吳水生,李德森，許豪然，廖華軍*，陳亮，李丹

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué),福建 福州 350122;2.馬來西亞北馬中醫(yī)藥學(xué)院，馬來西亞 檳城 13200;3.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬福州市中醫(yī)院,福建 福州 350001)

制劑工藝

基于譜效關(guān)系的鉤吻炮制減毒存效的實(shí)驗(yàn)研究

吳水生1,李德森1，許豪然2，廖華軍1*，陳亮3，李丹3

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué),福建 福州 350122;2.馬來西亞北馬中醫(yī)藥學(xué)院，馬來西亞 檳城 13200;3.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬福州市中醫(yī)院,福建 福州 350001)

目的:研究砂炒鉤吻的減毒存效的工藝及鎮(zhèn)痛藥效。方法:采用烘烤箱高溫加熱法，以鎮(zhèn)痛藥效、急性毒性為評價(jià)指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇炮制時間、炮制溫度為自變量，采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)選鉤吻炮制工藝的研究。結(jié)果:鉤吻在190～230℃溫度下，經(jīng)過10～60 min的炮制后，毒性明顯降低，且保留一定的鎮(zhèn)痛效應(yīng)。對炮制品的外觀、毒性和鎮(zhèn)痛藥效綜合考慮，在炮制溫度200～220℃，炮制時間在10～20 min內(nèi)進(jìn)行最佳工藝優(yōu)選，得到鉤吻的最佳炮制工藝：炮制溫度210℃，炮制時間15 min。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果與實(shí)驗(yàn)預(yù)測值較為接近，說明采用響應(yīng)面法得到的工藝參數(shù)可靠，具有一定的實(shí)用價(jià)值。結(jié)論:砂炒鉤吻炮制后毒性明顯降低，同時又保留良好的鎮(zhèn)痛藥效，取得了良好的預(yù)期結(jié)果。

鉤吻；炮制；減毒存效；星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法

鉤吻(GelsemiumelegansBenth.)又名斷腸草、野葛、毒根、大茶藥，是馬錢科( Loganiaceae)植物胡蔓藤屬( Gelsemium)的全株，是世界著名的劇毒植物，主要分布在我國福建、湖南、浙江、廣東、貴州、廣西、云南等地[1]，首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為下品，謂其“主金瘡，乳痓，中惡風(fēng)，咳逆上氣，水腫，殺鬼疰蠱毒。”《中華本草》記載其味苦、微辛，性熱，有大毒，主治跌打損傷，神經(jīng)痛，濕疹，癰腫，風(fēng)濕痹痛[2]?，F(xiàn)代研究表明鉤吻具有抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、增強(qiáng)免疫、促進(jìn)造血等作用，特別對于無成癮性鎮(zhèn)痛和抗腫瘤等方面具有明顯的優(yōu)勢，由于鉤吻的毒性較大，且其治療量和中毒量非常接近，安全指數(shù)小，劑量不易控制，容易發(fā)生中毒反應(yīng)，每年均不乏鉤吻中毒的臨床報(bào)道[3]，限制了其臨床的廣泛應(yīng)用。但由于其臨床療效顯著，如何避害就利，開發(fā)出療效好、毒副作用小的鉤吻生物堿新藥[4-5]是我們的研究目標(biāo)。

“藥以治病,因毒為能”,因此只要能合理應(yīng)用有毒中藥的藥效功能,減少藥物的毒副作用，就能趨利避害,發(fā)揮其積極而突出的作用[6]。中醫(yī)藥對毒性中藥的應(yīng)用有著悠久的歷史，積累了許多降低藥物毒性、改變藥物性能的寶貴經(jīng)驗(yàn)。其中對毒性藥材進(jìn)行特殊加工處理，使藥物的毒性降低且保留原有功效，達(dá)到“減毒增效”目的，是降低有毒中藥的最有效方法之一，也是傳統(tǒng)中藥應(yīng)用的一大特色。如馬錢子經(jīng)砂燙炮制后，馬錢子中的馬錢子堿大量被破壞,而士的寧則只有部分被破壞，起到了降低毒性的作用[7]。烏頭經(jīng)加熱煮沸或水處理等炮制,能使有毒成分水解，降低毒性[8]。

面對鉤吻的極大毒性和顯著而獨(dú)特的臨床療效，如何通過科學(xué)的炮制方法在保持或提高其療效的前提下，降低或消除其毒性，達(dá)到避害就利，闡述炮制機(jī)理是鉤吻研究的一大核心問題與關(guān)鍵所在，也是國內(nèi)外藥學(xué)工作者非常重視的研究課題。查閱目前國內(nèi)外文獻(xiàn)，對鉤吻的研究主要集中在資源、化學(xué)、藥理以及毒性方面的研究，通過全面的文獻(xiàn)復(fù)習(xí)，發(fā)現(xiàn)對鉤吻炮制方面的相關(guān)研究還未見報(bào)道。本課題組在前期系統(tǒng)性地開展了12種鉤吻傳統(tǒng)炮制減毒工藝研究的基礎(chǔ)上，通過對砂炒鉤吻炮制工藝進(jìn)行創(chuàng)新性改進(jìn)，以期獲得穩(wěn)定可控、低毒高效的鉤吻炮制飲片，對鉤吻的進(jìn)一步研究開發(fā)具有重要意義。

1 儀器與實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器

電子分析天平(FA20004N,北京賽多利斯天平有限公司)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-52,上海亞榮生化儀器廠)，中草藥粉碎機(jī)(FY135,天津市泰斯特儀器有限公司)，超聲波清洗器(KQ-500E,昆山市超聲儀器有限公司)，烤箱(YK38GS,佛山市優(yōu)益電器有限公司)，冷凍干燥機(jī)(DHG-9023A,上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH-1,常州國華電器有限公司)，高溫測溫儀(GM1150/1500,深圳市聚茂源科技有限公司)，電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9023A,上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

1.2 試劑

阿司匹林(20130626,石藥集團(tuán)歐意藥業(yè)有限公司),冰醋酸(20140630)、乙醇(20150929)購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,其余試劑均為分析純。

1.3 藥材

鉤吻藥材采于福建省龍巖市，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院車蘇容副教授鑒定為馬錢科胡蔓藤屬植物干燥的藤莖，切制成約2 mm飲片。

1.4 實(shí)驗(yàn)動物

清潔級KM小鼠，雌雄各半，6～8周齡，體質(zhì)量18～22 g，購于福州吳氏實(shí)驗(yàn)動物中心提供，動物合格證號：SCXK(滬)2013-0016，試驗(yàn)前，將小鼠置20～25℃SPF級動物實(shí)驗(yàn)室(許可證號，SCXK(閩)2014-0005)中飼養(yǎng)1周,標(biāo)準(zhǔn)飼料,無菌飲用水。

2 方法與結(jié)果

2.1 藥物制備

將鉤吻藥材粉碎，過篩，取適量置于圓底燒瓶中，加入7倍量95%乙醇，浸泡0.5 h，回流提取3次，每次提取2 h，趁熱過濾，合并上清液，減壓回收乙醇至無醇味，冷凍干燥，4℃保存?zhèn)溆?。臨用前用0.5%CMC-Na溶液配制成適合濃度。

2.2 急性毒性實(shí)驗(yàn)

將實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分成若干組，實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，自由飲水。按最大的劑量分別灌胃給藥，觀察1 d內(nèi)的死亡情況[9]。

2.3 醋酸所致小鼠扭體反應(yīng)模型

取KM小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，采用隨機(jī)分組的方法將實(shí)驗(yàn)小鼠分為模型組、陽性對照組、不同炮制品給藥組，陽性對照組(阿司匹林0.2 g/kg)組及各給藥組按0.2 mL/10 g劑量灌胃給予相應(yīng)藥液，模型組灌胃給予相應(yīng)體積的生理鹽水小連續(xù)灌胃給藥3天，每天1次。末次給藥0.5 h后將0.6%醋酸溶液(0.2 mL/10 g，臨用前配制)注射于小鼠腹腔內(nèi)，以引起深部、大面積而持久的疼痛刺激，致使小鼠產(chǎn)生扭體反應(yīng)(腹部收縮內(nèi)凹、仲展后肢、臀部抬高、蠕行)，觀察各組小鼠出現(xiàn)扭體反應(yīng)的時間(潛伏期)及15 min內(nèi)扭體反應(yīng)的次數(shù)[10-11]。計(jì)算鎮(zhèn)痛率，公式為鎮(zhèn)痛率=(模型組扭體次數(shù)-給藥組扭體次數(shù))/模型組扭體次數(shù)×100%。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2.5 單因素試驗(yàn)考察

2.5.1 炮制設(shè)備的改進(jìn)

傳統(tǒng)的砂炒炮制，都是將砂子用武火加熱到一定的溫度，砂炒一般溫度較高，與自然環(huán)境的溫度差別大，不容易將溫度控制在某一范圍內(nèi)，穩(wěn)定性差，得到的炮制品不穩(wěn)定。后來采用馬沸爐高溫加熱的方法，飲片受熱較為均勻，可以得到相對穩(wěn)定的炮制品。但是在炮制過程中，翻動藥材不方便，耗費(fèi)時間較長，故需對設(shè)備進(jìn)一步改進(jìn)。因此，課題組將市場上的電烤箱進(jìn)行改進(jìn)，在電烤箱中間焊接一不銹鋼中空圓筒，即可放置炮制品又能達(dá)到控溫效果好、受熱均勻的效果。經(jīng)過改裝后的設(shè)備炮制藥材，不需使用砂子，因此只需考慮炮制溫度和時間。

2.5.2 炮制溫度

取已分好檔的鉤吻藥材(直徑2～4 cm，厚約2 mm)5份，每份50 g，選取炮制溫度分別為190，200，210，220，230℃。

2.5.3 炮制時間

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)，藥材顏色產(chǎn)生明顯改變以后，才能初步判斷炮制品的毒性發(fā)生顯著的降低，因此炮制時間隨不同的炮制溫度變化。190℃炮制50，60，70 min；200℃的炮制時間為10，20，30，40 min；210℃炮制時間為10，20，30 min；220℃炮制時間為10，15，20 min；230℃炮制時間為10，15 min。

2.5.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5.4.1 外觀顏色變化

在炮制過程中發(fā)現(xiàn)，隨著溫度的升高和時間的逐漸延長，炮制品的顏色逐漸加深，由生品的黃白色逐漸變?yōu)闇\褐色、褐色和深褐色，最后變成炭黑色。

2.5.4.2 各組炮制品毒性反應(yīng)

小鼠給藥后如有中毒，一般給藥2～15 min后出現(xiàn)毒性反應(yīng)，其主要表現(xiàn)為發(fā)抖、四肢無力及運(yùn)動失調(diào)，呼吸減慢，很快就轉(zhuǎn)向興奮狀態(tài)，叩牙頻繁，并伴有痙攣，痙攣強(qiáng)度逐漸增大，繼而間歇性的驚厥、跳躍，隨即出現(xiàn)全身性劇烈的強(qiáng)直性驚厥，最后呼吸衰竭而死亡。本實(shí)驗(yàn)小鼠(除1、4組外)出現(xiàn)癥狀后，并未轉(zhuǎn)向興奮，頻繁叩牙，無痙攣及驚厥現(xiàn)象，2 h后完全恢復(fù)正常，其毒性反應(yīng)特征與鉤吻生品中毒反應(yīng)基本一致[12-13]。見表1。

2.5.4.3 各組炮制品對小鼠的鎮(zhèn)痛作用

從表2可以看出，鉤吻經(jīng)炮制減毒后，仍然保留一定的鎮(zhèn)痛效應(yīng)，而且各組差異較大，不同溫度的炮制品均有鎮(zhèn)痛作用較好的炮制品，并有隨炮制時間的延長，鎮(zhèn)痛效應(yīng)明顯下降的趨勢，通過對炮制溫度和時間因素的考察，對炮制品的外觀、毒性和鎮(zhèn)痛藥效綜合考慮，在炮制溫度200～220℃，炮制時間在10～20 min內(nèi)進(jìn)行最佳工藝優(yōu)選。

表1 各組炮制品毒性情況

2.6 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，按Design-Expert 8.0.6.1中星點(diǎn)設(shè)計(jì)(CCD)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)[14-15]，每份固定加入50 g鉤吻切片，選取炮制溫度200～220℃、炮制時間在10～20 min為自變量因素，2個自變量分別以-1，0，1水平編碼，以鉤吻的鎮(zhèn)痛藥效為響應(yīng)值，試驗(yàn)安排與結(jié)果見表3,4。

表2 鉤吻各炮制品對小鼠冰醋酸致痛作用的影響

注：與空白組對照比較,*P<0.05,**P<0.01；與陽性組對照比較,△P<0.05

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表

表4 鉤吻炮制工藝Central-Composite設(shè)計(jì)方案及響應(yīng)值

利用Design-Expert8.0.6.1軟件對表2 試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合，得到的數(shù)學(xué)模型為Y =+47.53-3.83*A+2.57*B-0.47*A*B-3.61A2-2.10*B2,對該模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果P=0.033 5<0.05，說明該模型具有顯著性，與實(shí)際實(shí)驗(yàn)擬合較好；模型方程R2=0.770 6，說明建立數(shù)學(xué)模型的實(shí)測值與預(yù)測值間具有高度的相關(guān)性；模失擬項(xiàng)(P=0.201 1>0.1)不顯著，說明失擬項(xiàng)和純誤差的差異不顯著，該二次回歸模型能夠較顯著擬合炮制時間、溫度對鉤吻炮制品鎮(zhèn)痛藥效的影響。

方差分析結(jié)果還表明，方程一次項(xiàng)中A、B對響應(yīng)值影響顯著，二次方項(xiàng)A2對響應(yīng)值影響都顯著，交互項(xiàng)對響應(yīng)值影響不顯著。由此可見，各試驗(yàn)因素對響應(yīng)值的影響并不是簡單的線性關(guān)系。各因素(炮制溫度和時間)的影響程度，可以通過F值來判斷，F(xiàn)值越大，則因素對響應(yīng)值的影響越顯著。從方差分析表中可知，F(xiàn)A=9.82，F(xiàn)B=4.43，通過數(shù)值比較發(fā)現(xiàn)，炮制時間比溫度的影響更大。

根據(jù)擬合的二項(xiàng)式方程，用Design Expert8.0.6.1軟件繪制3D效應(yīng)圖，考察各自變量對鉤吻高溫炮制工藝的影響。得鉤吻藥材的最佳炮制工藝為：即炮制溫度210 ℃，炮制15 min。見圖1，2,3,4。

表5 回歸模型方差分析表

圖1 殘差的正態(tài)概率分布

圖2 殘差與方程預(yù)測值的對應(yīng)關(guān)系圖

圖3 預(yù)測值與實(shí)驗(yàn)實(shí)際值的對應(yīng)關(guān)系圖

圖4 3D圖

2.7 驗(yàn)證性試驗(yàn)

2.7.1 藥效驗(yàn)證

取鉤吻藥材50 g，按優(yōu)選的炮制工藝條件進(jìn)行炮制，藥材經(jīng)炮制后炮制品表面呈褐色，鎮(zhèn)痛率為46.318%，說明優(yōu)選的炮制工藝可較好地預(yù)測鉤吻的工藝。

2.7.2 急性毒性實(shí)驗(yàn)

預(yù)試驗(yàn):取KM種小鼠20只，預(yù)試性灌胃給藥，按小鼠一次性能承受的最大容積灌胃(25 mL/kg)[16]，當(dāng)日灌胃2次，在飼養(yǎng)條件下觀察14天，給藥14天后，處死所有小鼠，肉眼觀察其內(nèi)臟組織均未見異常，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示鉤吻經(jīng)2.6工藝炮制后可能毒性很低。

3 討論

本研究在對毒性中藥鉤吻進(jìn)行酒制等12種傳統(tǒng)炮制法炮制后的毒效綜合評價(jià)的基礎(chǔ)上，確定了砂炒鉤吻的減毒存效最為理想，為了進(jìn)一步改進(jìn)砂炒工藝，我們采用了烘烤箱高溫加熱法，以鎮(zhèn)痛藥效、急性毒性為評價(jià)指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇炮制時間、炮制溫度為自變量，采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)(Central Composite Design)-響應(yīng)面法優(yōu)選鉤吻炮制工藝的研究。研究發(fā)現(xiàn)，在鉤吻190～230 ℃溫度下，經(jīng)過10～60 min的炮制后，經(jīng)炮制以后減毒明顯降低，仍然保留一定的鎮(zhèn)痛效應(yīng)，對炮制品的外觀、毒性和鎮(zhèn)痛藥效綜合考慮，在炮制溫度200～220 ℃，炮制時間在10～20 min內(nèi)進(jìn)行最佳工藝優(yōu)選，得到鉤吻的最佳炮制工藝，炮制溫度210 ℃，炮制時間15 min，在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)性，結(jié)果與實(shí)驗(yàn)預(yù)測值較為接近，說明采用響應(yīng)面法得到的工藝參數(shù)可靠，具有一定的實(shí)用價(jià)值。鉤吻炮制后毒性明顯降低，同時又保留了原來良好的鎮(zhèn)痛藥效，取得了良好的預(yù)期結(jié)果。對其炮制前后化學(xué)成分變化規(guī)律的研究結(jié)果將在另文探討。

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ExperimentalStudyontheToxicityAttenuationandEfficacyReservationofPuerariaIobataBasedonSpectrum-effectRelation

WUShui-sheng1,LIDe-sen1,XUHao-ran2,LIAOHua-jun1,CHENLiang3,LIDan3

(1.FujianUniversityofTCM,Fuzhou350122,China; 2.NorthMalaysiaTCMCollege,Penang13200,Malaysia; 3.FuzhouTCMHospitalAffiliatedtoFujianUniversityofTCM,Fuzhou350001,China)

Objective: To study the toxicity attenuation and efficacy reservation ofPuerariaIobataprocessed by hot sand frying. Methods: Analgesic effect and acute toxicity were taken as evaluation index to select the preferable process by using oven heating method, with processing time and processing temperature as the independent variable in central composite design-response surface test. Results: The toxicity was significantly reduced, and certain analgesic effect was retained inPuerariaIobataunder 190～230 ℃ after 10～60 min of preparation. After comprehensive consideration, the optimized process was narrowed down to temperature of 200～220 ℃ and time 10～20 min after. The best process was finally confirmed at temperature of 210℃, processing time was 15min. Under this condition, the experimental results were in good agreement with the experimental predictions, which showed that the process parameters obtained by response surface method were reliable and had practical value. Conclusion: Hot sand frying can attenuate the toxicity and preserve analgesic effect ofPuerariaIobata.

PuerariaIobata; Processing; Toxicity attenuation and efficacy reservation; Central composite design - response surface methodology

R283.1

A

1002-2392(2017)05-0080-05

2017-04-24

2017-09-20

福州市科技局資助項(xiàng)目(2014-S-140-3)

吳水生(1965-)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。

*通訊作者：廖華軍(1977-)，男，博士，副教授，主要從事中藥活性成分、中藥藥性理論及炮制研究。