吳 桐 張巧麗 姚樹坤

(1 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院,北京,100015； 2 北京市和平里醫(yī)院,北京,100013; 3 中日友好醫(yī)院,北京,100029)

中藥研究

清肝化瘀方質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

吳 桐1張巧麗2姚樹坤3

(1 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院,北京,100015； 2 北京市和平里醫(yī)院,北京,100013; 3 中日友好醫(yī)院,北京,100029)

目的:建立清肝化瘀顆粒的質(zhì)量控制方法。方法:采用薄層色譜法,鑒別黃芩、苦參、半枝蓮、莪術(shù)等組成藥物;采用高效液相色譜法測定方中君藥黃芩、苦參的主要成分黃芩苷及苦參堿的含量。結(jié)果:確立了顆粒中黃芩、苦參、莪術(shù)、半枝蓮的薄層色譜鑒別方法。在選定的高效液相色譜條件下,建立了本顆粒中黃芩苷、苦參堿的測定方法,其方法學(xué)均符合藥典要求。結(jié)論:本實驗建立的鑒別和含量測定方法簡便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好,適用于本顆粒質(zhì)量的控制。

清肝化瘀顆粒;薄層鑒別;黃芩苷;苦參堿;質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

清肝化瘀方由黃芩、苦參、白術(shù)、半枝蓮、白花蛇舌草、莪術(shù)、三棱、甘草等8味中藥組成,是姚樹坤教授治療原發(fā)性肝癌的臨床有效經(jīng)驗方,臨床應(yīng)用具有二十余年歷史。該方具有清熱解毒、健脾祛濕、活血化瘀、軟堅消癥等功效,前期臨床研究及動物實驗表明該方適用于絕大多數(shù)原發(fā)性肝癌患者,具有多環(huán)節(jié)、多靶點的作用特點,能提高患者免疫功能,延長生存期,改善生命質(zhì)量[1-7]。為保證原方的臨床療效及方便患者服用,對原方進(jìn)行工藝優(yōu)化制成顆粒劑,并建立其質(zhì)量控制方法,本實驗采用薄層色譜法對方中黃芩、苦參、半枝蓮、三棱進(jìn)行定性研究,采用高效液相色譜法測定方中君藥黃芩、苦參的主要有效成分,包括黃芩苷及苦參堿。為嚴(yán)格控制清肝化瘀顆粒的質(zhì)量提供實驗依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀(美國安捷倫公司);紫外-可見分光光度計(日本島津公司);AL204電子分析天平(德國梅特勒-托利多公司);YB-1A型真空恒溫干燥箱(天津鑫洲科技有限公司);電子恒溫水浴鍋(北京永光明醫(yī)療儀器廠);調(diào)溫電熱套(北京永光明醫(yī)療儀器廠)

1.2 試劑 甲醇(色譜純),乙腈(色譜純),超純水。

1.3 分析樣品 黃芩對照藥材(批號:120955-201309),苦參對照藥材(批號:121019-201006),半枝蓮對照藥材(批號:121293-201003),三棱對照藥材(批號:121521-201103),黃芩苷對照品(批號:110842-201207);黃芩素對照品(批號:111595-201306),漢黃芩素對照品(批號:111514-200403),苦參堿對照品(批號:110805-200508)均購于中國食品藥品檢定研究院。清肝化瘀顆粒(7.5 g/袋,中日友好醫(yī)院藥學(xué)部制劑室制備,批號2014003,2014004,2014005)。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 黃芩薄層鑒別[8]取3批顆粒各5 g,加乙酸乙酯—甲醇(3∶1)40 mL,超聲30 min,過濾。將濾液置水浴上揮干,殘渣加5 mL甲醇溶解,作為供試液;另分別取處方中缺黃芩的其他藥材,同法制成陰性對照溶液;取黃芩標(biāo)準(zhǔn)藥材1 g,同法制成對照藥材溶液;取漢黃芩素、黃芩素、黃芩苷對照品,加甲醇制成對照品溶液,濃度均為1 mg/mL。分別吸取上述8種溶液,各5 μL,點于同一聚酰胺薄膜上,以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(10∶3∶1∶2)為展開劑,展開,取出,晾干,置紫外光燈(365 nm)下檢視。結(jié)果顯示供試品色譜中,在與標(biāo)準(zhǔn)藥材、對照品色譜相對應(yīng)的位置上,紫外光燈(365 nm)下顯相同顏色的斑點,而陰性對照無干擾。見圖1。

圖1 黃芩薄層色譜

注：1～3供試品;4陰性對照;5黃芩對照藥材;6漢黃芩素;7黃芩素;8黃芩苷

2.1.2 苦參薄層鑒別 取3批顆粒各3 g,放入具塞錐形瓶中,加入氨水5 mL,浸泡5 min,加氯仿30 mL超聲30 min,過濾。取濾液置水浴上揮干,殘渣加2 mL甲醇溶解,作為供試液;另分別取處方中缺苦參的其他藥材,同法制成陰性對照溶液;取苦參標(biāo)準(zhǔn)藥材1 g,同法制成對照藥材溶液;取苦參堿對照品加甲醇制成每l mL含1 mg的溶液,作為對照品溶液。分別吸取上述6種溶液各5 μL,點于同一硅膠G薄層板上,以甲苯—丙酮—甲醇(8∶3∶0.5)為展開劑,展開,取出,晾干,噴以碘化鉍鉀溶液顯色。結(jié)果顯示供試品色譜中,在與對照藥材、對照品色譜相對應(yīng)的位置上,顯相同顏色的斑點,而陰性對照無干擾。見圖2。

2.1.3 半枝蓮薄層鑒別 取3批顆粒各5 g,研細(xì),加水40 mL溶解,用水飽和的正丁醇萃取3次，40 mL/次,合并正丁醇萃取液,過濾,取續(xù)濾液置50 ℃水浴上揮干,殘渣加甲醇5 mL溶解,作為供試品溶液;另分別取處方中缺半枝蓮的其他藥材,同法制成陰性對照溶液;取1 g半枝蓮標(biāo)準(zhǔn)藥材同法制成對照藥材溶液。分別吸取上述5種溶液各5 μL,點于同一硅膠H薄層板上,以甲苯—甲酸乙酯—甲酸(3∶3∶1)為展開劑,展開,取出,晾干,噴以AlCl3溶液,晾干,置紫外光燈(365 nm)下檢視。結(jié)果顯示供試品色譜中,在與對照藥材色譜相對應(yīng)的位置上,顯相同熒光斑點,而陰性對照無干擾。結(jié)果見圖3。

圖2 苦參薄層色譜

注：1～3供試品;4苦參對照藥材;5陰性對照;6苦參堿對照品

圖3 半枝蓮薄層色譜

注：1～3顆粒;4陰性對照;5對照藥材

2.1.4 三棱薄層鑒別 取3批顆粒各5 g,加乙醇30 mL,加熱回流1 h。濾過,濾液蒸干,殘渣加乙醇2 mL使溶解,作為供試品溶液。分別取處方中缺三棱的其他藥材,同法制成陰性對照溶液,取三棱標(biāo)準(zhǔn)藥材1 g,同法制成對照藥材溶液。分別吸取上述5種溶液各10 μL,點于同一硅膠G薄層板上,以石油醚(60～90 ℃)—乙酸乙酯(4∶1)為展開劑,展開,取出,晾干,噴以10%硫酸乙醇溶液,晾干,置紫外光燈(365 nm)下檢視。結(jié)果顯示供試品色譜中,在與對照藥材色譜相對應(yīng)的位置上,顯相同熒光斑點,而陰性對照無干擾[8]。見圖4。

圖4 三棱薄層色譜

注：1～3顆粒;4陰性對照;5對照藥材

2.2 黃芩苷含量測定

2.2.1 色譜條件 Kromasil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相:甲醇—水—磷酸(43∶57∶0.2);檢測波長:280 nm;流速:1 mL/min;進(jìn)樣量:10 μL;柱溫:28 ℃。

2.2.2 對照品溶液制備 精密稱取黃芩苷對照品(8.0 mg)置于10 mL量瓶中,用甲醇溶解,定容至10 mL,搖勻,備用(每1 mL中含黃芩苷8.0 mg)。

2.2.3 供試品溶液制備 精密稱取顆粒0.5 g,置于100 mL錐形瓶中,加入75%甲醇溶劑50 mL,密塞,稱定重量,超聲30 min,放置至室溫,予75%甲醇補(bǔ)足失去重量,搖勻,0.45 μm微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液,即得。

2.2.4 專屬性試驗 按處方量精密稱取除黃芩以外的7味藥材,以各提取工藝及成型工藝制成顆粒,精密稱取該顆粒0.5 g,置于100 mL具塞錐形瓶中,加入75%甲醇溶劑50 mL,密塞,稱定重量,超聲30 min,放置至室溫,予75%甲醇補(bǔ)足失去重量,搖勻,0.45 μm微孔濾膜過濾,取續(xù)濾液,即得陰性對照溶液。分別精密吸取供試品、陰性對照及黃芩苷對照品溶液各10 μL,按以上色譜條件檢測,結(jié)果顯示供試品與黃芩苷對照品色譜峰保留時間一致,陰性無干擾。見圖5。

2.2.5 線性關(guān)系考察 取上述對照品溶液以2、4、6、8、10、12 μL按黃芩苷測定色譜條件檢測,以黃芩苷含量為橫坐標(biāo),峰面積值為縱坐標(biāo),得回歸方程y=2 322x+386.26,r=0.999 5,表明黃芩苷在1.6～9.6 μg范圍內(nèi)進(jìn)樣量與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2.6 中間精密度試驗 精密吸取黃芩苷對照品溶液,重復(fù)進(jìn)樣6次,峰面積RSD=0.43%,表明精密度試驗符合要求。

圖5 清肝化瘀顆粒中黃芩高效液相色譜

注：A供試品;B陰性對照;C黃芩苷對照品

2.2.7 供試品溶液穩(wěn)定性試驗 制備供試品溶液,于室溫中放置,測1次/h,共8 h,RSD=0.12%,表明樣品在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.8 重復(fù)性試驗 取同一批顆粒(批號:2014003),分別稱取顆粒0.5 g,6次,按供試品溶液制備方法制備溶液,測得黃芩苷的峰面積并計算其含量,平均值為43.71 mg/g,RSD=0.61%,該方法的重復(fù)性分析符合要求。

2.2.9 回收率試驗 精密量取已知含量的供試品溶液1 mL,共6份,置10 mL量瓶中,分別精密加入對照品溶液1 mL,加75%甲醇稀釋并定容,依法測定。見表1。

表1 黃芩苷回收率試驗

2.2.10 樣品測定結(jié)果 取3批清肝化瘀顆粒,按2.2.1.3項下方法制備供試品溶液,按上述色譜條件測定,計算樣品黃芩中黃芩苷的含量分別為324.15、329.25、327.00 mg/袋。

2.3 苦參堿含量測定

2.3.1 色譜條件 Kromasil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相:有機(jī)相甲醇-乙腈(1∶1);水相,0.1%氨水溶液;梯度洗脫程序:有機(jī)相,0～40 min(10%～60%),40～41 min(60%～10%),41～50 min(10%);流速為1.0 mL/min;柱溫為30 ℃;檢測波長為210 nm;進(jìn)樣量為10 μL。

2.3.2 對照品溶液制備 精密稱取苦參堿對照品(0.55 mg)置于100 mL量瓶中,用甲醇溶解,定容至100 mL,搖勻,備用(每1 mL中含苦參堿0.055 mg)。

2.3.3 供試品溶液制備 精密稱取本品顆粒0.5 g,置100 mL錐形瓶中,加入甲醇溶劑50 mL,密塞,稱定重量,超聲30 min,放置至室溫,予甲醇補(bǔ)足失去重量,搖勻,微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液,即得。

2.3.4 專屬性試驗 按處方量精密稱取除苦參以外的7味藥材,以各提取工藝及成型工藝制成顆粒,精密稱取本品顆粒0.5 g,置100 mL錐形瓶中,加入甲醇溶劑50 mL,密塞,稱定重量,超聲30 min,放置至室溫,予甲醇補(bǔ)足失去重量,搖勻,微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液,即得陰性對照溶液。分別精密吸取供試品、陰性對照及苦參堿對照品溶液各10 μL,按以上色譜條件檢測,結(jié)果顯示供試品與苦參堿對照品色譜峰保留時間一致,陰性無干擾。見圖6。

圖6 清肝化瘀顆粒中苦參高效液相色譜

注：A供試品;B陰性對照;C苦參堿對照品

2.3.5 線性關(guān)系考察 取上述對照品溶液以2、4、6、8、10、12 μL按5.1項下色譜條件檢測,記錄峰面積,以苦參堿含量為橫坐標(biāo),峰面積值為縱坐標(biāo),得回歸方程y=2 411.6x-14.887,r=0.999 5,表明苦參堿在0.11～0.66 μg范圍內(nèi)進(jìn)樣量與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.3.6 中間精密度試驗 精密吸取苦參堿對照品溶液,重復(fù)進(jìn)樣6次,峰面積RSD=0.09%,表明精密度試驗符合要求。

2.3.7 供試品溶液穩(wěn)定性試驗 制備供試品溶液,于室溫中放置,測1次/h,共8 h,RSD=2.31%,表明樣品在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.8 重復(fù)性試驗 取同一批顆粒(批號:2014003),分別稱取顆粒0.5 g 6次,按供試品溶液制備方法制備溶液,測得苦參堿的峰面積并計算其含量,平均值為3.50 mg/g,RSD=2.20%,該方法的重復(fù)性分析符合要求。

2.3.9 回收率試驗 精密量取已知含量的供試品溶液1 mL,共6份,置10 mL量瓶中,分別精密加入對照品溶液1 mL,加75%甲醇稀釋并定容,依法測定。見表2。

表2 苦參堿回收率試驗

2.3.10 樣品測定測定 取3批清肝化瘀顆粒,按2.2.2.3項下方法制備供試品溶液,按上述色譜條件測定,計算樣品苦參中苦參堿的含量分別為26.86、25.52、26.43 mg/袋。

3 討論

3.1 薄層鑒別條件篩選 黃芩、三棱的薄層鑒別方法主要參照《中華人民共和國藥典》(2010版)(以下簡稱《藥典》)中黃芩、三棱項下方法,各斑點顯示清晰,重現(xiàn)性好,操作簡易。苦參薄層鑒別采用藥典方法時苦參堿斑點顯示不清晰,耗時較長,工藝復(fù)雜,經(jīng)參考相關(guān)文獻(xiàn)[9-13],采取本文中方法,其展開系統(tǒng)樣品的相容性、分離效果均較好,Rf值適中,薄層板對應(yīng)部位苦參堿斑點清晰,呈紅棕色,陰性無干擾,該鑒別條件簡單易行,重現(xiàn)性好。半枝蓮[14-15]采用本文方法斑點清晰,可有效鑒別。白術(shù)、莪術(shù)、白花蛇舌草、甘草4味中藥經(jīng)《藥典》(2010版)及其他文獻(xiàn)方法,鑒別結(jié)果欠佳,背景通道干擾明顯,斑點未能清晰分離,該4味中藥薄層色譜尚在進(jìn)一步研究中。

3.2 含量測定研究 方中君藥為黃芩、苦參,兩藥均具有清熱解毒祛濕的功效,與病機(jī)相符,其主要成分分別為黃芩苷、苦參堿,本研究主要測定兩者的含量。黃芩苷含量測定時,首先選用《藥典》高效液相色譜法進(jìn)行測定,即流動相:甲醇—水—磷酸(47∶53∶0.2),檢測波長:280 nm,流速:1 mL/min,進(jìn)樣量:10 μL,由于復(fù)方中成分復(fù)雜,結(jié)果顯示黃芩苷色譜峰與其他峰有部分重疊,為減少其他峰的干擾,經(jīng)文獻(xiàn)研究[16-23],調(diào)整流動比較例為甲醇—水—磷酸(43∶57∶0.2),其他條件不變,所得結(jié)果黃芩苷色譜峰峰型對稱,與雜質(zhì)峰分離度良好,系統(tǒng)適用性考察符合要求,陰性樣品無干擾?？鄥A含量測定時[24-30],試驗考察了甲醇-水,乙腈-水,甲醇-0.1%氨水,乙腈-0.1%氨水等不同的流動相體系,苦參堿分離不理想,最終選擇流動相:有機(jī)相:甲醇-乙腈(1∶1),水相:0.1%氨水溶液,梯度洗脫程序:有機(jī)相,0～40 min(10%～60%),40～41 min(60%～10%),41～50 min(10%),流速為1.0 mL/min,柱溫為30 ℃,檢測波長為210 nm,進(jìn)樣量為20 μL,結(jié)果顯示苦參堿峰型及分離度均較好,經(jīng)相關(guān)方法學(xué)考察各指標(biāo)均符合藥典要求,且陰性對照無干擾,可滿足清肝化瘀顆粒苦參堿含量測定。

本研究對清肝化瘀顆粒中黃芩、苦參、半枝蓮、三棱4味中藥進(jìn)行了定性鑒別,所選方法簡單易行,重現(xiàn)性好,陰性對照無干擾;并對方中君藥黃芩、苦參的主要有效成分進(jìn)行了含量測定,其方法學(xué)均符合《藥典》要求,所建立方法可用于清肝化瘀顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制。

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StudyonQualityStandardofQingganHuayuGranule

Wu Tong1, Zhang Qiaoli2, Yao Shukun3

(1BeijingDitanHospitalAffiliatedtoCapitalMedicalUniversity,Beijing100015,China; 2BeijingHepingliHospital,Beijing100013,China; 3China-JapanFriendshipHospital,Beijing100029,China)

Objective:To establish a quality-control method for Qinggan Huayu Granule.MethodsTLC (Thin Layer Chromatography) was adopted to identify Radix Scutellariae, Radix Sophorae Flavescentis, Scutellaria barbata, zedoary etc. The main content of baicalin and matrine in the principal drug Radix Scutellariae, Radix Sophorae Flavescentis are determined by HPLC (high performance liquid chromatography) method.ResultsIdentification method of the TLC about Radix Scutellariae, Radix Sophorae Flavescentis, Scutellaria barbata, zedoary etc in granules was established. Under the selected conditions of HPLC, an identification method for baicalin and matrine in granules was established and the methodology complies with the requirements of Chinese Pharmacopeia.ConclusionThe identification and quantitative determination method is simple, accurate and reproducible, which can be applied to the quality control of Qinggan Huayu Granule.

Qinggan Huayu Granule; TLC; Baicalin; Matrine；Quality standard

國家重大新藥創(chuàng)制專項課題(2012ZX09103201-021)——清肝化瘀膠囊治療原發(fā)性肝癌的候選藥物研究

吳桐(1982.02—),男,博士,主治醫(yī)師,研究方向:中西醫(yī)結(jié)合防治肝病研究,E-mail:wut1982@126.com

姚樹坤(1957.11—),男,博士,教授,博士研究生導(dǎo)師,中日友好醫(yī)院副院長,研究方向:中西醫(yī)結(jié)合防治消化病研究,E-mail:yaoshukun6@aliyun.com

R284.1

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.10.046

(2016-07-12收稿 責(zé)任編輯：王明)