曹煜成, 李卓佳, 胡曉娟, 徐煜, 孫志偉, 李奕雯, 文國樑,*

1.中國水產(chǎn)科學研究院南海水產(chǎn)研究所, 農(nóng)業(yè)部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點實驗室, 廣東省漁業(yè)生態(tài)環(huán)境重點實驗室, 廣州510300 2.廣東海洋與漁業(yè)出版?zhèn)髅接邢薰? 廣州 510220

磷濃度與氮磷比對蛋白核小球藻氮磷吸收效應的影響

曹煜成1, 李卓佳1, 胡曉娟1, 徐煜1, 孫志偉1, 李奕雯2, 文國樑1,*

1.中國水產(chǎn)科學研究院南海水產(chǎn)研究所, 農(nóng)業(yè)部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點實驗室, 廣東省漁業(yè)生態(tài)環(huán)境重點實驗室, 廣州510300 2.廣東海洋與漁業(yè)出版?zhèn)髅接邢薰? 廣州 510220

為明確在不同磷濃度及氮磷比(N/P)的協(xié)同影響下蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa) 的生長和氮磷吸收特性, 文章將微藻培養(yǎng)液中的磷酸鹽濃度設為 0.50 mg·L–1、0.25 mg·L–1、0.05 mg·L–1, 并將 N/P 分別設為 32、16、8, 每2 d取樣測定藻細胞數(shù)量和氮磷指標, 實驗設9個組, 每組3平行, 周期12 d。結(jié)果顯示, 在低氮磷濃度組藻細胞數(shù)量明顯低于高氮磷組(P＜0.05), 氮磷濃度對藻細胞生長的影響遠大于N/P(P＜0.05); 在高氮磷濃度組, 當N/P低于8時, 藻細胞生長受到限制, 當其高于16時, N/P不再成為限制性因子; 不同N/P下初始氮磷濃度的影響大于N/P。由藻細胞與氮磷指標的多元回歸分析發(fā)現(xiàn), 藻細胞數(shù)量與氮磷濃度, 以及不同取樣時間的氮磷濃度等多個因子存在顯著線性關(guān)系, 其中初始氮磷濃度影響較大。上述結(jié)果表明, 蛋白核小球藻數(shù)量與氮磷的消耗呈正相關(guān), 以期僅通過調(diào)整 N/P的方式影響其對水環(huán)境中氮磷的吸收, 恐難達到良好效果。

磷; 氮磷比; 蛋白核小球藻; 吸收效應

1 前言

蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)是養(yǎng)殖池塘微藻群落中的常見優(yōu)勢種[1-4], 它不僅可作為養(yǎng)殖生物幼體和浮游動物的天然餌料, 還能起到穩(wěn)定和優(yōu)化水體微藻群落結(jié)構(gòu), 快速吸收轉(zhuǎn)化水體氨氮、亞硝酸鹽等有毒有害物質(zhì)[5,6], 促進養(yǎng)殖生物健康生長的良好效果[7]。通常養(yǎng)殖水體中的氮磷富營養(yǎng)程度較高[5,8], 微藻作為水體生態(tài)系統(tǒng)中的生產(chǎn)者, 可將之進行高效吸收利用, 實現(xiàn)養(yǎng)殖水質(zhì)的凈化[9]。有研究表明, 不同種類的微藻對氮磷的營養(yǎng)要求存在較大差異[10-18], 并且不同的光照和溫度條件下其氮磷需求量也差別巨大[19,20]。其實, 氮磷濃度固然與微藻生長密切相關(guān), 氮磷間的數(shù)量比例對微藻亦同樣重要[21], 以往的研究大多或關(guān)注微藻的氮磷數(shù)量需求[22,23], 或是僅關(guān)注氮磷比對微藻生長的影響[24],而自然環(huán)境下以上兩種因素均客觀存在, 并對微藻生長共同產(chǎn)生影響, 僅進行單因子實驗無法科學闡釋究竟何種氮磷因子對微藻自然狀態(tài)的影響貢獻更大, 因此, 有必要將氮磷營養(yǎng)濃度和比例相結(jié)合,并以統(tǒng)計學分析方法評估兩者的協(xié)同影響效應。該實驗根據(jù)對蝦養(yǎng)殖池塘磷濃度水平的動態(tài)特征[25],選取三個磷濃度水平為基礎, 明確不同氮磷濃度和氮磷比條件下, 蛋白核小球藻的生長及其對氮磷的吸收效應, 并以多元回歸分析法研究藻細胞數(shù)量(YCell)與初始氮濃度(XN0)、初始磷濃度(XP0)、初始氮磷比(XN/P0)、生長時間(XT), 以及不同取樣時間的氮濃度(XNv)、磷濃度(XPv)、氮磷比(XN/Pv)之間的相關(guān)性, 建立回歸方程。以期為今后進一步探索構(gòu)建適宜養(yǎng)殖池塘有益微藻群落的氮磷營養(yǎng)調(diào)控策略提供基礎參考依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 材料

蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)分離自廣東省汕尾市紅海灣的對蝦集約化養(yǎng)殖池塘。小球藻的基礎培養(yǎng)基為 BG11液體培養(yǎng)基[10,11], 根據(jù)實驗需求利用分析純的硝酸銨(NH4NO3)、磷酸二氫鉀(KH2PO4)調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中的氮磷濃度水平和氮磷比。

2.2 試驗設計

根據(jù)集約化對蝦養(yǎng)殖池塘生產(chǎn)過程中水體活性磷酸鹽的 0.01 mg·L–1—0.50 mg·L–1的變化范圍[25],分別將培養(yǎng)基中的磷酸鹽濃度設為 0.05 mg·L–1、0.25 mg·L–1、0.50 mg·L–1, 并以磷酸鹽濃度為基礎按質(zhì)量比的關(guān)系設置3個氮磷比(N/P)水平, 即32、16、8。由此將實驗組分為 9個組, 分別為：C1(P 0.50 mg·L–1, N/P 32)、C2(P 0.50 mg·L–1, N/P 16)、C3(P 0.50 mg·L–1, N/P 8)、C4(P 0.25 mg·L–1, N/P 32)、C5(P 0.25 mg·L–1, N/P 16)、C6(P 0.25 mg·L–1, N/P 8)、C7(P 0.05 mg·L–1, N/P 32)、C8(P 0.05 mg·L–1, N/P 16)、C9(P 0.05 mg·L–1, N/P 8)。每組均設三個平行,實驗周期12 d。

2.3 小球藻的培養(yǎng)

小球藻藻種經(jīng)過擴大培養(yǎng)后, 藻液于6300 g、4℃下離心6 min, 藻沉淀用無菌雙蒸水反復洗滌 3次,最后以蒸餾水重懸藻沉淀, 取500 μL在顯微鏡下檢查藻細胞情況并準確計數(shù)。根據(jù)藻原液計數(shù)結(jié)果,按 2.4×105cell·mL–1濃度將藻細胞接種至不同實驗組的培養(yǎng)瓶, 培養(yǎng)液鹽度為6。將培養(yǎng)瓶置于光照培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng), 溫度25℃, 光暗比12 h :12 h, 光照強度4000—5000 lx。每6 h對各培養(yǎng)瓶進行手搖振蕩, 避免藻細胞貼壁生長。

2.4 樣品采集與檢測

實驗過程中每2 d取樣一次進行小球藻數(shù)量和氮磷水質(zhì)指標的測定。藻樣加甲醛固定, 在顯微鏡下用血球計數(shù)板準確計數(shù)小球藻細胞數(shù)量; 水樣按照國家標準方法[26], 以萘乙二胺分光光度法測定亞硝酸鹽(NO2–-N), 紫外分光光度法測定硝酸鹽(NO3–-N), 次溴酸鹽法測定氨氮(NH3-N), 磷鉬藍比色法測定磷酸鹽(PO43–-P)。考慮到無機氮在水體環(huán)境中具有亞硝酸鹽氮(NO3–-N)、硝酸鹽(NO2–-N)、氨氮(NH3-N)等多種存在形式, 因此實驗過程中以溶解態(tài)總無機氮(Total dissolved inorganic nitrogen,DIN)形式分析小球藻對氮的吸收效率。即DIN濃度為NO3–-N、NO2–-N、NH3-N三者濃度之和。

2.5 數(shù)據(jù)處理

小球藻的比生長速率按公式μ= (lnNi+1- lnNi) /(t i+1-ti) 計算, 其中,t i+1和ti表示兩次連續(xù)取樣的時刻點,N i+1和N i分別是微藻在t i+1和ti時刻點的藻細胞數(shù)量。氮磷的吸收速率按公式△C=(C i+1-Ci)/ (T i+1-Ti) 計算, 其中,t i+1和ti表示兩次連續(xù)取樣的時刻點,C i+1表示T i+1時刻點的氮磷營養(yǎng)鹽濃度,Ci表示Ti時刻點的營養(yǎng)鹽濃度。所得數(shù)據(jù)以單因素和雙因素方差分析法(ANOVA)檢驗不同實驗組之間的顯著性差異, 顯著性水平設置為P＜0.05。

將小球藻細胞數(shù)量作為因變量(YCell); 初始氮濃度(XN0)、初始磷濃度(XP0)、初始氮磷比(XN/P0)、生長時間(XT), 以及不同取樣時間的氮濃度(XNv)、磷濃度(XPv)、氮磷比(XN/Pv)等作為自變量, 進行多元回歸分析, 建立回歸方程。

3 結(jié)果與分析

3.1 蛋白核小球藻的生長

C1和C2組的蛋白核小球藻數(shù)量呈持續(xù)升高的趨勢, 實驗結(jié)束時平均達到 1.19×107cell·mL–1, 顯著高于其他各組(P＜0.05); C3、C4、C5組在第6—8 d時達到最高值, 平均為 4.80×106cell·mL–1數(shù)量水平, 隨后降低至 3.80×106cell·mL–1; C7、C8、C9 三組的生長曲線形態(tài)相似, 數(shù)量增長幅度較小, 平均僅為 1.52×106cell·mL–1, 遠低于C1 和 C2 組(圖 1)。就各組的小球藻日平均增長率對比而言, C1和C2組亦顯著高于其他各組(P＜0.05), 而C8和C9組仍為最低(表1)。

圖1 蛋白核小球藻的數(shù)量變化Fig.1 The quantity variation of Chlorella pyrenoidosa

3.2 培養(yǎng)液中無機氮的變化

培養(yǎng)液中的DIN濃度總體呈現(xiàn)不斷降低的趨勢,除C1組外其余各組在第4—6 d時DIN基本耗盡, C1組到12 d時DIN才降低至0 mg·L–1左右。其中初始氮營養(yǎng)濃度越低的試驗組其氮耗盡的時間越短,C9組在第2 d時DIN即降至0 mg·L–1, C5組至C8組所需時間則為4 d(圖2)。其次, 各組硝酸鹽、氨氮和 DIN的最大日吸收量存在一定的差異, 總體而言, 初始氮營養(yǎng)濃度越高, 蛋白核小球藻對硝酸鹽、氨氮和 DIN的最大日吸收量也就越高, 反之亦然(圖3)。而從培養(yǎng)液中氨氮和硝酸鹽完全消耗的速率分析, C1組的氨氮和硝酸鹽分別于第8 d和12 d時降至0 mg·L–1, C2組分別為第4 d和12 d,C4組第6 d時兩者均降至0 mg·L–1, C3組、C5組、C6組、C7組所需時間為4 d, C9組為2 d。由此可見, 該研究中就小球藻對氮營養(yǎng)吸收的影響因子而言, 氮濃度的影響最大, 其次為氮的化學形式,最后為氮磷比。

表1 蛋白核小球藻的藻細胞數(shù)量峰值、最大比增長率及平均增長率Tab.1 The maximum quantity, maximum growth rate and daily average growth rate of Chlorella pyrenoidosa

圖2 總無機氮的濃度變化Fig.2 The variation of DIN concentration

圖3 不同氮素的最大日吸收量Fig.3 The maximum nitrogen daily absorption of cell

以上結(jié)果顯示, 由于低氮磷營養(yǎng)的影響 C7、C8、C9三組的藻細胞生長均受到了明顯的限制, 可見, 氮磷營養(yǎng)水平的高低對蛋白核小球藻生長的影響程度遠大于N/P; 再者, C1和C2組的藻細胞數(shù)量并無顯著性差異(P＞0.05), C3組的藻細胞數(shù)量在實驗結(jié)束時明顯低于C1和C2組(P＜0.05), 這表明即使在氮磷富營養(yǎng)條件下, N/P低于8時小球藻的生長仍會受到一定程度的限制, 而當其高于16時N/P不再成為限制性因子。

3.3 培養(yǎng)液中磷的變化

培養(yǎng)液中的磷酸鹽濃度總體呈現(xiàn)不斷降低的趨勢, 第2—8 d時各組的磷酸鹽多降低至0 mg·L–1左右(圖 4)。按起始磷濃度 0.5 mg·L–1、0.25 mg·L–1、0.05 mg·L–1三個水平分析, 磷的變化曲線基本也分為3個聚類, 其中, 磷濃度較高的C1、C2、C3組的變化趨勢基本一致, 培養(yǎng)液中的磷于第8 d時降至 0 mg·L–1左右; 另外 C4、C5、C6 組為一類, C7、C8、C9組為一類, 前者磷被基本完全消耗的時間為4 d, 后者為2 d(圖4)?？梢? 水體環(huán)境中起始磷濃度對微藻的營養(yǎng)吸收速率影響較大。而從其最大日吸收量分析, C1—C6組之間無顯著性差異(P＞0.05), C7、C8、C9三組則顯著低于前六組(P＜0.05), 但 C7、C8、C9三組之間無明顯差異(P＞0.05)。綜合以上結(jié)果, 該研究中就小球藻對磷酸鹽吸收的影響而言, 磷濃度的影響大于氮磷比。

3.4 小球藻生長與氮磷營養(yǎng)指標的相關(guān)性分析

將藻細胞數(shù)量作為因變量(YCell); 初始氮濃度(XN0)、初始磷濃度(XP0)、初始氮磷比(XN/P0)、生長時間(XT), 以及不同取樣時間的氮濃度(XNv)、磷濃度(XPv)、氮磷比(XN/Pv)等作為因變量, 進行多元回歸分析, 獲得以下回歸方程。該方程的相關(guān)系數(shù)R=0.884,判斷系數(shù)R2=0.781, 統(tǒng)計量F=27.964, 相伴概率值P＜0.001, 表明方程中的多個自變量與因變量藻細胞數(shù)之間存在線性回歸關(guān)系。

圖4 磷酸鹽的濃度變化Fig.4 The variation of phosphate concentration

圖5 磷酸鹽的最大日吸收量Fig.5 The maximum phosphate daily absorption of cell

YCell=138.801XN0+356.516XP0-2.433XN/P0+25.397XT–165.980XNv-119.233XPv+0.649XN/PV-46.692

此外, 結(jié)果還顯示, 就藻細胞數(shù)量與各因子的相關(guān)系數(shù)而言, 生長時間(XT)的相關(guān)性最大, 然后依次為初始氮濃度(XN0)、初始磷濃度(XP0)、不同取樣時間的氮磷比(XN/Pv), 其相關(guān)系數(shù)分別為 0.618、0.462、0.448、0.443。

4 討論

有學者指出當河流水體的磷高于 0.2 mg·L–1容易造成微藻大量生長甚至造成水華[27]。養(yǎng)殖池塘水體的氮磷富營養(yǎng)化更為明顯, 總體隨養(yǎng)殖時間的延長, 呈現(xiàn)不同程度的富營養(yǎng)化狀況, 有報道顯示對蝦養(yǎng)殖水體環(huán)境中的氮磷總輸入為87.8%和 97.9%,而通過養(yǎng)殖生物的氮磷總輸出為23.4%和10.5%, 底泥沉積輸出 50.5%和 80%[28], 其中大部分的氮磷營養(yǎng)積存于環(huán)境中。在集約化對蝦高密度養(yǎng)殖池塘水體的無機氮濃度變化范圍為 0.375—4.261 mg·L–1,磷酸鹽為 0.033—0.514 mg·L–1, 氮磷比為 2—45[28]。而且無機氮中的氨氮和亞硝酸鹽對養(yǎng)殖生物也具有較強的毒害作用, 誘發(fā)養(yǎng)殖病害導致嚴重的經(jīng)濟損失[29]?？梢? 如何有效運用菌藻生物技術(shù), 促進水環(huán)境中的物質(zhì)循環(huán), 實現(xiàn)水體生態(tài)系統(tǒng)的高效自我凈化, 具有重要的現(xiàn)實意義[9]。本研究將水體環(huán)境中的初始氮磷濃度范圍分別設置為0.18—7.20 mg·L–1和0.05—0.50 mg·L–1, N/P 設為 8—32, 基本可反映自然水體的氮磷氮磷營養(yǎng)狀況, 具有良好的代表性。

水體環(huán)境中氮磷營養(yǎng)的濃度、化學存在形式、不同元素營養(yǎng)的數(shù)量比例均會對浮游微藻的數(shù)量和優(yōu)勢種組成產(chǎn)生巨大影響[30]。當?shù)貭I養(yǎng)供給不足時會影響微藻細胞氨基酸的合成, 使之生長停滯于靜止期[31,32]; 磷缺乏會降低微藻的光合效率和速率, 影響其光合作用的生理機能, 抑制藻細胞的生長與繁殖[33]。Plesnicar指出當水體中的氮達到 2.0 mg·L–1、磷 0.3 mg·L–1時, 有利于延長微藻的生長高峰期[34]; 黃翔鵠認為微綠球藻在氮磷濃度分別達到28.30 mg·L–1和2.076 mg·L–1時, 有利于藻細胞的生長[35]。本研究表明氮磷初始濃度與小球藻的生長關(guān)系密切, 高氮磷組的藻細胞增殖數(shù)量顯著高于其他組, 隨著氮磷的消耗藻細胞不斷升高,這與孟順龍等提出的在小球藻和魚腥藻純培養(yǎng)體系最大藻細胞數(shù)量均隨氮磷質(zhì)量濃度的增加而增加一致[24]。而江懷真等則認為氮磷對小球藻的影響有所區(qū)別, 增加氮濃度能提高小球藻生長速率, 磷卻無影響[36], 該結(jié)果可能與其采用單因子實驗設計, 未綜合考慮N/P的影響有關(guān)。通過科學地施加氮磷混合肥, 增加水體氮磷濃度可有效促進各種微藻的生長繁殖[37,38], 但同時也應考慮 N/P的影響。Alonso指出一般養(yǎng)殖水體的 N/P變動幅度較大, 其中集約化養(yǎng)殖池塘水體的N/P變動范圍為5.5—67.0, 半集約化養(yǎng)殖水體為1.1—61.0[39], 一般N/P值較高時有利于綠藻、硅藻的生長, 反之則利于促進藍藻的增殖。本研究結(jié)果表明在氮磷富營養(yǎng)條件下, N/P低于8時小球藻的生長仍會受到一定程度的限制, 而當其高于16時N/P不再產(chǎn)生影響, 這與上述觀點基本相同。對此, 有學者指出通過選擇性施肥, 定向調(diào)節(jié)水體氮磷比可有效控制藍藻的生長[23]。而 Wang等報道氮磷比對純培養(yǎng)的小球藻的生長沒有影響[40],這可能與其將磷濃度設置在0.025 mg·L–1的低水平,僅通過調(diào)節(jié)氮濃度設定不同氮磷比的設計有關(guān)。本研究結(jié)果顯示, 蛋白核小球藻與氮磷濃度, 以及不同取樣時間的氮磷濃度等多個因子均存在明顯線性關(guān)系, 且氮磷濃度對藻細胞的影響明顯大于N/P(P＜0.05)。所以, 在定向調(diào)控水體氮磷營養(yǎng)時既需要考慮氮磷的濃度高低情況, 還需適當控制其數(shù)量比例關(guān)系?；诒狙芯拷Y(jié)果而言, 建議在養(yǎng)殖過程中定期監(jiān)測水體溶解性氮磷營養(yǎng)鹽的動態(tài)變化,通過科學的人為干預將水體N/P設定在大于16的數(shù)量水平; 同時, 考慮到池塘中磷的輸出主要以底泥沉積吸附的方式為主, 水中磷酸鹽的濃度相對缺乏,而飼料中的氮輸入相對豐盈, 故而在養(yǎng)殖過程中可根據(jù)微藻生長狀況, 每7到12天定期使用解磷菌或適量添加水溶性磷肥提高水體磷營養(yǎng)的有效供給,從而為維持水體中微藻的良好生長提供有力的氮磷營養(yǎng)條件。

總體而言, 以往的報道多把氮磷濃度、氮磷比對微藻的影響進行獨立式研究, 以期通過單因子的營養(yǎng)需求分析闡釋究竟何種氮磷因子對微藻的影響貢獻更大, 這在一定程度上忽略了自然水體環(huán)境下,氮磷的濃度與比例其實均客觀影響著微藻的生長、群落結(jié)構(gòu)、優(yōu)勢種演替動態(tài)以及群落的生態(tài)功能等。所以, 研究過程中應充分考慮兩者的協(xié)同效應, 同時, 將氮磷營養(yǎng)消耗的動態(tài)變化特性亦納入分析過程, 才能獲得更為科學的結(jié)果。

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Effects of phosphorus concentration and nitrogen-phosphorus ratio on absorption of nitrogen and phosphorus byChlorella pyrenoidosa

CAO Yucheng1, LI Zhuojia1, HU Xiaojuan1, XU Yu1, SUN Zhiwei1, LI Yiwen2, WEN Guoliang1,*
1.South China Sea Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences, Key Laboratory of South China Sea Fishery Resources Exploitation and Utilization, Ministry of Agriculture, Key Laboratory of Fishery Ecology and Environment,Guangzhou510300,China2.Guangdong Ocean and Fishery Publishing Media Company Limited,Guangzhou510220,China

The study investigated the absorption characteristics of nitrogen (N) and phosphorus (P) byChlorella pyrenoidosaunder the synergistic effects of different nitrogen-phosphorus ratios (N/P) and concentrations of P. The P concentrations of microalgal culture media were 0.50 mg·L–1, 0.25 mg·L–1, 0.05 mg·L–1and the N/P ratios were 32, 16, 8, respectively. There were nine test groups with triplicate in each group, and the test was lasted for 12 days. The results showed that the quantity ofC. pyrenoidosawas significantly lower at low P and N concentrations than that at high concentrations (P＜0.05), and the N/P ratio negatively affected the growth ofC. pyrenoidosaas it was lower than 8 at high P and N concentrations, while the effect would relieve as the ratio was higher than 16. The multiple regression analysis showed that there were significant linear relationships betweenC. pyrenoidosaquantity with the initial concentrations of N and P, the influence of which concentrations also were much higher than other factors (P＜0.05). Accordingly, though the growth ofC. pyrenoidosapositively correlated to the assimilation of N and P, it is still difficult to improve the absorption efficiency of P and N byC.pyrenoidosajust through regulating the N/P ratios in aquaculture water.

phosphorus; nitrogen-phosphorus ratio;Chlorella pyrenoidosa; absorption

10.14108/j.cnki.1008-8873.2017.05.005

X172; S917.1

A

1008-8873(2017)05-034-07

曹煜成, 李卓佳, 胡曉娟, 等.磷濃度與氮磷比對蛋白核小球藻氮磷吸收效應的影響[J].生態(tài)科學, 2017, 36(5): 34-40.

CAO Yucheng, LI Zhuojia, HU Xiaojuan, et al.Effects of phosphorus concentration and nitrogen-phosphorus ratio on absorption of nitrogen and phosphorus byChlorella pyrenoidosa[J].Ecological Science, 2017, 36(5): 34-40.

2017-04-11;

2017-06-02

中國水產(chǎn)科學研究院基本科研業(yè)務費(2017HY-ZD0501); 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（蝦蟹）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(CARS-48); 廣東省海洋漁業(yè)科技與產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項(A201401B03); 廣東省科技計劃項目(2016A040402034)

曹煜成(1979—), 男, 博士, 副研究員, 從事對蝦健康養(yǎng)殖及池塘環(huán)境調(diào)控研究, E-mail：cyc_715@163.com

*通信作者:文國樑(1978—), 男, 副研究員, 主要從事養(yǎng)殖水環(huán)境調(diào)控與修復研究, E-mail：guowen66@163.com