(yīng)對(duì)環(huán)境變化、維持生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性的適應(yīng)性表現(xiàn)。如果能獲得更長時(shí)間的數(shù)據(jù), 則有望根據(jù)微生物的區(qū)系組成評(píng)估移栽的效果。當(dāng)然, 以微生物組成作為 Biomarker來評(píng)判移植的效果還需要結(jié)合植被種類、氣候變化、林地環(huán)境等多種因素做綜合考慮, 這些系統(tǒng)數(shù)據(jù)的獲得還有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究和信息收集。

5 結(jié)論

基于群落的結(jié)構(gòu)多樣性和功能多樣性, 微生物在與環(huán)境交互的歷程中經(jīng)歷了“適應(yīng)-發(fā)展-成熟”的過程, 會(huì)逐漸朝著穩(wěn)定的方向發(fā)展。本次實(shí)驗(yàn)證實(shí)了經(jīng)長期修復(fù)(25林齡)的人工林, 其根部微生物的組成會(huì)沿時(shí)間尺度與自然林趨同, 但存在少量特異性和差異性的物種。這種差異與“植物-微生物”共生體應(yīng)對(duì)全球變化和區(qū)域環(huán)境的改變有關(guān), 同時(shí)也是適應(yīng)環(huán)境和協(xié)同進(jìn)化的需要?？偨Y(jié)本次實(shí)驗(yàn)和已有文獻(xiàn)的報(bào)道, 顯示出紅樹植物在修復(fù)條件下其微生物種群差異抑或呈現(xiàn)一個(gè)原則: 即“中心明確、邊緣模糊”。

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Soil microbial community structure in natural and transplanted mangrove(Kandelia obovata) forests

YIN Mengqing1,2, FENG Jianxiang2, HUANG Xiaofang2, CAI Zhonghua2, LIN Guanghui1,2*, ZHOU Jin2,*
1.Center for Earth System Science,Tsinghua University,Beijing100084,China2.Division of Ocean Science and Technology,Graduate School at Shenzhen,Tsinghua University,Shenzhen518055,China

In order to understand the potential ecological adaptation of mangrove plants, the soil and rhizosphere microbial communities were characterized from different mangrove habitats.Samples were collected from mangrove wetlands on the East-Coast of the Leizhou Peninsula, Guangdong Province, China.Environmental genomics approaches, including highthroughput sequencing and OTU analysis, were used to assess the composition and structure of bacteria and archaea in the rhizosphere and surrounding soil of transplanted and native (non-transplanted) plants.The results showed that 27 different bacterial phyla were identified in the soil of transplants and native plants.The dominant bacterial groups were Proteobacteria,Chloroflexi, Acidobacteria, Bacteroidetes, and Deferribacteres.And the dominant archaeal groups were Halobacteria,Thermoplasmata, Methanomicrobia, Methanobacteria, and Methanococci.The largest proportion of the archaeal community was comprised of Halobacteria (70%-90%).The Shannon–Wiener (H) and richness indices (Schao) indicated that the diversity of bacteria was higher than that of archaea and that the biodiversity of the natural samples was larger than that of transplants.Principal component analysis (PCA) showed that the bacteria clustered into two categories: surrounding soil and rhizosphere samples, while the archaea were divided into three groups according their habitats: natural, transplant, and non-mangrove soil samples (from fishponds).This work showed that after several years of ecological restoration, the bacterial communities of the transplanted mangrove samples were similar to those of natural plants.For the rhizosphere microbes, the bacterial community structure was related to the rhizosphere environment and exhibited the rhizosphere-effect to some extent.However, the archaeal community structure appeared to be significantly regulated and shaped by environmental parameters, such as pH, temperature and salinity, etc.

natural forest; transplanted forest; microbial community structure; rhizosphere-effect; archaea;Kandelia obovata

10.14108/j.cnki.1008-8873.2017.05.001

Q938.1

A

1008-8873(2017)05-001-10

殷萌清, 馮建祥, 黃小芳, 等.天然及人工紅樹林土壤微生物群落結(jié)構(gòu)分析[J].生態(tài)科學(xué), 2017, 36(5): 1-10.

YIN Mengqing, FENG Jianxiang, HUANG Xiaofang, et al.Soil microbial community structure in natural and transplanted mangrove(Kandelia obovata) forests[J].Ecological Science, 2017, 36(5): 1-10.

2015-12-23;

2016-01-27

國家海洋局公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201305021); 廣東省海洋漁業(yè)科技與產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項(xiàng)計(jì)劃(A201503D07); 深圳市科技創(chuàng)新委員會(huì)基礎(chǔ)研究計(jì)劃(JCYJ20150529164918736)

殷萌清(1992—), 女, 陜西人, 碩士研究生, 研究方向紅樹林微生物生態(tài)學(xué), E-mail: ymq13@mails.tsinghua.edu.cn

*通信作者:周進(jìn)(1977—), 男, 副教授, 博士, 從事微生物生態(tài)學(xué)研究, E-mail: zhou.jin@sz.tsinghua.edu.cn林光輝(1962—), 男, 教授, 博導(dǎo), 從事濕地生態(tài)學(xué)研究, E-mail: lingh@mail.tsinghua.edu.cn