王蔚，杜淵，白雪，楊思進(jìn)

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，四川 瀘州 646000)

蛭龍活血通瘀膠囊對(duì)腦出血大鼠腦組織AQP-4、MMP-9表達(dá)的影響

王蔚，杜淵，白雪，楊思進(jìn)*

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，四川 瀘州 646000)

目的：通過(guò)觀察蛭龍活血通瘀膠囊對(duì)大鼠腦出血后AQP-4、MMP-9蛋白及基因表達(dá)的影響，探討蛭龍活血通瘀膠囊對(duì)腦組織的保護(hù)作用機(jī)制。方法: 將45只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、蛭龍活血通瘀膠囊高、中、低劑量組，各組又分為12 h、48 h、72 h三個(gè)亞組，采用自體尾部血注入法制備腦出血大鼠模型，Western blot法檢測(cè)AQP-4、MMP-9蛋白，RT-PCR法檢測(cè)AQP-4、MMP-9 mRNA的表達(dá)。結(jié)果: 與模型組比較，ZL各劑量組AQP-4、MMP-9蛋白及基因表達(dá)均有不同程度的降低，具有顯著性差異(P<0.01)；ZL各劑量組之間比較，以高劑量組為對(duì)照，低、中劑量組在各時(shí)間點(diǎn)腦組織AQP-4、MMP-9表達(dá)具有顯著性差異(P<0.01)。結(jié)論: 蛭龍活血通瘀膠囊能夠明顯降低腦出血大鼠腦組織AQP-4、MMP-9蛋白及基因的表達(dá)，該作用存在一定的量效關(guān)系，ZL高劑量組作用最為明顯。

蛭龍活血通瘀膠囊；腦出血；AQP-4；MMP-9

腦出血是常見(jiàn)的內(nèi)科急癥，臨床病理研究證實(shí)[1]，腦出血急性期惡化和死亡的主要原因是腦水腫及出血。腦出血后在出血區(qū)域形成血腫，對(duì)周圍腦組織造成壓迫，引起腦內(nèi)的急性占位效應(yīng)，并對(duì)周圍的腦組織產(chǎn)生進(jìn)一步的損害，因此腦水腫被認(rèn)為是腦出血后最重要的繼發(fā)性病理變化之一。研究表明[2-3]，水通道蛋白-4(aquaporins-4，AQP-4)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)與腦水腫密切相關(guān)，參與了多種疾病所引起的腦水腫的病理過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)研究觀察具有益氣活血、化瘀通絡(luò)功效的蛭龍活血通瘀膠囊對(duì)大鼠腦出血后腦組織AQP-4、MMP-9蛋白及基因表達(dá)的影響。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)的雄性健康SD大鼠45只，體質(zhì)量250 g～300 g，由西南醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào):SYXK(川)2013-065。動(dòng)物按照每籠5只進(jìn)行飼養(yǎng)，室溫(22±2)℃，濕度30%～40%，常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由攝食及飲水。

1.2 藥物及試劑

蛭龍活血通瘀膠囊：主要成分包括黃芪、水蛭、地龍、大血藤、桂枝等藥物，規(guī)格為0.4 g/粒，相當(dāng)于生藥 2.625 g，由西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院制劑室提供，批號(hào)為20151201；兔抗AQP-4多克隆抗體：Santa Cruze，Sc-20812；兔抗MMP9多克隆抗體：proteintech,10375-2-AP；蛋白marker：Thermo fermentas,SM0431；β-action抗體：中杉金橋，TA-09；DNA marker：大連寶生物，DL2000；G250考馬斯亮藍(lán)溶液：上海生工，A602151-0250；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒：Thermo scientific，#K1622；Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate(曝光液)：Minipore，WBKLS0100。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

大鼠腦立體定位儀：安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司；Thermo 991-80℃超低溫冰箱：美國(guó)賽默飛世爾；IMS-40全自動(dòng)雪花制冰機(jī)：常熟雪珂電器有限責(zé)任公司；KJ201-BS型震蕩器：江蘇康健醫(yī)療用品有限公司；DYY-10C電泳儀：北京六一儀器廠；Mini-Protean小垂直板電泳槽：美國(guó)Bio-Rad；Y-SPCT型水平電泳槽：北京君藝東方；Trans-Blot轉(zhuǎn)印槽：美國(guó)Bio-Rad；ChemiDoc XRS凝膠成像系統(tǒng)：美國(guó)Bio-Rad；LS-P96G PCR儀：美國(guó)Thermo Fisher LabServ；BioMate 3S紫外分光光度計(jì)：美國(guó)Thermo Fisher LabServ。

2 方法

2.1 動(dòng)物造模及模型評(píng)估

大鼠術(shù)前禁食12 h，麻醉后斷尾取尾部自體血50 μL。將大鼠用立體定位儀俯臥位固定，備皮消毒，暴露手術(shù)區(qū)域，沿頭皮正中縱行切開(kāi)約10 mm，用30%雙氧水腐蝕骨膜，參照的Rosenber[4]的方法，并根據(jù)《腦立體定位圖譜》[5]進(jìn)行尾殼核定位(矢狀縫右側(cè)旁開(kāi)3.0 mm，前囟前0.2 mm處)，用微量進(jìn)樣器按5 μL/min的速度緩慢勻速注入自體血后，留針15 min緩慢退針，骨蠟封閉顱骨，縫合頭皮。假手術(shù)組只進(jìn)針，不注血。

參照Z(yǔ)ea Longa[6]“5分制法”對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分。以評(píng)分為1～3分認(rèn)為造模成功，0分則認(rèn)為造模失敗，4分和死亡大鼠均被剔除實(shí)驗(yàn)并根據(jù)分組進(jìn)行相應(yīng)補(bǔ)充。假手術(shù)組大鼠在術(shù)后清醒后無(wú)明顯神經(jīng)功能缺損癥狀，評(píng)分為0分。

2.2 動(dòng)物分組及給藥

將45只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、蛭龍活血通瘀低、中、高劑量組(分別簡(jiǎn)稱為“ZL低劑量組”“ZL中劑量組”“ZL高劑量組”)，每組9只。并按指標(biāo)檢測(cè)的時(shí)間劃分為12 h、48 h、72 h 3個(gè)亞組，每亞組3只。

大鼠麻醉自然蘇醒后進(jìn)行灌胃。各藥物組均給予蛭龍活血通瘀膠囊藥物的等體積和相應(yīng)的濃度進(jìn)行灌胃。蛭龍活血通瘀膠囊成人的臨床用藥量為3.6 g/d，按照人體用量的5倍、10倍、20倍定為低、中、高劑量。成人體重按60 kg計(jì)算，換算成各藥物組大鼠的每日用藥量，分別為0.3 g/kg/d、0.6 g/kg/d、1.2 g/kg/d。大鼠的灌胃體積為3 mL/次，給藥次數(shù)為1次/日。模型組、假手術(shù)組給予同藥物組等體積(3 mL/次)的生理鹽水灌胃，給藥次數(shù)同藥物組。

2.3 檢測(cè)指標(biāo)

2.3.1 腦組織AQP-4、MMP-9蛋白的表達(dá)

采用蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)。稱取0.05 g腦組織提取蛋白，考馬斯亮藍(lán)比色法測(cè)定蛋白濃度并經(jīng)凝膠染色檢測(cè)提取蛋白質(zhì)量。按照Western blot操作步驟，制膠→電泳→轉(zhuǎn)膜→封閉→一抗孵育→二抗孵育，孵育完畢用TBST洗PVDF膜3次，每次5 min，將PVDF膜倒扣在曝光液中，約1 min后通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行信號(hào)檢測(cè)。各目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量為測(cè)定的目的蛋白灰度值與內(nèi)參β-actin灰度值之間的比值。

2.3.2 腦組織AQP-4、MMP-9 mRNA的表達(dá)

采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)法。在NCBI Gene Bank中查詢大鼠AQP-4及β-actin的cDNA序列，引物特異性經(jīng)NCBI Primer Blast軟件分析，由上海生物工程有限公司合成。AQP-4(size 403 bp)：上游5′-CTGTAGCCTAAGTCACTGGT-3′，下游5′-TGTCAGAGAGGTCATGTCTC-3′；MMP-9(size 495 bp)：上游5′-TGCGTATTTCCATTCATC-3′，下游5′-CCTTGGGTCAGGTTTAGAG-3′；β-Actin(size 654bp)：上游5′-TGTCACCAACTGGGACGATA-3′,下游5′-AGGTCTTTACGGATGTCAACG-3′。按照RT-PCR操作步驟，提取RNA→合成cDNA→RT-PCR擴(kuò)增→RNA電泳，電泳結(jié)束后采用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析。各目的基因的相對(duì)表達(dá)量=目的基因條帶灰度值/β-actin基因條帶灰度值。

2.4 統(tǒng)計(jì)方法

3 結(jié)果

3.1 蛭龍活血通瘀膠囊對(duì)AQP-4蛋白的影響

表1結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠腦組織中有微量水平的AQP-4蛋白表達(dá)，在12 h、48 h及72 h的表達(dá)量無(wú)明顯差異(P>0.05)；與假手術(shù)組相比，模型組及ZL低、中、高劑量組各時(shí)間點(diǎn)AQP-4蛋白的表達(dá)均明顯高于假手術(shù)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；模型組術(shù)后AQP-4蛋白表達(dá)呈進(jìn)行性升高，72 h時(shí)最為顯著，與模型組相比，ZL各劑量組表達(dá)均有不同程度的降低，具有顯著性差異(P<0.01)；ZL各劑量組之間比較，以高劑量組為對(duì)照，低、中劑量組在各時(shí)間點(diǎn)腦組織AQP-4蛋白的表達(dá)具有顯著性差異(P<0.01)。

3.2 蛭龍活血通瘀膠囊對(duì)MMP-9蛋白的影響

表2結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠腦組織中MMP-9蛋白有少量的表達(dá)，術(shù)后12 h、48 h及72 h時(shí)表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與假手術(shù)組比較，模型組及ZL低、中、高劑量組各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)均明顯高于假手術(shù)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；模型組術(shù)后腦組織MMP-9蛋白表達(dá)48h時(shí)達(dá)到高峰，72 h時(shí)略有下降，與模型組相比，ZL各劑量組MMP-9蛋白表達(dá)均降低，具有顯著性差異(P<0.01)；ZL各劑量組之間比較，以高劑量組為對(duì)照，低、中劑量組各時(shí)間點(diǎn)腦組織MMP-9蛋白表達(dá)具有顯著性差異(P<0.01)。

表1 各組大鼠腦組織AQP-4蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

注：與模型組比較，★P<0.01；與假手術(shù)組比較，▲P<0.01；與高劑量組比較，◆P<0.01

表2 各組大鼠腦組織MMP-9蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

注：與模型組比較，★P<0.01；與假手術(shù)組比較，▲P<0.01；與高劑量組比較，◆P<0.01

3.3 蛭龍活血通瘀膠囊對(duì)AQP-4 mRNA的影響

表3結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠腦組織中有微量AQP-4 mRNA表達(dá)，且在12 h、48 h及72 h時(shí)表達(dá)量無(wú)明顯差異(P>0.05)；與假手術(shù)組相比，模型組及ZL低、中、高劑量組大鼠在以上各時(shí)間點(diǎn)AQP-4 mRNA的表達(dá)均明顯高于假手術(shù)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；模型組大鼠在術(shù)后腦組織AQP-4 mRNA表達(dá)呈進(jìn)行性升高，在72 h時(shí)最為顯著；與模型組相比，ZL各劑量組表達(dá)均有不同程度的降低，具有顯著性差異(P<0.01)。ZL各劑量組之間比較，以高劑量組為對(duì)照，低、中劑量組在各時(shí)間點(diǎn)腦組織AQP-4 mRNA的表達(dá)較之均具有顯著性差異(P<0.01)。

表3 各組大鼠腦組織AQP-4 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

注：與模型組比較，★P<0.01；與假手術(shù)組比較，▲P<0.01；與高劑量組比較，◆P<0.01

3.4 蛭龍活血通瘀膠囊對(duì)MMP-9 mRNA的影響

表4結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠腦組織中MMP-9 mRNA有少量的表達(dá)，且術(shù)后12 h、48 h及72 h時(shí)表達(dá)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與假手術(shù)組比較，模型組及ZL低、中、高劑量組大鼠各時(shí)點(diǎn)MMP-9 mRNA表達(dá)均明顯高于假手術(shù)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；模型組大鼠術(shù)后腦組織MMP-9 mRNA表達(dá)48h時(shí)上升明顯并達(dá)到高峰，72 h時(shí)略有下降，與模型組相比，ZL各劑量組MMP-9 mRNA表達(dá)均有降低，具有顯著性差異(P<0.01)；ZL各劑量組之間比較，以高劑量組為對(duì)照，低、中劑量組在各時(shí)點(diǎn)腦組織MMP-9 mRNA表達(dá)均具有顯著性差異(P<0.01)。

表4 各組大鼠腦組織MMP-9 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

注：與模型組比較，★P<0.01；與假手術(shù)組比較，▲P<0.01；與高劑量組比較，◆P<0.01

3 討論

AQP-4是水通道蛋白家族中的一員，又稱為汞不敏感水通道蛋白(mercury insensitive water channel，MIWC)[7]。AQP-4在中樞神經(jīng)系統(tǒng)分布上最顯著的特點(diǎn)呈極性分布，具有高度選擇性[8]。AQP-4的兩個(gè)主要表達(dá)區(qū)域?yàn)?，位于形成膠質(zhì)界膜的致密星形膠質(zhì)細(xì)胞足突上，其參與形成與腦脊液接觸的軟腦膜和室管膜的表面屏障。位于包繞血管周圍的星形膠質(zhì)細(xì)胞的足突上，并在與血管直接接觸的足突上呈極性分布[9]。AQP-4的這種分布特點(diǎn)提示AQP-4在維持大腦水的平衡中發(fā)揮了重要作用，AQP-4是膠質(zhì)細(xì)胞與腦脊液以及血管間的水調(diào)節(jié)和轉(zhuǎn)運(yùn)的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[10]。研究表明[11]，腦出血后血腫周圍AQP-4表達(dá)的升高導(dǎo)致腦水腫的加劇、血腦屏障的通透性破壞、神經(jīng)功能缺損，提示AQP-4的動(dòng)態(tài)變化與腦水腫、腦損傷發(fā)生發(fā)展過(guò)程密切相關(guān)。

MMP-9又被稱為明膠酶B(gelatinase-B)，是一種依賴金屬鋅離子的金屬酶，MMP-9參與組織發(fā)育與重構(gòu)，胚胎形成，創(chuàng)傷修復(fù)，血管新生等多種生理病理過(guò)程[12]。近年的研究表明，MMP-9與腦血管疾病關(guān)系密切，在腦出血后腦水腫的形成和發(fā)展中發(fā)揮重要作用[13-14]。研究顯示[15]，MMP-9定位于神經(jīng)元、血管內(nèi)皮細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞，在腦出血時(shí)MMP-9含量增加。內(nèi)源性MMP-9來(lái)自星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞，外源性MMP-9來(lái)自內(nèi)皮細(xì)胞、滲出的中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。MMP-9啟動(dòng)后，可以通過(guò)降解細(xì)胞外基質(zhì)成分，從而對(duì)血腦屏障完整性造成破壞。在對(duì)腦組織、血漿、腦脊液和血腫抽吸液等MMPs蛋白水平的檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)[16-17]，MMP-9于出血后數(shù)小時(shí)開(kāi)始升高，達(dá)到峰值后很快降低，與腦損害后腦水腫出現(xiàn)的高峰及發(fā)送規(guī)律疾病一致。

本研究結(jié)果顯示，腦出血模型大鼠在術(shù)后12 h、48 h及72 h腦組織中AQP-4、MMP-9蛋白及基因的表達(dá)均有明顯上升，其中，AQP-4蛋白及基因表達(dá)呈進(jìn)行性升高，在72h時(shí)升高最為明顯，MMP-9蛋白及基因表達(dá)也有明顯升高，在48h時(shí)上升明顯并達(dá)到高峰，在72 h時(shí)略有下降。而蛭龍活血通瘀膠囊低、中、高劑量干預(yù)組在術(shù)后12 h、48 h及72 h時(shí)大鼠腦組織AQP-4、MMP-9蛋白及基因的相對(duì)表達(dá)量均有不同程度的下降，與模型組比較，差異均具有顯著性(P<0.01)。由此可得出蛭龍活血通瘀膠囊能夠明顯降低腦出血大鼠腦組織AQP-4蛋白及基因的表達(dá)，且該作用存在一定的量效關(guān)系，ZL高劑量組作用最為明顯。蛭龍活血通瘀膠囊能夠下調(diào)AQP-4在腦內(nèi)的表達(dá)，因而具有腦保護(hù)作用。

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R285.5

A

1002-2392(2017)05-0072-04

2016-10-12

2017-01-16

四川省科技廳項(xiàng)目：治療缺血性腦血管疾病的院內(nèi)制劑——蛭龍活血通瘀膠囊新藥臨床前研究(2011SZ0322)

王蔚(1983-),女，碩士,主治醫(yī)師，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合防治心腦血管疾病。

*通訊作者：楊思進(jìn)(1962-),男，主任醫(yī)師，教授，博導(dǎo)，研究方向：心腦血管疾病的中西醫(yī)結(jié)合治療。