王玉樂，樊歡歡，向國強*，張 衡，寧可可，段俊躍，楊登輝

(1.河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001; 2.河南工業(yè)大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，河南 鄭州 450001)

基于碳量子點修飾納米硅膠熒光猝滅-恢復(fù)測定糧食樣品中還原型谷胱甘肽

王玉樂1，樊歡歡2，向國強2*，張 衡2，寧可可2，段俊躍2，楊登輝2

(1.河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001; 2.河南工業(yè)大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，河南 鄭州 450001)

制備了碳量子點修飾硅膠 (SiO2@CDs)，經(jīng)過Cu2+處理后，根據(jù)SiO2@CDs熒光強度恢復(fù)程度與還原型谷胱甘肽(GSH)成正比的現(xiàn)象，建立了基于SiO2@CDs熒光猝滅-恢復(fù)測定GSH的新方法. 考察了溶液pH值和反應(yīng)時間對檢測體系的影響. 在最佳的實驗條件下，GSH濃度在0.2×10-6～8.0×10-6mol/L范圍內(nèi)與SiO2@CDs的熒光恢復(fù)程度呈良好線性，檢出限(3σ)為0.03×10-6mol/L. 用于糧食樣品中GSH的檢測，回收率在90.0%～115.2%之間.

碳量子點；熒光法；谷胱甘肽；糧食樣品

谷胱甘肽(GSH)乃生物機體內(nèi)重要的活性物質(zhì)，且半胱氨酸的側(cè)鏈集團上有一個非?；顫姷膸€基，這種結(jié)構(gòu)是谷胱甘肽的許多重要生理功能的基礎(chǔ)[1]，例如清除自由基、解毒、維持DNA的生物合成、細胞的正常生長及細胞的免疫等. 谷胱甘肽分為還原型(GSH)和氧化型(GSSG)兩種形態(tài). 還原型谷胱甘肽(GSH)是一種特殊的氨基酸衍生物[2]，占谷胱甘肽總含量99.5%. 目前，針對谷胱甘肽等小分子的傳統(tǒng)檢測方法有比色法[3]、分光光度法[4]、電化學(xué)測量[5]、酶催化法[6]以及高效液相色譜法[7]等. 這些分析方法各有優(yōu)點，但是操作相對復(fù)雜，儀器設(shè)備昂貴等不足. 熒光傳感器因其靈敏度高，檢測簡便，快速，在諸多分析方法中具有明顯優(yōu)勢.

最近，基于QDs熒光猝滅-恢復(fù)現(xiàn)象建立的分析方法多見報道[8-11]. 但是大多數(shù)工作所用的QDs 都含有有毒重金屬元素Cd、Hg、Pb等[12-13]，生物相容性是這種納米材料臨床應(yīng)用的瓶頸. 碳量子點(Carbon dots, CDs)由于優(yōu)良的熒光性質(zhì)和良好生物相容性，在熒光傳感分析中受到了廣泛關(guān)注[14-16]. 相比于傳統(tǒng)的熒光有機染料，量子點(QDs)具有寬激發(fā)光譜、窄發(fā)射光譜、高熒光量子產(chǎn)率和壽命長等優(yōu)點，是一種理想的分析探針[17-19].

將碳量子點修飾到納米硅膠表面(SiO2@CDs)，研究表明. Cu2+與CDs表面基團結(jié)合，降低SiO2@CDs熒光強度；當體系中加入GSH后，SiO2@CDs熒光強度得到恢復(fù)，且恢復(fù)程度與GSH濃度相關(guān)，從而實現(xiàn)了對GSH的測定. 本方法操作簡單，靈敏度高，成本低，可用于糧食樣品中GSH的測定.

1 實驗部分

1.1 試劑和儀器

Cary Eclipse熒光光譜儀(Agilent，美國)；透射電鏡儀(JEM-2011，日本)；電子天平(BS224S，上海賽多利斯天平公司)；激光散射粒度分析儀(Nano zs-90，英國Malvern公司)；pH計(PHS-3C，上海精密科學(xué)儀器公司).

無水檸檬酸(AR 96%，Aladdin)；N-(β-氨乙基-γ-氨丙基)甲基二甲氧基硅烷(AEAPMS)(AR 96%，Aladdin)；正硅酸四乙酯(TEOS)(AR 96%，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；還原型谷胱甘肽(GSH)(BR 99%，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；三氯乙酸(AR 99%，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；各種金屬鹽均購于Aladdin公司，均為分析純(AR)或更高純度實驗用水為二次蒸餾水.

GSH提取劑配制：稱取5 g三氯乙酸，186 mg EDTA-Na2·H2O溶解于適量二次蒸餾水中，定容至100 mL備用.

1.2 碳量子點修飾納米硅膠(SiO2@CDs)的制備

[20]的方法制備碳量子點(CDs)，將無水檸檬酸(0.1 g)加入到有機硅AEAPMS(2 mL)中,加熱至230 ℃，反應(yīng)3 min. 所得反應(yīng)液用石油醚洗滌三次后溶于適量無水乙醇中. CDs修飾納米硅膠SiO2@CDs的制備：向25 mL無水乙醇中加入氨水(500 μL)、TEOS(700 μL)室溫下攪拌10 min后，加入CDs(70 μL)無水乙醇溶液繼續(xù)攪拌24 h，產(chǎn)物經(jīng)離心(4 000 rpm、5 min)后，用無水乙醇洗和蒸餾水洗滌. 所得SiO2@CDs經(jīng)干燥后，以無水乙醇為溶劑配制成10 g/L懸浮液備用.

圖1 碳量子點修飾納米硅膠的制備Fig.1 Preparation of Carbon Quantum Dot doped Silica gel nanoparticles

1.3 實驗方法

1.3.1 SiO2@CDs的熒光猝滅

在10 mL的具塞試管里加入2 mL SiO2@CDs 10 g/L懸浮液和2 mL Cu2+(2 mg/L)溶液，用pH為8的PB緩沖溶液定容，然后在40 ℃水浴鍋內(nèi)加熱10 min，流水冷卻后備用.

1.3.2 基于熒光猝滅-恢復(fù)的GSH測定方法

在10 mL的具塞試管中依次加入1.0 mL用上述Cu2+處理過的SiO2@CDs(SiO2@CDs-Cu2+)懸浮液，一定量的GSH工作液(或樣品溶液)，用pH為7.0的PB緩沖溶液定容后，振蕩20 s；同時做試劑空白實驗；以360 nm作為激發(fā)波長，測定實驗溶液在熒光發(fā)射峰460 nm處的熒光強度F和試劑空白溶液熒光強度F0，計算ΔF=F-F0.

1.4 樣品處理

本實驗所用糧食谷物樣品，均購于超市(鄭州，中原區(qū))分別取適量樣品置于研缽內(nèi)研碎，稱取出1.0 g粉碎后的樣品，加入7 mL GSH提取劑，振蕩，離心(12 000 rpm、10 min、4 ℃)，收集上清液待測.

2 結(jié)果與討論

2.1 碳量子點修飾納米硅膠(SiO2@CDs)的表征

以檸檬酸為碳源制備的熒光碳點(表面含-OH和-COOH)與有機硅試劑(AEAPMS)(含有-NH2)通過形成酰胺鍵(-COOH與-NH2之間的反應(yīng))實現(xiàn)碳點與有機硅的連接. 從FT-IR光譜圖可以看出，CDs和CDs修飾納米硅膠在1 654 cm-1(C=O) 處都有C=ONR伸縮振動和3 456 cm-1處N-H振動，而納米硅膠沒有這一特征峰. 每一步的反應(yīng)產(chǎn)物在800 cm-1和1 100 cm-1處都有Si-O伸縮振動和Si-CH2-伸縮振動峰. 上述特征峰表明成功的合成了CDs修飾納米硅膠. TEM測試表明SiO2@CDs的平均粒徑為200 nm.激光散射粒度分析實驗結(jié)果顯示SiO2@CDs的平均粒徑為201 nm，與TEM結(jié)果相吻合. (圖2)

圖2 CDs修飾納米硅膠的表征(TEM(上)，F(xiàn)T-IR(中，其中a表示CDs；b表示CDs 修飾硅膠納米粒子；c表示硅膠納米粒子)，激光粒度散射分布(下))Fig.2 Characterization of CDs doped silica gel nanoparticles(TEM (top), FT-IR spectrum (middle): (a) CDs; (b) CDs doped silica gel nanoparticles; (c) silica gel nanoparticles; laser scat-tering particle size chart (down))

2.2 Cu2+對SiO2@CDs的熒光猝滅

根據(jù)文獻[21]報道，AEAPMS修飾CDs由于AEAPMS中乙二胺分子結(jié)構(gòu)與Cu2+具有較強的結(jié)合能力而使得Cu2+是CDs的良好猝滅劑，且具有較好的選擇性. 由圖3明顯看出，隨著Cu2+濃度增大，SiO2@CDs的熒光強度逐漸降低(彩色線). 因此，本實驗方法選取Cu2+作為SiO2@CDs的熒光猝滅劑.

2.3 GSH對猝滅的SiO2@CDs熒光的恢復(fù)

考察了GSH對SiO2@CDs-Cu2+體系的熒光恢復(fù)情況，如圖4所示. 隨著GSH濃度的增大，SiO2@CDs-Cu2+體系的熒光逐漸增大，表明SiO2@CDs的熒光逐漸恢復(fù). 由于Cu2+對SiO2@CDs的熒光猝滅作用是Cu2+與CDs表面基團結(jié)合引起，而GSH中的-SH集團具有更強的與Cu2+結(jié)合能力，GSH的加入使得CDs表面結(jié)合的Cu2+部分被解析下來與GSH結(jié)合，這使得SiO2@CDs熒光得以恢復(fù).

2.4 測定條件優(yōu)化

2.4.1 pH的影響

圖5是pH對GSH測定的影響，可以看出，SiO2@CDs-Cu2+與SiO2@CDs-Cu2+-GSH體系的熒光信號隨著pH值變化表現(xiàn)出相似規(guī)律，都是隨著pH增大(5～7),熒光信號逐漸增強；而當pH進一步增大時(7～9)時，熒光信號開始明顯降低. 而ΔF值在PH 7時達到最大值. 因此，選定pH 7作為體系pH條件.

2.4.2 反應(yīng)時間的影響

根據(jù)傳感機理，加入GSH將置換與AEAPMS結(jié)合的Cu2+,因此反應(yīng)時間也是影響熒光恢復(fù)的重要因素. 考察了反應(yīng)時間對熒光恢復(fù)量(ΔF)的影響，結(jié)果表明，加入GSH后反應(yīng)20 s，反應(yīng)體系的熒光恢復(fù)量(ΔF)達到最大，并在一定時間保持不變. 因此，選取20 s作為最佳反應(yīng)時間.

2.5 共存物質(zhì)的干擾

在優(yōu)化的實驗條件下，共存物質(zhì)對GSH測定的影響. 當相對誤差±10%時，體系中GSH濃度為2.5×10-6mol/L時，共存物質(zhì)的干擾允許濃度如表1 所示. 由表1可知，多數(shù)氨基酸有較大的干擾允許量，而半胱氨酸因為也含有-SH基團，其干擾允許濃度為2.0×10-6mol/L. 大多數(shù)金屬離子對GSH測定沒有干擾.

SiO2@ CDs 1.0 g/L, Cu2+ 0～500 μg/L, pH 8.0.圖3 Cu2+對CDs修飾硅膠納米粒子的熒光猝滅作用Fig.3 Fluorescence quenching effect of Cu2+ on the CDs doped silica gel nanoparticles

SiO2@CDs (1.0 g/L), GSH (0.2×10-6～8.0×10-6 mol/L), PB buffer solution at pH 7, vibration 20 s.圖4 GSH對SiO2@CDs-Cu2+體系的熒光恢復(fù)作用Fig.4 Fluorescence recovery of GSH to SiO2@CDs-Cu2+ system

SiO2@CDs (1.0 g/L), GSH (2.5 ×10-6 mol/L), PB buffer solution at different pH, vibration 20 s.圖5 pH對熒光猝滅-恢復(fù)體系的影響Fig.5 Effects of pH on the fluorescence quenching-recovery system

表1 常見干擾物質(zhì)的最大允許濃度Table 1 Tolerance amounts of foreign substances

2.6 分析性能

在優(yōu)化條件下，分析方法對GSH的檢出線(3σ)為0.03×10-6mol/L，線性范圍位0.2×10-6mol/L～8.0 ×10-6mol/L(ΔF=51C+19.6)，相對標準偏差(RSD)為4.9%(C=2.5×10-6mol/L)

表2 樣品中GSH含量的測定(n=3, mean ±SD, μg/g)Table 2 Analytical results of GSH in grain samples (μg/g, n=3)

3 實際樣品分析

將本方法應(yīng)用于稻米，綠豆和小麥樣品中GSH的測定. 采用標準曲線法對提取液中GSH含量進行了測定，并做了加入回收實驗，回收率在90%～115.2%之間.

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Determinationofreducedglutathioneingrainsamplesbasedonfluorescencequenching-recoveryofcarbondotsdopedsilicagelnanoparticles

WANG Yule1, FAN Huanhuan2, XIANG Guoqiang, ZHANG Heng2, NING Keke2, DUAN Junyue2, YANG Denghui2

(1.SchoolofFoodScienceandTechnology,HenanUniversityofTechnology.Zhengzhou450001,Henan,China;2.SchoolofChemistryandChemicalEngineering,HenanUniversityofTechnology,Zhengzhou450001，Henan，China)

Carbon dots doped silica gel nanoparticles (SiO2@CDs) were prepared. The fluorescence intensity of the SiO2@CDs was significantly quenched in the presence of Cu2+with adding reduced glutathione(GSH), and the fluorescence of SiO2@CDs was recovered after Cu2+reacted with GSH. The degree of recovery of the SiO2@CDs fluorescence intensity was proportional to the GSH concentration. Based on the results, a new analytical method for GSH was developed. Under the optimized experiment conditions, the detection limit (3σ) of the method was 0.03×10-6mol/L with a linear rang of 0.2×10-6-8.0×10-6mol/L. The method has been successfully applied for the detection of GSH in grain samples with the recoveries of 90.0%-115.2%.

carbon dots; fluorescence method; glutathione (GSH); grain samples

O657.3

A

1008-1011(2017)05-0633-06

2017-05-21.

河南省教育廳高?？萍紕?chuàng)新人才項目(13HASTIT016).

王玉樂(1992-)，女，研究方向:食品分析技術(shù).*

, E-mail:xianggq@126.com.

[責(zé)任編輯：張普玉]