張巍偉,姜 泓

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110122)

奶制品中蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法的研究進(jìn)展

張巍偉,姜 泓*

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110122)

蛋白質(zhì)是奶及其制品的主要營(yíng)養(yǎng)成分. 現(xiàn)階段奶及其制品中非蛋白氮、水解蛋白的摻假行為屢見(jiàn)不鮮，主要是由于缺乏奶及其制品中蛋白質(zhì)精準(zhǔn)定量的方法. 本文著重對(duì)奶及其制品中蛋白質(zhì)定量方法進(jìn)行歸納總結(jié)，主要介紹色譜法、分光光度法、滴定法和酶聯(lián)免疫法的研究進(jìn)展，比較各類方法的優(yōu)缺點(diǎn)，為準(zhǔn)確有效地對(duì)奶及其制品中的蛋白質(zhì)進(jìn)行定量測(cè)定提供參考.

奶制品；蛋白質(zhì)；檢測(cè)方法；含量測(cè)定

蛋白質(zhì)是人體極為重要的營(yíng)養(yǎng)素. 具有構(gòu)成和修復(fù)身體組織、構(gòu)成生理活性物質(zhì)、調(diào)節(jié)滲透壓和供給能量等生理功能. 蛋白質(zhì)均含有碳、氫、氧、氮四種元素，部分含有硫、鐵、銅、磷等元素，其中氮元素在蛋白質(zhì)中含量最恒定，約占16%，故蛋白質(zhì)的定量方法常根據(jù)氮元素的含量進(jìn)行推算. 奶及其制品因富含豐富的蛋白質(zhì)(見(jiàn)表1)，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高，成為現(xiàn)代人的生活必需品，如，牛初乳被贊譽(yù)為“乳珍”、“乳白金”、“乳中奇葩”等[1-2]. 此外，隨著現(xiàn)代生活節(jié)奏的不斷加快，嬰幼兒奶粉成了哺乳期工薪階層女性的主要選擇，然而隨著2008年三聚氰胺事件的爆光，給中國(guó)乳業(yè)的發(fā)展帶來(lái)重創(chuàng)，也反映出我國(guó)奶及其制品蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法的不足，讓不法商販為牟取商業(yè)暴利有可乘之機(jī). 因此，建立準(zhǔn)確、特異、高效、快速的乳及其制品中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定方法具有重要意義，本文綜述了近年來(lái)奶制品中蛋白質(zhì)含量的檢測(cè)方法.

1 色譜法

色譜法(Chromatography)又稱“色譜分析法”、“層析法”，是一種物理或物理化學(xué)分離分析方法，用于分離多組分的試樣. 其原理是利用各種物質(zhì)在兩相中具有不同的分配系數(shù)，當(dāng)兩相作相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí)，待分離物質(zhì)在兩相中進(jìn)行多次反復(fù)的分配來(lái)達(dá)到分離的目的. 較常用的有高效液相色譜法、生物質(zhì)譜技術(shù)、毛細(xì)管電泳法和陰陽(yáng)離子交換色譜法.

表1 牛奶中蛋白質(zhì)種類、含量、組成及功能Table 1 Milk protein species, content, composition and function

1.1 高效液相色譜法

高效液相色譜(HPLC)是色譜法的一個(gè)重要分支，以液體為流動(dòng)相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動(dòng)相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進(jìn)入檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)試樣的分析[9]. 康孟丹等[10]建立HPLC測(cè)定牛初乳乳清蛋白粉中免疫球蛋白(Immunoglobulin-G，IgG)的含量，流動(dòng)相為0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液和0.05 mol/L甘氨酸鹽緩沖液，檢測(cè)波長(zhǎng)為278 nm，檢出限為0.3 μg，且在0.1～1.0 mg/L范圍具有良好線性關(guān)系，所建方法快捷、簡(jiǎn)便、靈敏度高，能夠準(zhǔn)確測(cè)定IgG的含量. 王浩等[11]采用凝膠過(guò)濾-HPLC測(cè)定牛奶及制品中的α-乳白蛋白(α-Lactalbumin，α-La)和β-乳球蛋白(β-Lactoglobulin，β-Lg)的含量，分離度為1.0，回收率可達(dá)到90%. 趙海霞等[12]采用C8色譜柱，流動(dòng)相為0.1%的三氟乙酸-水溶液和0.09%的三氟乙酸-乙腈溶液，梯度洗脫，在215 nm檢測(cè)波長(zhǎng)下測(cè)得檢測(cè)限、定量限分別為3 mg/L、10 mg/L，為定量測(cè)定α-La和β-Lg含量提供有效方法.

高效液相色譜法具有分離效率高、選擇性好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn). 但所用檢測(cè)器常為紫外檢測(cè)器，且蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)錯(cuò)綜復(fù)雜，經(jīng)常發(fā)生結(jié)構(gòu)變性，在分離過(guò)程中易造成死吸附，常出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果回收率低和分離度差等問(wèn)題.

1.2 生物質(zhì)譜技術(shù)

隨著質(zhì)譜技術(shù)的不斷改進(jìn)和完善，質(zhì)譜的應(yīng)用范圍已擴(kuò)展到生命科學(xué)研究的許多領(lǐng)域，特別是質(zhì)譜在蛋白質(zhì)領(lǐng)域的應(yīng)用，不僅為生命科學(xué)研究提供了新方法，同時(shí)也促進(jìn)了質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展. 電噴霧電離(Electrospray Ionization，ESI)和基質(zhì)輔助激光解吸電離(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization，MALDI)這兩種軟電離技術(shù)的出現(xiàn)，使生物大分子的離子化得以實(shí)現(xiàn)[13]，一種基于生物標(biāo)志物的生物質(zhì)譜技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生. 目前，生物質(zhì)譜技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生物大分子研究領(lǐng)域，為蛋白質(zhì)組學(xué)的研究及蛋白標(biāo)志物的分離純化與定量分析提供有效手段. 現(xiàn)階段三重四級(jí)桿質(zhì)譜(Triple quadrupole mass spectrometry，QQQ-MS)廣泛用于蛋白質(zhì)的定量. 即對(duì)蛋白質(zhì)酶解或降解后所得多肽混合物進(jìn)行質(zhì)譜分析，采用多反應(yīng)檢測(cè)模式(Multi-reaction mode，MRM)對(duì)特異肽段進(jìn)行檢測(cè)，從而對(duì)相應(yīng)蛋白質(zhì)進(jìn)行定性定量. 此外，隨著生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展，質(zhì)譜技術(shù)除了用于蛋白質(zhì)的質(zhì)量測(cè)定外，還廣泛地用于肽指紋圖譜(Peptide Mass Fingerprinting，PMF)以及氨基酸序列測(cè)定. 在PMF鑒定蛋白質(zhì)中，目前最常用的方法是，采用 2-DE 技術(shù)將酶切得到的肽段進(jìn)行分離，再利用 MALDI-TOF-MS進(jìn)行分析，將實(shí)際水解肽段與多肽蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中蛋白質(zhì)的理論肽段進(jìn)行比較，判別所測(cè)蛋白質(zhì)是已知還是未知，從而對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定和高通量篩選. 安美忱等[14]建立高效液相色譜-基質(zhì)輔助激光解吸電離串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜(HPLC-MALDI-TOF/TOF MS)分離鑒定牛乳鐵蛋白素(Bovine Lactoferricin，Lfcin B)的方法，分離得到高活性的Lfcin B，其相對(duì)分子質(zhì)量為3 124.89，蛋白含量為18.20 mg/L. CHRISTOPH C等[15]建立適用于牛乳、全乳、嬰兒酸奶食品中β-Lg含量測(cè)定的HPLC-MS聯(lián)用方法，從BLAST數(shù)據(jù)庫(kù)中尋找與牛乳中β-Lg物理化學(xué)性質(zhì)相似的蛋白作為內(nèi)標(biāo)，彌補(bǔ)了在提取過(guò)程中所造成的β-Lg損失，對(duì)β-Lg進(jìn)行絕對(duì)定量. REN等[16]建立UHPLC-MS聯(lián)用方法同時(shí)測(cè)定乳制品中α-La、β-Lg的含量，采用線性洗脫的方法改變流動(dòng)相(A:0.1%三氟乙酸溶液，B:0.1%三氟乙酸乙腈溶液)的比例，選擇人乳α-La作為內(nèi)標(biāo)肽段，結(jié)果表明該方法在0.15～0.19 mg/L濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好R2≥0.9991，回收率為94.0%～98.7%，準(zhǔn)確度RSD≤11.1%，重復(fù)率RSD≤5.7%，可準(zhǔn)確定量乳清蛋白含量，并應(yīng)用于嬰幼兒奶粉中蛋白質(zhì)α-La和β-Lg的含量檢測(cè). FELFOUL等[17]應(yīng)用LC-MS聯(lián)用技術(shù)，對(duì)駱駝乳和牛乳中的α-La、β-Lg和Caseins進(jìn)行檢測(cè)，研究表明經(jīng)過(guò)80 ℃加熱60 min后，駱駝乳和牛乳中α-La、β-Lg均無(wú)法檢測(cè)到，而酪蛋白(Caseins，CNs)卻可保持其完整性被LC-MS檢測(cè)并定量，得出高溫處理會(huì)導(dǎo)致乳清蛋白大量損失，提示對(duì)乳清蛋白進(jìn)行前處理時(shí)應(yīng)避免高溫加熱或者采用內(nèi)標(biāo)對(duì)回收率進(jìn)行校正. LINX等[18]采用定性LC-TOF-MS/MS聯(lián)用技術(shù)對(duì)乳清蛋白中產(chǎn)生苦味的成分進(jìn)行分析，結(jié)果顯示產(chǎn)生苦味的氨基酸序列分別是源自α-La、β-Lg、血清白蛋白(SA)和β-Casein的YGLF，IPAVF，LLF和YPFPGPIPN肽段，并確定YGLF、IPAVF、LLF和YPFPGPIPN的濃度分別為0.66、0.58、1.33和2.64 g/kg，同時(shí)表明在10%乳清蛋白溶液中，上述四種肽段序列苦味強(qiáng)度高達(dá)88%.

生物質(zhì)譜技術(shù)具有檢測(cè)準(zhǔn)確、快速、方便的優(yōu)點(diǎn)，但其消耗品較昂貴，對(duì)設(shè)備的檢測(cè)狀態(tài)及維護(hù)條件要求較高，限制其廣泛的應(yīng)用于食品質(zhì)量檢測(cè)監(jiān)督局及相關(guān)領(lǐng)域.

1.3 毛細(xì)管電泳法

毛細(xì)管電泳(Capillary electrophoresis，CE)又稱高效毛細(xì)管電泳(High performance capillary electrophoresis ，HPCE)，是以彈性石英毛細(xì)管為分離通道，以高壓電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力，依據(jù)樣品中各組分之間電泳速度及分配行為上的差異而實(shí)現(xiàn)分離的電泳分離分析方法. 張東送等[19]運(yùn)用CE快速分析牛乳中的蛋白組分，檢測(cè)牛乳中添加雜蛋白的摻假情況，并繪制出原料乳、巴氏乳和超高溫乳的毛細(xì)管區(qū)帶電泳圖譜，利用32Karat軟件計(jì)算出乳中酪蛋白的含量，并可檢測(cè)乳粉中是否添加大豆蛋白. 孫國(guó)慶等[20]利用毛細(xì)管電泳法分別測(cè)定1～12月份牛乳樣品中α-La和β-Lg含量，發(fā)現(xiàn)牛乳中α-La和β-Lg含量與氣候溫度負(fù)相關(guān). 唐萍等[21]將檸檬酸作為緩沖體系，可很好地分離出牛奶中α-La、β-Lg、α-酪蛋白(α-Casein，α-CN)、β-酪蛋白(β-Casein，β-CN)和κ-酪蛋白(κ-Casein，κ-CN).

毛細(xì)管電泳法具有快速、高效、進(jìn)樣量少、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)；但靈敏度相對(duì)較低，準(zhǔn)確度較差，常因柱內(nèi)壁易吸附堿性蛋白等生物大分子而較少用于蛋白質(zhì)、核酸的分離.

1.4 陰陽(yáng)離子交換色譜

離子交換色譜法是將離子交換原理與液相色譜技術(shù)結(jié)合而來(lái)的測(cè)定溶液中陰、陽(yáng)離子的一種分離分析方法，不僅可用于無(wú)機(jī)離子混合物，還可用于有機(jī)離子混合物的分離. 趙凌國(guó)等[22]采用0.2 g purolite C115E離子交換樹(shù)脂，用500 mg/L乳鐵蛋白(lactoferrin，LF)標(biāo)品對(duì)毛細(xì)管柱進(jìn)行動(dòng)態(tài)涂層，5% NaCl溶液在pH=6.0的酸性條件下進(jìn)行洗脫，最佳孵育時(shí)間定為120 min，可準(zhǔn)確檢測(cè)出牛奶中LF的含量. 由于該法通過(guò)離子交換分離混合物，故對(duì)于分子型混合物難以達(dá)到較好的分離效果.

離子交換色譜法的優(yōu)勢(shì)在于吸附容量大，固定相吸附力較溫和，洗脫時(shí)不易破壞蛋白質(zhì)及酶的活性，表面積大、交換容量大、回收率高，可用于分離和制備；劣勢(shì)在于交換層析介質(zhì)不同，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分離效果不同，易造成蛋白峰的重疊，導(dǎo)致分離純度下降.

2 分光光度法

分光光度法又稱吸收光譜法，是對(duì)被測(cè)物質(zhì)在特定波長(zhǎng)處或一定波長(zhǎng)范圍內(nèi)對(duì)光的吸光度或發(fā)光強(qiáng)度的測(cè)定，從而對(duì)被測(cè)物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析的方法. 該方法是以Lambert-Beer定律為理論基礎(chǔ)，通過(guò)檢測(cè)光源經(jīng)過(guò)待測(cè)物質(zhì)前后吸光度的變化對(duì)無(wú)機(jī)、有機(jī)化合物進(jìn)行定性定量分析或結(jié)構(gòu)鑒定. 較常用的為紫外-可見(jiàn)分光光度法，近紅外分光光度法.

2.1 紫外-可見(jiàn)分光光度法

紫外-可見(jiàn)分光光度法是檢測(cè)吸收波長(zhǎng)在190～800 nm范圍內(nèi)待測(cè)物質(zhì)的吸光度，用于鑒別、雜質(zhì)檢查和定量測(cè)定的方法. 當(dāng)光透過(guò)被測(cè)物質(zhì)溶液時(shí)，物質(zhì)對(duì)光的吸收程度隨波長(zhǎng)的變化而變化. 因此，通過(guò)測(cè)定物質(zhì)在不同波長(zhǎng)處的吸光度，確定最適檢測(cè)波長(zhǎng)，并繪制吸光度與波長(zhǎng)的曲線圖即得被測(cè)物質(zhì)的吸收光譜. 由丹青[23]建立紫外分光光度法測(cè)定牛奶中添加水解蛋白(L-羥脯氨酸)的含量，該方法線性關(guān)系良好，檢測(cè)限為0.2 μg/g，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.48%～0.77%，加標(biāo)回收率為93.13%～100.57%，可靈敏、準(zhǔn)確、可靠的用于純牛奶中L-羥脯氨酸的含量測(cè)定. 李良等[24]將GB/T 5009.5-2003中第一法(凱氏定氮法)和第二法(分光光度法)進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果表明二者無(wú)明顯差異，第一法更適合測(cè)定少量樣品，第二法更側(cè)重于測(cè)定大批量樣品中蛋白質(zhì)含量. 在483 nm的檢測(cè)波長(zhǎng)下，馮旭東等[25]利用自主研發(fā)的蛋白質(zhì)快速檢測(cè)儀得出在17～40 ℃條件下，蛋白質(zhì)試劑與蛋白質(zhì)l min內(nèi)即可完全反應(yīng)，整個(gè)測(cè)定過(guò)程僅需5～10 min，測(cè)定結(jié)果的精密度(RSD)小于1%，與凱式定氮法測(cè)定結(jié)果和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)比較，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)誤差均小于5%，且不受三聚氰胺、尿素、甘氨酸和硝酸銨等非蛋白氮的干擾，同時(shí)表明蛋白質(zhì)快速檢測(cè)儀重復(fù)性較好，可用于乳制品中蛋白質(zhì)含量的快速測(cè)定. 許家喜[26]總結(jié)出的五種蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法中，雙縮脲法、Folin-酚試劑法和考馬斯亮藍(lán)法均為顯色劑與待測(cè)物發(fā)生顯色反應(yīng)，根據(jù)吸光度的變化進(jìn)行蛋白質(zhì)含量測(cè)定，見(jiàn)表2. 陳育紅等[27]利用雙縮脲法在540 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出試樣中蛋白質(zhì)的含量. 劉瑩等[28]建立了三氯乙酸-雙縮脲比色法，可以準(zhǔn)確測(cè)定出液體乳中添加水解蛋白、三聚氰胺、尿素、甘氨酸等非蛋白氮(nonprotein nitrogen，NPN)的蛋白質(zhì)含量. 房列濤等[29]以酪蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，選用雙波長(zhǎng)(測(cè)定波長(zhǎng)600 nm，參比波長(zhǎng)460 nm)代替單波長(zhǎng)法，對(duì)考馬斯亮藍(lán)發(fā)進(jìn)行改進(jìn)，該法可消除游離考馬斯亮藍(lán)的干擾，增加測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性.

表2 5種常用蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法的比較Table 2 Comparison of five common protein content determination methods

2.2 近紅外分光光度法

近紅外光譜分析技術(shù)是依據(jù)被檢測(cè)樣品中某一化學(xué)成分對(duì)近紅外光譜區(qū)的吸收特性進(jìn)行的定性、定量的一種檢測(cè)方法. 近紅外光譜吸收是由于分子振動(dòng)能級(jí)的躍遷(同時(shí)伴隨轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)躍遷)而產(chǎn)生的. 近紅外光(NIR)是指介于可見(jiàn)光(VIS)和中紅外光(MIR)之間的電磁波，美國(guó)材料檢測(cè)協(xié)會(huì)(ASTM)定義的近紅外光譜的波長(zhǎng)范圍為780～2 526 nm，是人們最早認(rèn)識(shí)的非可見(jiàn)光區(qū)域. 李雙紅等[30]利用近紅外光譜掃描和多功能乳制品分析儀對(duì)不同胎次奶牛牛奶蛋白質(zhì)含量進(jìn)行測(cè)定，在正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)上，分別采用主成分回歸法(PCR)、偏最小二乘法(PLS)、改進(jìn)偏最小二乘法(MPLS)三種定量校正方法和多種光譜預(yù)處理方法聯(lián)用建立數(shù)學(xué)模型，利用目標(biāo)函數(shù)法對(duì)模型進(jìn)行評(píng)定，發(fā)現(xiàn)一胎和二胎奶牛乳樣中乳蛋白的最優(yōu)模型相同，所建模型可應(yīng)用于快速、準(zhǔn)確、無(wú)損、定量檢測(cè)原料奶中乳蛋白的含量，為快速檢測(cè)混合原料奶中乳蛋白含量提供了理論依據(jù). 單楊等[31]采用Kennard-Store法對(duì)樣品進(jìn)行校正集和預(yù)測(cè)集分類，小波變換法進(jìn)行數(shù)據(jù)壓縮與去噪，徑向基神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)建立蛋白質(zhì)和脂肪預(yù)測(cè)模型，利用凱氏定氮法求出蛋白質(zhì)含量，適用于奶粉脂肪和蛋白質(zhì)含量的快速無(wú)損測(cè)定.

分光光度法的主要特點(diǎn)為靈敏度高，應(yīng)用范圍廣，操作簡(jiǎn)便，分析成本低；然而其在準(zhǔn)確度，專一性，干擾物質(zhì)的影響方面有待提高.

3 滴定法

滴定法分為自動(dòng)電位滴定法和人工滴定法兩類. 其原理主要是根據(jù)指示劑顏色變化確定滴定終點(diǎn)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)溶液的消耗體積進(jìn)而推算出待測(cè)物質(zhì)的濃度. 傳統(tǒng)的凱氏定氮法誤差較大，且不能區(qū)分蛋白氮與非蛋白氮，具體見(jiàn)表2[26]. 因此，高美玲等[32]針對(duì)GB/T 5009.5-2003中第一法(凱氏定氮法)的不足，對(duì)凱氏定氮法進(jìn)行優(yōu)化，在含量測(cè)定前將牛乳樣品pH調(diào)節(jié)為4.8，加入5倍于牛乳體積的95%乙醇沉淀蛋白質(zhì)，過(guò)濾后用濃硫酸消化蛋白質(zhì)沉淀，該法能簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)出牛乳中純蛋白質(zhì)含量. 周曉琳等[33]將凱氏定氮法的反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，消化液用量為10 mL，硫酸鉀和硫酸銅的用量分別為8 g和0.5 g，硼酸接收液的濃度為30 g/L，用量20 mL，蒸餾時(shí)間為10 min，經(jīng)優(yōu)化后的方法能保證奶粉中高蛋白含量的檢出.

由于手動(dòng)滴定法的系統(tǒng)誤差較大，人們?cè)趥鹘y(tǒng)凱氏定氮法的基礎(chǔ)上研制出全自動(dòng)凱氏定氮儀，彌補(bǔ)了耗時(shí)長(zhǎng)，溶液消耗量大的缺點(diǎn). 王靜等[34]使用全自動(dòng)凱式定氮儀對(duì)生鮮牛乳中非蛋白氮進(jìn)行測(cè)定，彌補(bǔ)了手動(dòng)滴定誤差較大的缺點(diǎn)，該法與GB/T 21704-2008相比，節(jié)省試劑超過(guò)50%，縮短了分析時(shí)間，提高了分析效率. 劉正等[35]使用全自動(dòng)定氮儀與半微量蒸餾法對(duì)多種乳制品進(jìn)行蛋白質(zhì)含量測(cè)定，可準(zhǔn)確、快速測(cè)量出蛋白質(zhì)含量. 何莉萍等[36]依據(jù)十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)可破壞蛋白質(zhì)膠粒的水化膜，使其失去穩(wěn)定性而沉淀的原理，探究用SDS快速檢測(cè)奶粉中蛋白質(zhì)含量的實(shí)驗(yàn)條件，篩選確定溶液pH<3，反應(yīng)溫度在15～30 ℃范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，在4 min內(nèi)完成奶粉中蛋白質(zhì)的檢測(cè).

4 酶聯(lián)免疫吸附法

酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA)最初是由瑞典學(xué)者ENGVAIL和PERLMANN，荷蘭學(xué)者VAN WEERMAN和SCHUURS在1971年分別提出，將免疫技術(shù)應(yīng)用于檢測(cè)體液中微量物質(zhì)的固相免疫測(cè)定方法. 其原理是將抗體與酶復(fù)合物結(jié)合，根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺進(jìn)行定性或定量分析. 目前，已有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道將ELISA法應(yīng)用于牛初乳中IgG和母乳中LF蛋白的含量測(cè)定. 馬智偉等[37]采用凝乳和超濾工藝，對(duì)樣品前處理方法進(jìn)行改進(jìn)，以便獲得高濃度IgG，利用ELISA法(HRP-兔抗牛IgG作為二抗)在492 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，從而確定IgG的含量，為工業(yè)化生產(chǎn)高濃度IgG初乳粉提供了可行工藝. 單炯[38]利用ELISA雙抗體夾心法在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定母乳中LF含量，結(jié)果表明以初乳中LF含量最高，過(guò)渡乳其次，成熟乳最低，且母乳中LF含量?jī)H與產(chǎn)婦的營(yíng)養(yǎng)水平有關(guān)，與產(chǎn)婦年齡，嬰兒體重，產(chǎn)婦種族無(wú)關(guān).

ELISA法的優(yōu)點(diǎn)在于酶催化效率極高，可極大限度地放大反應(yīng)效果，從而使測(cè)定方法達(dá)到很高的敏感度，且該法操作簡(jiǎn)單，專一性好，但由于抗原抗體結(jié)合具有特異性，因此該技術(shù)只能對(duì)已知特異性抗體的生物樣品進(jìn)行檢測(cè)，且易受自身抗體和交叉免疫性的干擾[39]，常出現(xiàn)假陽(yáng)性、假陰性結(jié)果. 與ELISA測(cè)定原理類似的還有瓊脂單、雙向免疫擴(kuò)散法[40].

5 聯(lián)合測(cè)定法

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，采用一種方法往往不能滿足我們對(duì)測(cè)定的需求，因此聯(lián)合使用兩種或多種方法測(cè)定乳制品中蛋白質(zhì)的含量是一個(gè)不錯(cuò)的選擇. 孫雯[41]將等電點(diǎn)法和凱氏定氮法聯(lián)合使用，在pH=4.6，緩沖溶液為HAC-NaAc的條件下沉淀酪蛋白，在堿性條件下復(fù)溶，利用凱氏定氮法測(cè)定乳蛋白含量. 樂(lè)薇等[42]利用數(shù)碼成像比色法將考馬斯亮藍(lán)染色后的蛋白質(zhì)顏色深度轉(zhuǎn)換為灰度格式，計(jì)算蛋白質(zhì)的含量，用于牛乳中蛋白質(zhì)含量測(cè)定，該法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于2%，回收率在97.5%～102.6%之間，結(jié)果與考馬斯亮藍(lán)分光光度法測(cè)定結(jié)果一致，且更加簡(jiǎn)便、快速.

6 氨基酸折算法

除了以上方法之外，氨基酸折算法同樣可用于乳制品中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定. Association of Official Analytical Chemists[43](AOAC)建立乳及嬰幼兒配方奶粉中乳清蛋白的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)是以乳清蛋白和酪蛋白中的4種特征氨基酸為理論基礎(chǔ)，即依據(jù)天冬氨酸/天冬酰胺(Asx)、丙氨酸(Ala)、苯丙氨酸(Phe)和脯氨酸(Pro)的含量折算出嬰幼兒配方奶粉中乳清蛋白的百分比. 計(jì)算公式如下：

R=(Asx+Ala)/(Phe+Pro)(1)

Asx為天冬酰胺的個(gè)數(shù)；Ala為丙氨酸個(gè)數(shù)；Phe為苯丙氨酸個(gè)數(shù)；Pro為脯氨酸個(gè)數(shù)

fw/%=100×(9.596-15.72R)/

(-6.111R-7.037)(2)

R為特征氨基酸的比值；fw為乳清蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù).

李爽等[44]針對(duì)氨基酸折算法應(yīng)用于嬰幼兒奶粉中乳清蛋白的含量測(cè)定進(jìn)行方法評(píng)估，結(jié)果顯示，大豆分離蛋白會(huì)改變氨基酸的組成，對(duì)含有豆基配方粉的產(chǎn)品不適用，故氨基酸折算法只適用于乳基嬰幼兒配方乳粉.

7 結(jié)語(yǔ)

總結(jié)歸納了色譜法、分光光度法、滴定法、酶聯(lián)免疫等方法測(cè)定奶制品中的蛋白質(zhì)含量，比較了這些測(cè)定方法的優(yōu)缺點(diǎn). 雖然在交叉學(xué)科的研究背景下，新建立許多操作簡(jiǎn)便、靈敏度好、準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好的檢測(cè)方法，但部分測(cè)定方法存在應(yīng)用費(fèi)用昂貴、儀器要求較高、操作復(fù)雜等問(wèn)題，不易被廣泛應(yīng)用于乳制品行業(yè)及相應(yīng)食品質(zhì)量監(jiān)管部門. 因此，建立檢測(cè)成本較低、可操作性強(qiáng)、應(yīng)用范圍廣、準(zhǔn)確可靠的蛋白質(zhì)檢測(cè)方法是乳制品行業(yè)的重點(diǎn)發(fā)展方向.

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Reviewonquantitationtechniquesforproteinindairyproducts

ZHANG Weiwei, JIANG Hong*

(SchoolofPublicHealth,ChinaMedicalUniversity,Shenyang110122,Liaoning,China)

Protein is a viral nutrient component of dairy products.At present, precise quantitative method in protein of the dairy products is shortage so that the behavior of adding the non-protein nitrogen, hydrolyzed protein in dairy products is not uncommon. This paper focuses on analyzing and summarizing the quantitative methods of protein quantification and adulteration detection in dairy products. The progresses of chromatography, spectrophotometry, titration and enzyme-linked immunoassay are introduced. Simultaneously, we analyse advantages and disadvantages of each method to effectively provide a reference for the quantitative method of milk protein in dairy products.

dairy products; protein; detection method; quantitation

R155.57

A

1008-1011(2017)05-0663-08

2017-06-14.

中華醫(yī)學(xué)會(huì)醫(yī)學(xué)教育分會(huì)和中國(guó)高等教育學(xué)會(huì)醫(yī)學(xué)教育專業(yè)委員會(huì)2016年醫(yī)學(xué)教育研究立項(xiàng)課題(2016A-YF002)；遼寧省高等教育學(xué)會(huì)“十三五”規(guī)劃高教研究立項(xiàng)課題(GHZD160007).

張巍偉(1993-)，女，碩士生，研究方向?yàn)樾l(wèi)生檢驗(yàn)學(xué).*

，E-mail：hjiang@cmu.edu.cn.

[責(zé)任編輯：吳文鵬]