吳 瓊 張淑靜 張宇晨 邢恩龍 楊傲然 胡京紅 葛東宇 黃 翔 田 昕

(1 北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京，100029； 2 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京康復(fù)醫(yī)院，北京，100144)

實(shí)驗(yàn)研究

參知健腦方對(duì)缺氧致認(rèn)知功能障礙大鼠腦線粒體損傷的保護(hù)機(jī)制研究

吳 瓊1張淑靜1張宇晨1邢恩龍1楊傲然2胡京紅1葛東宇1黃 翔1田 昕1

(1 北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京，100029； 2 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京康復(fù)醫(yī)院，北京，100144)

目的：從線粒體角度觀察參知健腦方對(duì)缺氧致認(rèn)知功能障礙大鼠線粒體損傷的保護(hù)機(jī)制的研究。方法：將老年大鼠隨機(jī)分為3組，建立缺氧致線粒體損傷的認(rèn)知功能障礙模型組以及參知健腦方(SZJ)干預(yù)組，并用Morris水迷宮對(duì)大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力進(jìn)行檢測。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測線粒體細(xì)胞色素氧化酶(COX)的活性、8羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)、β-淀粉樣前體蛋白(βAPP)及β-淀粉樣蛋白(Aβ1-42)的含量，觀察4個(gè)指標(biāo)與認(rèn)知功能障礙之間的關(guān)聯(lián)性，進(jìn)而觀察缺氧對(duì)模型組腦線粒體的影響及SZJ干預(yù)組對(duì)腦線粒體的保護(hù)作用。結(jié)果：持續(xù)低壓缺氧造模腦組織中APP、Aβ1-42含量模型組與正常組、SZJ干預(yù)組間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，8-OHdG含量模型組與正常組、SZJ干預(yù)組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，SZJ干預(yù)組與正常組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，COX含量正常組與模型組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)、模型組與SZJ干預(yù)組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：參知健腦方可以抑制APP、Aβ1-42的積累、DNA氧化損傷、增強(qiáng)腦線粒體COX的活性，從而保護(hù)線粒體發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，進(jìn)一步改善缺氧對(duì)認(rèn)知功能障礙學(xué)習(xí)記憶能力的影響為參知健腦方的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)支持。

認(rèn)知功能障礙；缺氧；線粒體；參知健腦方

認(rèn)知功能障礙(Cognitive Impairment，CI)是指認(rèn)知功能受到不同程度的損害狀態(tài)，重者如各種類型癡呆，輕者如輕度CI等。CI在中醫(yī)文獻(xiàn)中無專門記載，但依據(jù)其臨床表現(xiàn)如記憶力下降等，可歸屬于中醫(yī)學(xué)的“癡呆”“健忘”“善忘”“呆病”等病癥范疇。癡呆病位在腦，毒邪內(nèi)停為標(biāo)，正氣虧虛為本，其基本病機(jī)是本虛標(biāo)實(shí)、虛實(shí)夾雜。治療上應(yīng)以“未病先防，既病防變”的觀點(diǎn)為指導(dǎo)，采用扶正解毒的治則，應(yīng)用具有益氣養(yǎng)血、滋陰清熱功效的中藥復(fù)方參知健腦方(SZJ)[1]。

缺氧時(shí)，線粒體呼吸鏈電子傳遞及氧化磷酸化發(fā)生障礙，進(jìn)而導(dǎo)致電子傳遞鏈上酶活性抑制，ATP合成減少、自由基產(chǎn)生增多等多種途徑損害細(xì)胞，致神經(jīng)元壞死或凋亡而出現(xiàn)臨床認(rèn)知功能下降表現(xiàn)[2]。前期實(shí)驗(yàn)研究表明參知健腦方可明顯改善Aβ所誘導(dǎo)的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株的神經(jīng)毒性[3]，并能有效的改善AD大鼠模型的行為學(xué)。本研究將在既往研究基礎(chǔ)上通過缺氧建立CI大鼠模型，觀察SZJ對(duì)缺氧致CI模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力、線粒體細(xì)胞色素氧化酶(COX)的活性、β-淀粉樣前體蛋白(βAPP)、β-淀粉樣蛋白(Aβ1-42)的含量以及8羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)為標(biāo)記物檢測線粒體DNA損傷。本實(shí)驗(yàn)將從線粒體角度進(jìn)一步觀察參知健腦方對(duì)缺氧致CI大鼠線粒體損傷的保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 健康老年雌性SD大鼠，11～13月齡，購自軍事科學(xué)院，許可證書號(hào)：SCXK(軍)2012-0004。本實(shí)驗(yàn)過程均遵守美國國立衛(wèi)生院倡導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物關(guān)懷和使用指導(dǎo)原則，即以減少(Reduction)、替代(Replacement)和優(yōu)化(Refinement)為核心的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)“3R”原則。動(dòng)物飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室，溫度22 ℃，相對(duì)濕度55%～70%，自由進(jìn)食飲水。

1.1.2 藥物 參知健腦方(SZJ)組分：人參、知母、赤芍，以上生藥均由北京同仁堂醫(yī)藥有限責(zé)任公司提供。全方由人參、知母、赤芍3味中藥組成，根據(jù)課題前期細(xì)胞部分[4]通過正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)篩選出的最佳配比為人參：知母：赤芍=2∶2∶1。

1.1.3 試劑與儀器 組織線粒體分離試劑盒C3606(碧云天，中國)、蛋白質(zhì)定量試劑盒(BCA法)購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司。大鼠β淀粉樣蛋白1-42(Aβ1-42)、大鼠淀粉樣前體蛋白(βAPP)、大鼠8羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)、大鼠細(xì)胞色素氧化酶(COX)ELISA Kit均購自CUSABIO，中國。普通氮?dú)庥杀本┦醒趵麃砜萍及l(fā)展有限公司提供。小白鼠缺氧裝置XBS-02改裝版由杭州艾普儀器設(shè)備有限公司提供，Morris水迷宮行為學(xué)自動(dòng)觀察析系統(tǒng)(淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司)。電動(dòng)玻璃均漿機(jī)DY89-Ⅱ(寧波新芝生物科技股份有限公司)；高速冷凍離心機(jī)(Thermo，美國)，MK3型酶標(biāo)儀(Thermo，美國)，臺(tái)式恒溫振蕩器(江蘇太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠)；小功率超聲破碎儀(Sonics，美國)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將36只健康老年雌性SD大鼠隨機(jī)分為3組，每組12只，分別是正常組、模型組、SZJ干預(yù)組。正常組(n=12)，在正常環(huán)境中以普通飼料、飲水飼養(yǎng)8周，每天加與SZJ干預(yù)組等體積的生理鹽水灌胃；模型組(n=12)，每日持續(xù)低壓缺氧7 h，以普通飼料、飲水飼養(yǎng)8周，加與SZJ干預(yù)組等體積的生理鹽水。實(shí)驗(yàn)期間模型組每天進(jìn)入持續(xù)低壓缺氧艙7 h，向缺氧艙內(nèi)循環(huán)充入氮?dú)?，每次循環(huán)為8 min，通過控氧儀監(jiān)測缺氧艙內(nèi)的氧濃度以控制輸氣和排氣裝置，使每一次循環(huán)缺氧倉內(nèi)氧濃度控制在8%～10%之間進(jìn)行直接缺氧造模[5]。SZJ干預(yù)組(n=12)，每日在造模前按體重灌胃中藥液(SZJ)，其余同模型組。干預(yù)組(n=12)，每日在造模前按體重灌胃中藥液(SZJ)，其余同模型組。

1.2.2 給藥方法 SZJ全方由人參、知母、赤芍3味中藥組成，根據(jù)課題前期細(xì)胞部分[4]通過正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)篩選出的最佳配比為人參：知母：赤芍=2∶2∶1，即人參24 g、知母24 g、赤芍12 g，相當(dāng)于生藥2.45 g/(kg·d)據(jù)此計(jì)算出大鼠每天的灌胃量。

1.2.3 檢測指標(biāo)與方法 用Morris水迷宮對(duì)大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力進(jìn)行檢測。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測線粒體細(xì)胞色素氧化酶(COX)的活性、8羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)、β-淀粉樣前體蛋白(βAPP)及β-淀粉樣蛋白(Aβ1-42)的含量，觀察4個(gè)指標(biāo)與CI之間的關(guān)聯(lián)性，進(jìn)而觀察缺氧對(duì)模型組腦線粒體的影響及SZJ干預(yù)組對(duì)腦線粒體的保護(hù)作用。

1.2.4 大鼠體質(zhì)量及學(xué)習(xí)記憶能力的檢測 造模周期為8周，每天測量1次體重，觀察大鼠體重的變化。分別在造模的第2、4、6、8周進(jìn)行Morris水迷宮檢測大鼠的認(rèn)知功能，評(píng)價(jià)其學(xué)習(xí)記憶能力。Morris水迷宮裝置為一直徑為120 cm，高約70 cm的圓形桶，將第3象限設(shè)置為目標(biāo)象限(Target Quadrant)在距離圓心15 cm處放置一直徑10 cm高30 cm的圓柱，此處為逃生目標(biāo)區(qū)，液面在圓柱上2 cm。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間其位置保持不變。訓(xùn)練時(shí)水溫保持在(21±1)°C左右[6]。實(shí)驗(yàn)過程中水池及周圍環(huán)境保持不變。圓形桶上方150 cm處固定一攝像機(jī)全程記錄動(dòng)物運(yùn)動(dòng)軌跡。定位航行實(shí)驗(yàn)(Place Navigation)大鼠連續(xù)訓(xùn)練5 d，每次實(shí)驗(yàn)大鼠在4個(gè)不同象限中將頭朝池壁放入水池，每天次序不同，任其游泳，直至找到平臺(tái)?？臻g探索實(shí)驗(yàn)(Spatial Probe)實(shí)驗(yàn)第6天進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，撤去平臺(tái)，將大鼠從任意一個(gè)入水點(diǎn)放入水中，記錄其在2 min內(nèi)游泳的軌跡，計(jì)算其跨越目標(biāo)象限內(nèi)的“原平臺(tái)象限游泳時(shí)間/總時(shí)間、穿越平臺(tái)次數(shù)”此實(shí)驗(yàn)反映大鼠的空間定向能力。

1.2.5 大鼠腦組織中線粒體提取 采用組織線粒體分離試劑盒C3606(碧云天，中國)分離出組織線粒體，嚴(yán)格按照說明書操作。第八周行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后迅速斷頭取腦，在預(yù)先紫外滅菌、消毒的超凈臺(tái)內(nèi)，冰上取腦，完整剝離腦組織后，將雙側(cè)海馬、皮質(zhì)取出稱重。用PBS洗滌組織1次，加入分離試劑A(1 mg/10 μg)，在冰浴上進(jìn)行勻漿，勻漿10次左右，把勻漿在1 000 g、4 ℃離心5 min，小心把上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中，在3 500 g，4 ℃離心10 min，小心去除上清，沉淀即為分離得到的線粒體，加入適量線粒體儲(chǔ)存液重懸線粒體，通常每100 mg組織獲得的線粒體可以用40 μL相應(yīng)的線粒體儲(chǔ)存液重懸。將分離好的組織線粒體放入-80 ℃冰箱保存，待測。

1.2.6 裂解組織提取蛋白及該蛋白濃度的測定 取出分離了好的線粒體進(jìn)行組織裂解提取蛋白，11 000 r/min，4 ℃離心10 min，取沉淀去上清，加入Nacl重懸，超聲破碎5次，10 s/次，計(jì)時(shí)30 min每隔5 min震蕩1次，10 000 r/min，4 ℃離心10 min取上清待用。用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定線粒體中的蛋白濃度，嚴(yán)格按照說明書操作并計(jì)算濃度。

1.2.7 大鼠腦線粒體APP、Aβ1-42、COX的含量和8-OHdG損傷的檢測 將組織裂解提取出來的線粒體蛋白用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)雙抗體夾心法測定COX、8-OHdG的含量。在大鼠APP、Aβ1-42、COX、8-OHdG抗體包被的微孔中分別加入含APP、Aβ1-42、COX、8-OHdG的標(biāo)準(zhǔn)品和樣品，與辣根過氧化物酶標(biāo)記的APP、Aβ1-42、COX、8-OHdG抗體結(jié)合形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，溫育、洗滌、徹底洗滌后甲基聯(lián)苯胺(TMB)顯色，在反應(yīng)終止前5 min內(nèi)用酶標(biāo)儀在450 nm波長依序測量各孔的光密度(OD值)。使用專業(yè)制作曲線軟件Curve Expert1.3進(jìn)行分析，計(jì)算出樣本濃度。

2 結(jié)果

2.1 大鼠體質(zhì)量變化 如圖1所示，在偶數(shù)周時(shí)進(jìn)行水迷宮測試，故正常組大鼠的體重程現(xiàn)上下波動(dòng)周期規(guī)律。模型組、SZJ干預(yù)組大鼠體重在偶數(shù)周時(shí)下降的明顯，與偶數(shù)周進(jìn)行行為學(xué)檢測體力消耗有關(guān)。進(jìn)行缺氧造模的模型組、SZJ干預(yù)組組大鼠的體重整體呈現(xiàn)降低的趨勢，但SZJ干預(yù)組下降趨勢較模型組緩和。在第七周時(shí)SZJ干預(yù)組組大鼠體重明顯回升，而模型組大鼠體重在缺氧狀態(tài)下持續(xù)降低。

圖1 大鼠體重監(jiān)測趨勢

2.2 大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的檢測 持續(xù)低壓缺氧造模第八周時(shí)空間探索環(huán)節(jié)中原平臺(tái)象限游泳時(shí)間/總時(shí)間與穿越平臺(tái)次數(shù)比較來測評(píng)大鼠的空間記憶能力。見表1。模型組與正常組、SZJ干預(yù)組間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，可作為缺氧致大鼠CI的模型，SZJ干預(yù)組與正常組組間比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 空間探索原平臺(tái)象限游泳時(shí)間/總時(shí)間、穿越平臺(tái)次數(shù)比較

注：與正常組比較，*P<0.05，與模型組比較，△P<0.05

2.3 大鼠APP、Aβ1-42、COX、8-OHdG的表達(dá)檢測 持續(xù)低壓缺氧造模腦組織中APP、Aβ1-42含量濃度/腦組織蛋白濃度比較，模型組與正常組、SZJ干預(yù)組間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表2。

表2 腦組織中Aβ1-42含量濃度/腦組織蛋白濃度腦組織中APP含量濃度/腦組織蛋白濃度

注：與正常組比較**P<0.01，與模型組比較，△△P<0.01

持續(xù)低壓缺氧造模腦組織中8-OHDG含量濃度/腦組織蛋白濃度模型組與正常組、SZJ干預(yù)組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，SZJ干預(yù)組與正常組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，COX含量濃度/腦組織蛋白濃度正常組與模型組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)、模型組與SZJ干預(yù)組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 腦組織中8-OHDG、COX含量濃度/腦組織蛋白濃度

注：與模型組比較，△P<0.05，與正常組比較**P<0.01，與模型組比較，▲▲P<0.01

3 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，氣是構(gòu)成、維持人體生命活動(dòng)最基本的物質(zhì)，隨著年齡的增長，老年人陽氣逐漸衰敗，氣的推動(dòng)、防御、營養(yǎng)、溫煦作用減弱。物質(zhì)代謝速度減慢，體內(nèi)產(chǎn)生瘀血、痰濕等病理產(chǎn)物，阻礙了人體的正常生理功能?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》中有“陽氣者，精則養(yǎng)神”，而氣虛會(huì)導(dǎo)致元神失養(yǎng)，神不能外馭五官九竅和機(jī)體，最終形成老年癡呆[7]。MCI為本虛標(biāo)實(shí)之證，在腎、心、脾3臟虛損的基礎(chǔ)上，兼有痰、瘀等實(shí)邪[8]。SZJ由人參、赤芍、知母組成，人參，益氣健脾，調(diào)神益智，補(bǔ)充人體之精氣可增后天之源，在此用以扶正。根據(jù)中藥治療老年癡呆病的用藥頻次歸納分析可知中藥功效檢索分類中排在第一位的是人參現(xiàn)代研究表明人參皂苷能有效改善AD動(dòng)物的認(rèn)知能力、Aβ誘導(dǎo)細(xì)胞毒性和氧化應(yīng)激水平[9-10]。芍藥，清熱涼血、散瘀止痛，在此用以散瘀涼血通腦絡(luò)，現(xiàn)代研究表明芍藥苷能改善AD大鼠的行為學(xué)和腦線粒體復(fù)合酶活性[11]，降低氧化應(yīng)激水平對(duì)AD大鼠發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[12]。知母，清熱瀉火、滋陰潤燥，在此用以清熱以祛毒，現(xiàn)代研究表明知母皂苷能顯著的改善Aβ誘導(dǎo)的癡呆大鼠的學(xué)習(xí)和記憶功能力[13]。本課題前期實(shí)驗(yàn)細(xì)胞部分證實(shí)參知健腦方組分能有效的保護(hù)缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，改善線粒體DNA損傷，抑制毒性線粒體Aβ積累[4]。

AD與氧化應(yīng)激密切相關(guān)，這一點(diǎn)已經(jīng)毋庸置疑[14]，已知氧化應(yīng)激的產(chǎn)生是由于活性氧的產(chǎn)生過多超出了其消除能力所致，而在眾多細(xì)胞器中，線粒體是活性氧產(chǎn)生的主要位點(diǎn)，超過90%的活性氧產(chǎn)生于線粒體，其中線粒體電子傳遞鏈的復(fù)合體Ⅰ和復(fù)合體Ⅲ是活性氧產(chǎn)生的主要位點(diǎn)，故而線粒體特別易受氧化應(yīng)激的損傷。另外，從一些研究報(bào)道[15-16]可知，Aβ與磷酸化的Tau蛋白作為AD的重要病理特征，其在增加活性氧的產(chǎn)生，提高AD的氧化應(yīng)激水平也發(fā)揮了作用?？紤]到Aβ和磷酸化的Tau蛋白可以直接引起線粒體功能障礙，從以上兩點(diǎn)很容易懷疑氧化應(yīng)激可以引起線粒體功能障礙，氧化應(yīng)激使蛋白、脂質(zhì)和核酸過氧化[17]。氧化應(yīng)激除了引起mtDNA和線粒體能量代謝相關(guān)的損傷，也引起了線粒體動(dòng)力學(xué)相關(guān)的損傷[18]。由于氧化應(yīng)激對(duì)線粒體各方面的損傷作用，故而可知氧化應(yīng)激確實(shí)可以導(dǎo)致線粒體功能障礙。mtDNA易受到活性氧的損傷，損傷的mtDNA主要表現(xiàn)為mtDNA點(diǎn)突變、缺失及同源異型性或異質(zhì)性改變[19]。研究[20-21]認(rèn)為mtDNA的突變與老化密切相關(guān)，mtDNA與CI也有著密切關(guān)系。

本實(shí)驗(yàn)為避免藥物因素對(duì)缺氧致CI模型的干擾選取自然衰老的老年鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。實(shí)驗(yàn)中制造缺氧的老年動(dòng)物模型，可造成大鼠的體重持續(xù)緩和下降，水迷宮空間探索顯示持續(xù)低壓缺氧可造成空間記憶能力受損傷，而SZJ可從多靶點(diǎn)發(fā)揮對(duì)線粒體的保護(hù)機(jī)制，改善空間記憶能力。老齡動(dòng)物腦組織內(nèi)可出現(xiàn)淀粉樣斑塊以及學(xué)習(xí)記憶衰退[22]。大量體外實(shí)驗(yàn)表明Aβ主要通過線粒體途徑引起神經(jīng)元凋亡[23]。不論是在體內(nèi)還是體外，Aβ神經(jīng)毒引起的死亡和誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡都已經(jīng)被證實(shí)[24]。而本實(shí)驗(yàn)中持續(xù)缺氧導(dǎo)致APP、Aβ1-42含量增多，而過度表達(dá)的APP會(huì)影響線粒體蛋白輸運(yùn)通道的正常運(yùn)行，從而導(dǎo)致線粒體功能紊亂。其中在Aβ的神經(jīng)毒性中占據(jù)主導(dǎo)地位[25]的Aβ1-42，在缺氧時(shí)刺激線粒體膜并導(dǎo)致其通透性增加，位于線粒體膜內(nèi)的細(xì)胞色素C釋放到細(xì)胞質(zhì)中，作為細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子，促使神經(jīng)元細(xì)胞凋亡導(dǎo)致大鼠則出現(xiàn)一系列的CI。8-羥基脫氧鳥苷作為DNA氧化損傷產(chǎn)物是廣泛用于研究疾病中氧化損傷機(jī)制的關(guān)鍵標(biāo)志物[26]，缺氧導(dǎo)致8-OHdG產(chǎn)量增多即氧化損傷產(chǎn)物增多，造成mtDNA缺失或突變，缺氧產(chǎn)生的8-OHdG越多對(duì)大鼠的認(rèn)知功能影響越大。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)研究表明SZJ可以抑制APP、Aβ1-42的積累，增強(qiáng)線粒體細(xì)胞色素氧化酶(COX)的活性并減緩DNA氧化損傷，從而發(fā)揮對(duì)線粒體的作用，進(jìn)一步改善缺氧對(duì)CI學(xué)習(xí)記憶能力的影響，為SZJ的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)支持，為中藥治療CI提供了新思路。SZJ對(duì)缺氧模型線粒體雖有一定保護(hù)的作用，但是對(duì)于缺氧造成的氧化損傷的保護(hù)作用不明顯，說明缺氧致mtDNA缺失或突變可能是不可逆的，SZJ能否從多靶點(diǎn)改善線粒體DNA的損傷及其機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

[1]楊傲然，范吉平，田昕.參知健腦片治療阿爾茨海默病的作用機(jī)制探討[J].遼寧中醫(yī)雜志，2006，33(10):1258-1259.

[2]Mattson MP，Gleichmann M，Cheng A.Mitochondria in neuroplasticity and neurological disorders[J].Neuron，2008，60(5):748-766.

[3]鐘華，楊傲然，王寶見，等.參知健腦片組分對(duì)β淀粉樣蛋白致SH—SY5Y細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用[J].山東醫(yī)藥，2009，49(31):22-24.

[4]牛美英，和欣，胡京紅，等.參知健腦方組分對(duì)缺氧SH-SY5Y細(xì)胞的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制研究[J].湖北中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，18(3):1-4.

[5]王紅陽.間歇低氧對(duì)大鼠認(rèn)知功能和p38MAPK/神經(jīng)細(xì)胞凋亡通路影響[D].天津：天津醫(yī)科大學(xué)，2011，10-12.

[6]Charles V Vorhees，Michael T Williams.Morris water maze：procedures for assessing spatial and related foms of learning and memory[J].Nature Protocols，2006，1(2):848-858.

[7]王玉璧，郭蕾，竇志芳，等.關(guān)于老年癡呆病的中醫(yī)病因病機(jī)探討[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2011，29(4):743-745.

[8]牛智領(lǐng)，牛好敏，劉遠(yuǎn)洪，等.天智顆粒治療缺血性腦小血管病輕度認(rèn)知障礙的效果觀察[J].中國醫(yī)藥，2014,9(7)：986-988.

[9]Liu JF，Yan XD，Qi LS，et al.Ginsenoside Rd attenuates Aβ25-35 induced oxidative stress and apoptosis in primary cultured hippocampal neurons[J].Chem Biol，2015(239):12-18.

[10]Ong WY，F(xiàn)arooqui T，Koh HL，et al.Protective effects of ginseng on neurological disorders[J].Front Aging Neurosci，2015，16(7):129.

[11]Zhou J，Zhou L，Hou D，et al.Paeonol increases levels of cortical cytochrome oxidase and vascular actin and improves behavior in a rat model of Alzheimer′s disease[J].Brain Res，2011，4(1388):141-147.

[12]Lan Z，Chen L，F(xiàn)u Q，Ji W，et al.Paeoniflorin attenuates amyloid beta peptide induced neurotoxicity by ameliorating oxidative stress and regulating the NGF mediated signaling in rats[J].Brain Res，2013，1(1498):9-19.

[13]陳勤，胡雅兒，夏宗勤.知母皂甙元對(duì)腦內(nèi)注射β-淀粉樣肽癡呆模型大鼠的影響[J].上海第二醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，21(5):401.

[14]Swomley AM，Butterfield DA.Oxidative stress in Alzheimer disease and mild cognitive impairment：evidence from human data provided by redox proteomics[J].Arch Toxicol，2015，89(10)：1669-1680.

[15]Butterfield DA，Swomley AM，Sultana R.Amyloid beta-peptide(1-42)-induced oxidative stress in Alzheimer disease：importance in disease pathogenesis and progression[J].Antioxid Redox Signal，2013，19(8)：823-835.

[16]Naini SM，Soussi-Yanicostas N.Tau Hyperphosphorylation and Oxidative Stress，a Critical Vicious Circle in Neurodegenerative Tauopathies?[J].Oxid Med Cell Longev，2015，2015：151979.

[17]Wang X，Wang W，Li L，et al.Oxidative stress and mitochondrial dysfunction in Alzheimer′s disease[J].Biochim Biophys Acta，2014，1842(8)：1240-1247.

[18]Yan MH，Wang X，Zhu X.Mitochondrial defects and oxidative stress in Alzheimer disease and Parkinson disease[J].Free Radical Biology and Medicine，2013，62：90-101.

[19]Keogh MJ，Chinner y PF.Mitochondrial DNA mutations inneurodegeneration[J].Biochim Biophys Acta，2015，1847(11)：1401-1411.

[20]Pinto M，Moraes CT.Mechanisms linking mtDNA damage and aging[J].Free Radic Biol Med，2015，85：250-258.

[21]Sondheimer N，Zollo O，Van Deerlin V，et al.Analysis of cerebrospinal uid mitochondrial DNA levels in Alzheimer disease[J].Ann Neurol，2014，75(3)：458-460.

[22]徐劍文，俞昌喜.阿爾茨海默病實(shí)驗(yàn)性動(dòng)物模型的研究進(jìn)展[J].國外醫(yī)學(xué)老年醫(yī)學(xué)分冊，2008，29(3)：97-103.

[23]Li NM，Liu QH，Qiao JT，et al.Aβ31-35-induced neuronal apoptosis is mediated by JNK-dependent extrinsic apoptosis pathway[J].Neurosci Bull，2009，25(6):361-366.

[24]汪志剛，戚仁斌，李衛(wèi)，等.α7煙堿樣乙酰膽堿受體拮抗劑減輕淀粉樣β蛋白誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷的機(jī)制研究[J].中國病理生理雜志，2011，27(5):916-922.

[25]RogerN，Rosenberg MD.Translational research on the way to effeetive therapy for Alzheimer disease[J].AichGenPsyehiatry，2005，62(11):1186-1192.

[26]樸恩誼，徐立紅.8-OHdG在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用與研究進(jìn)展[J].中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào)，2012，34(5)：493-499.

StudyontheProtectiveMechanismofShenzhiJiannaoFangonMitochondrialInjuryofRatswithCognitiveImpairmentInducedbyHypoxia

Wu Qiong1, Zhang Shujing1, Zhang Yuchen1, Xing Enlong1, Yang Aoran2, Hu Jinghong1, Ge Dongyu1, Huang Xiang1, Tian Xin1

(1BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijng100029,China; 2BeijingRehabilitationHospitalofCapitalMedicalUniversity,Beijing100144,China)

Objective:To observe the protective mechanism of Shenzhi Jiannao (SZJN) on mitochondrial injury rats with cognitive impairment induced by hypoxia.MethodsThe aged rats were randomly divided into three groups to establish cognitive impairment model groups of mitochondrial injury induced by hypoxia, and SZJN intervention group, and the learning and memory abilities of rats were detected by Morris water maze.ELISA was used to measure the activity of mitochondrial cytochrome oxidase (COX), and contents of 8-OHdG, β-APP and Aβ1-42.The correlation between the 4 indexes and cognitive dysfunction was observed to further observe the effect of hypoxia on the mitochondria of the model group and the protective effect of SZJN intervention group on cerebral mitochondria.ResultsIn brain tissue of models induced by continued hypobaric hypoxia, the contents of APP and Aβ1-42 in model group had significant difference when compared with normal group and SZJN intervention group.The content of 8-OHdG in model group was significantly different when compared with normal group and SZJN intervention group (P<0.01), and that of SZJN intervention group was significantly different when compared with normal group (P<0.05).There was a significantly difference in the content of COX when compared between normal group and model group (P<0.01), and was also significantly different between model group and SZJN intervention group (P<0.05).ConclusionShenzhi Jiannao Fang could inhibit the accumulation of APP, Aβ1-42 and DNA oxidative damage, strengthen the activity of mitochondrial COX, so that can protect the neuroprotective effect of mitochondria to further improve the effect of hypoxia on learning and memory of cognitive impairment, providing experimental support for clinical application of SZJN.

Cognitive impairment; Hypoxia; Mitochondria; Shenzhi Jiannao Fang

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81202684)

吳瓊(1991.03—)，女，醫(yī)學(xué)碩士，醫(yī)師，北京中醫(yī)藥大學(xué)在讀碩士研究生，研究方向：中醫(yī)藥防治心腦血管病的機(jī)制研究，E-mail：772007609@qq.com

田昕(1978.06—)，女，醫(yī)學(xué)博士，副主任醫(yī)師，北京中醫(yī)藥大學(xué)副教授，研究方向：中醫(yī)藥防治心腦血管病的機(jī)制研究，E-mail：tianxin0618@126.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.10.033

(2016-12-25收稿 責(zé)任編輯：徐穎)