沈建梅 孫 娜 杜微波 陳敬然 王雪茜 趙 琰 孔 慧 屈會化

(1 北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京，100029； 2 北京康仁堂藥業(yè)有限公司，北京，101300； 3 北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京，100029； 4 北京中醫(yī)藥大學(xué)北京中醫(yī)藥研究院，北京，100029)

雙辛鼻鼽散提取工藝研究

沈建梅1,2孫 娜1,2杜微波2陳敬然2王雪茜3趙 琰3孔 慧3屈會化4

(1 北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京，100029； 2 北京康仁堂藥業(yè)有限公司，北京，101300； 3 北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京，100029； 4 北京中醫(yī)藥大學(xué)北京中醫(yī)藥研究院，北京，100029)

目的：篩選雙辛鼻鼽散的最佳提取工藝。方法：針對方中各藥味的藥理作用，分別采用提取揮發(fā)油、水提和醇提工藝，采用正交實驗法篩選提取工藝條件，以揮發(fā)油收率為指標(biāo)優(yōu)選揮發(fā)油提取條件，以收率、鹽酸麻黃堿與鹽酸偽麻黃堿含量優(yōu)選水提條件，以黃芩苷含量和收率優(yōu)選醇提條件。結(jié)果：揮發(fā)油提取條件為10倍水，提取6 h和水提條件為8倍量水，提取3次，每次1 h和醇提工藝條件為50%乙醇提取3次，提取溶劑量分別為12倍/10倍/8倍，每次1.5 h。結(jié)論：該方法遵從各藥在復(fù)方中君臣佐使的特點，充分發(fā)揮了藥物特性，保證了雙辛鼻鼽散治療過敏性鼻炎的藥理藥效。

過敏性鼻炎；雙辛鼻鼽散；揮發(fā)油提??；水提；醇提

鼻鼽以突然和反復(fù)發(fā)作的鼻癢、噴嚏、流清涕、鼻塞等為特征的一種常見、多發(fā)性鼻病，相當(dāng)于西醫(yī)的過敏性鼻炎。中醫(yī)對其病因病機的認(rèn)知有多個方面，如體質(zhì)因素、胞痹不通、情志異常、寒邪異常、外寒內(nèi)熱、火熱致病、氣機紊亂、正氣虛衰等[1]。雙辛鼻鼽散是王慶國教授的臨床經(jīng)驗效方，臨床運用時辨證加減，療效顯著[2]。王教授認(rèn)為過敏性鼻炎屬于內(nèi)外合邪、寒熱錯雜之證，病涉太陰、少陰、少陽三經(jīng)，與肺脾腎及肝膽等臟腑密切相關(guān)，并認(rèn)為太陰肺脾氣虛、太陽外感風(fēng)寒，并兼少陽郁熱是該病的基本病機，以益氣固表、發(fā)散風(fēng)寒、兼清里熱為基本治法。

雙辛鼻鼽散是王教授在基于過敏性鼻炎基本病機的認(rèn)識上，以麻黃細(xì)心附子湯、玉屏風(fēng)散和川芎茶調(diào)散化裁而成，其主要組成藥物為：炙麻黃、細(xì)辛、黃芩、川芎、辛夷(后下)、黃芪、防風(fēng)。本實驗根據(jù)各藥味在方中的藥理作用及各自化學(xué)成分特點采取不同提取工藝：細(xì)辛、辛夷和川芎先提取揮發(fā)油，以揮發(fā)油收率為考查指標(biāo)，采用正交試驗法優(yōu)選提油工藝；炙麻黃、黃芪和防風(fēng)采用水提，綜合考慮收膏率和麻黃堿、偽麻黃堿的含量等指標(biāo)，采用正交實驗法進(jìn)行水提工藝研究；參考文獻(xiàn)方法確定黃芩的醇提工藝。

1 材料

1.1 儀器 島津2010-AHT型液相色譜儀萬分之一電子天平(Sartorius BSA124S)百分之一電子天平(METTLER TOLEPO XP26)電加熱套(北京中興偉業(yè)儀器有限公司ZDHW)減壓干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司BluePard)恒溫水浴鍋(北京中興偉業(yè)儀器有限公司DFD-700)超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司KQ-300DB)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠RE-5205)循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司SHB-III)

1.2 材料 鹽酸麻黃堿對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號：171241-201007，供含量測定)，鹽酸偽麻黃堿對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號：171237-201208，供含量測定)；甲醇(色譜純)，三乙胺(分析純)，二正丁胺(分析純)，磷酸(分析純)，蒸餾水；實驗用飲片均委托北京康仁堂藥業(yè)有限公司購買，并經(jīng)過檢測符合藥典標(biāo)準(zhǔn)，其中細(xì)辛鑒定為北細(xì)辛，辛夷鑒定為武當(dāng)玉蘭。

2 方法

2.1 提取設(shè)計 雙辛鼻鼽散方中炙麻黃開腠理外解太陽表寒；細(xì)辛辛溫雄烈走竄，可溫少陰，佐麻黃解表散寒，配辛夷祛風(fēng)通竅；辛夷發(fā)散風(fēng)寒，通竅，與細(xì)辛組成本方主藥“雙辛”；黃芪益氣固表，補益肺脾，使麻黃細(xì)辛外散寒邪之時，正氣充足而不外亡，同時氣足表固而防風(fēng)寒之邪再度侵襲；黃芩清解少陽郁熱；川芎祛風(fēng)止痛，亦入少陽，辛溫香燥，走而不守，上行可達(dá)顛頂，又入血分，活血而助氣行，川芎還為辛夷的使藥，有助其宣通鼻竅的作用；防風(fēng)增強黃芪益氣固表之用，也可助麻黃細(xì)辛祛除風(fēng)邪。諸藥合用，肺脾氣固，風(fēng)寒外散，郁熱得清，標(biāo)本兼顧，邪難再侵。

方中細(xì)辛、辛夷和川芎共同發(fā)揮通竅作用，均以辛散為特性，對其化學(xué)成分而言，其揮發(fā)油能更好地體現(xiàn)其辛散的特性，現(xiàn)代藥理學(xué)也證明了3者的揮發(fā)油對過敏性鼻炎有顯著的藥理作用：如梁少瑜等發(fā)現(xiàn)細(xì)辛揮發(fā)油能有效緩解過敏性鼻炎的局部癥狀，降低血液組胺含量，改善鼻黏膜炎性反應(yīng)的局部浸潤[3]；李小莉等對辛夷揮發(fā)油進(jìn)行了抗過敏研究，表明其具有較強的抗過敏作用[4]；李俊川考察了辛夷揮發(fā)油對小鼠I型超敏反映的影響，確定其作用機制可能與抗組胺以及一直血清IgE水平有關(guān)[5]；盛艷梅利用川芎揮發(fā)油對大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞體外存活及腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用進(jìn)行了研究，驗證了川芎的活血行氣功效，有助于宣通鼻竅；楊金蓉等通過研究發(fā)現(xiàn)川芎揮發(fā)油具有明顯的解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎作用，且其解熱機理與降低下丘腦PGE2含量有關(guān)[6]。因此在對雙辛鼻鼽散提取工藝設(shè)計時確定對3味藥采取提取揮發(fā)油。

方中黃芩主要發(fā)揮清解少陽郁熱的功效，其發(fā)揮解熱作用的主要物質(zhì)為黃芩苷、黃芩素等黃酮類物質(zhì)，孟慶剛等對黃芩解熱作用的譜效關(guān)系進(jìn)行研究，利用灰關(guān)聯(lián)分析初步說明黃芩苷、黃芩素是黃芩解熱作用的中藥物質(zhì)基礎(chǔ)[7]。對不同來源黃芩醇提物和水提物抗炎作用比較研究，發(fā)現(xiàn)黃芩醇提物較水提物表現(xiàn)較好抑制炎性反應(yīng)作用。因此確定對黃芩采取醇提工藝，并借鑒朱玉等研究成果，確定了黃芩醇提工藝。

同時根據(jù)傳統(tǒng)湯劑的特點，考量了炙麻黃、黃芪及防風(fēng)的化學(xué)成分特點及在復(fù)方中的功效，確定了對該3味藥進(jìn)行水提。

2.2 揮發(fā)油提取工藝研究

2.2.1 揮發(fā)油收集 對雙辛鼻鼽散中的細(xì)辛、辛夷和川芎進(jìn)行揮發(fā)油提取，按照《中華人民共和國藥典》(2015年版，四部通則2204甲法)進(jìn)行揮發(fā)油收集及揮發(fā)油收率計算[8]。

2.2.2 正交設(shè)計試驗 根據(jù)預(yù)實驗情況確定以提取加水量、煎煮時間為考查因素，以揮發(fā)油收率為評價指標(biāo)，確定最佳提取工藝。因素水平見表1。

表1 揮發(fā)油提取實驗因素水平表

按處方量稱取細(xì)辛、辛夷和川芎，共計9組18份，約230.0 g/份，浸泡30 min，按照正交表的實驗安排進(jìn)行實驗，記錄揮發(fā)油的提取量(mL)，并利用SPSS軟件對試驗結(jié)果進(jìn)行分析，確定影響因素的顯著性和最優(yōu)組合。

2.3 水提工藝研究

2.3.1 含量測定 對雙辛鼻鼽散中的炙麻黃、黃芪和防風(fēng)進(jìn)行水提，藥材及提取液的有效成分(麻黃堿與偽麻黃堿)的含量測定方法按照《中華人民共和國藥典》(2015年版，一部麻黃項下)進(jìn)行測定[8]。

2.3.2 出膏率的測定 收集提取液，將提取液定容至一定體積，精密量取100 mL置于恒定的蒸發(fā)皿中，在水浴蒸干后，于105 ℃干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定重量，計算出膏率。

2.3.3 正交設(shè)計試驗 根據(jù)預(yù)實驗情況確定以提取加水量、煎煮時間和煎煮次數(shù)為考查因素，綜合考慮出膏率、鹽酸麻黃堿與鹽酸偽麻黃堿的含量，確定最佳提取工藝。見表2。

表2 水提工藝實驗因素水平表

按處方量稱取炙麻黃、黃芪和防風(fēng)，共計9組18份，約120.0 g/份，浸泡30 min，按照正交表的實驗安排進(jìn)行實驗，測定出膏率和鹽酸麻黃堿與鹽酸偽麻黃堿含量，并利用SPSS軟件對試驗結(jié)果進(jìn)行分析，確定影響因素的顯著性和最優(yōu)組合。

2.4 醇提工藝研究 參考文獻(xiàn)方法，對黃芩常用方法進(jìn)行統(tǒng)計，并結(jié)合傳統(tǒng)湯劑的特點，確定提取溶媒的濃度及方法。

3 結(jié)果

3.1 揮發(fā)油提取工藝研究 將測定結(jié)果帶入正交設(shè)計表，利用SPSS軟件對試驗結(jié)果進(jìn)行分析，確定了影響因素的顯著性和最優(yōu)組合，以SNK進(jìn)行確定的最優(yōu)組合為：加水10倍量，提取6 h。實驗結(jié)果與方差分析見表3、4、5。結(jié)合水提液后續(xù)濃縮時效性確定揮發(fā)油最優(yōu)提取條件為溶劑量10倍水，提取6 h。

表3 揮發(fā)油提取正交試驗及結(jié)果表

3.2 水提工藝研究 將測定結(jié)果帶入正交設(shè)計表，利用SPSS軟件對試驗結(jié)果進(jìn)行分析，確定影響因素的顯著性和最優(yōu)組合：若以出膏率為考察指標(biāo)影響其提取效率的顯著因素是提取時間和提取次數(shù)，SNK確定的最佳提取條件為溶劑量8倍，提取3次，1 h/次；若以鹽酸麻黃堿與鹽酸偽麻黃堿含量為考察指標(biāo)，對水提影響作用顯著的因素是提取時間，SNK確定的最佳提取條件為溶劑量8倍/12倍，提取3次，提取時間分別為2 h/1 h/1 h；綜合出膏率和鹽酸麻黃堿與鹽酸偽麻黃堿含量，同時考慮到水提藥味中黃芪主要成分毛蕊異黃酮葡萄糖苷的熱不穩(wěn)定性，最終水提條件為溶劑量8倍，提取3次，1 h/次。實驗結(jié)果與方差分析見表6～表10。

表4揮發(fā)油提取主體間效應(yīng)的檢驗

因變量：提油量

源III型平方和df均方FSig.校正模型0.664*80.08311.5000.001截距95.681195.68113248.0770.000加水量0.05420.0273.7690.065提取時間0.53420.26737.0000.000加水量*提取時間0.07640.0192.6150.106誤差0.06590.007總計96.41018校正的總計0.72917

注：*R方=0.911(調(diào)整R方=0.832)

表5 揮發(fā)油提取Student-Newman-Keuls分析

注：已顯示同類子集中的組均值?；谟^測到的均值。誤差項為均值方(錯誤)=0.007。a.使用調(diào)和均值樣本大小=6.000，b.Alpha=0.05

表6 水提工藝正交試驗及結(jié)果表

3.3 醇提工藝研究 對于黃芩的醇提研究較多，趙越平[9]采用75%乙醇進(jìn)行提取，唐海燕[10]研究認(rèn)為50%乙醇出膏率最高，60%乙醇黃芩苷得率最高，朱玉[11]在前人的研究基礎(chǔ)上，增加了對提取時間、提取次數(shù)的考察，并綜合考慮了黃芩苷提取率和干膏率，對黃芩醇提研究更全面，于良富[12]也對黃芩的回流提取進(jìn)行了考察，同時結(jié)合實際生產(chǎn)，確認(rèn)了采用50%乙醇提取黃芩效果較好。同時，本方為臨床效驗方，多采用水提，黃芩發(fā)揮作用的物質(zhì)不僅僅是黃芩苷，為了兼顧其中的水溶性成分，所以黃芩的醇提采用50%乙醇，該處理更適合其發(fā)揮臨床效用。因此，雙辛鼻鼽散中的黃芩進(jìn)行醇提，醇提方法采用朱玉的方法，即：50%乙醇提取，提取3次，溶劑量分別為12倍/10倍/8倍，1.5 h/次。

表7 水提工藝主體間效應(yīng)的檢驗(收膏率)因變量：收膏率

注：*R方=0.994(調(diào)整R方=0.990)

表8 水提工藝Student-Newman-Keuls分析(出膏率)

注：已顯示同類子集中的組均值?；谟^測到的均值。誤差項為均值方(錯誤)=0.282,a.使用調(diào)和均值樣本大小=6.000，b.Alpha=0.05

4 討論

有效成分的轉(zhuǎn)移對工藝評價很重要，在篩選水提考察指標(biāo)時充分考慮了考察指標(biāo)含量高低、前處理的復(fù)雜程度和處方中的作用。《中華人民共和國藥典》(2015年版1部)關(guān)于炙麻黃、黃芪和防風(fēng)的含量檢測規(guī)定：炙麻黃測定鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿，采用超聲前處理，藥材含量限度規(guī)定不得低于少于0.80%；黃芪測定黃芪甲苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷，黃芪甲苷采用正丁醇萃取并過柱處理，毛蕊異黃酮葡萄糖苷采用熱回流4 h，其藥材中限量規(guī)定黃芪甲苷不低于0.040%，毛蕊異黃酮葡萄糖苷不低于0.020%；防風(fēng)測定升麻苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷，采用酸水解，其藥材限量規(guī)定兩者總量不低于0.24%；其中黃芪2個指標(biāo)成分均低于0.1%，提取過程和前處理過程中的誤差對于結(jié)果的影響較大，且其前處理復(fù)雜，升麻苷與5-O-甲基維斯阿米醇苷需酸水解，前處理復(fù)雜，炙麻黃在方中為君藥，能開腠理宣肺氣解太陽表寒，綜合指標(biāo)成分高低確定水提工藝考察指標(biāo)為鹽酸麻黃堿與鹽酸偽麻黃。

本研究遵從各藥味在復(fù)方中君臣佐使的作用及特點，充分發(fā)揮了藥物特性，保證了雙辛鼻鼽散的作用效果。

表9水提工藝主體間效應(yīng)的檢驗(鹽酸麻黃堿與鹽酸偽麻黃堿含量)因變量：麻黃含測

源III型平方和df均方FSig.校正模型0.125*60.0215.9680.005截距7.57817.5782177.2890.000加水量0.02720.0133.8250.055提取時間0.08720.04412.5040.001提取次數(shù)0.01120.0051.5740.250誤差0.038110.003總計7.74118校正的總計0.16317

注：*R方=0.765(調(diào)整R方=0.637)

表10 水提工藝Student-Newman-Keuls分析(鹽酸麻黃堿與鹽酸偽麻黃堿含量)

注：已顯示同類子集中的組均值?；谟^測到的均值。誤差項為均值方(錯誤)=0.003，a.使用調(diào)和均值樣本大小=6.000，b.Alpha=0.05

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ExtractionofShuangxinbiqiuPowder

Shen Jianmei1,2, Sun Na1,2, Du Weibo2, Chen Jingran2, Wang Xueqian3, Zhao Yan3,Kong Hui3, Qu Huihua4

(1CollegeofChineseMedicine,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China; 2BeijingTcmagesPharmaceuticalCo.LTD,Beijing101300,China; 3BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China; 4BeijingInstituteoftraditionalChineseMedicine，BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China)

Objective:To sort out the best method for the extraction of Shuangxinbiqiu powder.MethodsAccording to the pharmacological action of various ingredients in Shuangxinbiqiu powder, different extraction process were adopted, which included volatile oil extraction, aqueous extraction and alcohol extraction. The extraction technology was optimized by orthogonal test, using oil-extraction ratio as index of volatile oil extraction, using the contents of ephedrine hydrochloride and pseudoephedrine hydrochloride, dry extract yield as indexes of aqueous extraction, and using the content of baicalin, dry extract yield as indexes of alcohol extraction.ResultsThe optimum volatile oil extraction parameters were as follows:10 times of distilled water, decocting for 6 h. The optimum aqueous extraction parameters were as follows:8 times of distilled water, reflux extraction 3 times and 1 h each time. The optimum alcohol extraction parameters were 12, 10 and 8 times volume of 50% alcohol in turn and 1.5 h every time.ConclusionThe method complied with the rule of each drugs in prescription of Shuangxinbiqiu powder, fully performed the characteristics of the compound and ensured the pharmacological effect.

Anaphylactic rhintis; Shuangxinbiqiu powder; Volatile oil extraction; Aqueous extraction; Alcohol extraction

十病十藥研發(fā)-雙辛鼻鼽散治療過敏性鼻炎的成藥性研究(Z151100003815017)；雙辛鼻鼽散成藥性研究(201007212009)

沈建梅(1985.03—)，女，在職研究生，制藥工程師，研發(fā)主管，檢測技術(shù)及中藥的現(xiàn)代制劑研究，E-mail：382941928@qq.com

屈會化(1966.09—)，男，博士，副研究員，碩士研究生導(dǎo)師，中藥小分子單克隆抗體技術(shù)和質(zhì)量控制，E-mail：quhuihua@163.com

R284

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.10.049

(2016-09-19收稿 責(zé)任編輯：徐穎)