張來(lái)軍,李曉梅,陳永敢,陳 攀,杭瑜瑜,公維潔

(海南熱帶海洋學(xué)院 生命科學(xué)與生態(tài)學(xué)院,海南 三亞 572022)

重金屬脅迫對(duì)羅非魚(yú)血細(xì)胞DNA損傷的影響

張來(lái)軍,李曉梅,陳永敢,陳 攀,杭瑜瑜,公維潔

(海南熱帶海洋學(xué)院 生命科學(xué)與生態(tài)學(xué)院,海南 三亞 572022)

為研究重金屬對(duì)魚(yú)類的毒性效應(yīng),將羅非魚(yú)血細(xì)胞分別暴露于低、中、高三種不同濃度的四種重金屬溶液Cr(VI)、Pb、Cu、Hg中2 h,采用單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)(彗星電泳)技術(shù)檢測(cè)血細(xì)胞的DNA損傷程度,對(duì)照組不加任何重金屬,檢測(cè)指標(biāo)包括尾部DNA含量、尾長(zhǎng)、尾矩、Olive尾矩.結(jié)果顯示,魚(yú)血細(xì)胞對(duì)四種重金屬脅迫均極為敏感,隨重金屬脅迫濃度的升高,DNA損傷程度增加.因此,羅非魚(yú)可作為評(píng)價(jià)重金屬污染遺傳毒性損傷的敏感性生物標(biāo)記物.

單細(xì)胞凝膠電泳;魚(yú)血細(xì)胞;重金屬污染;DNA損傷

0 引言

重金屬污染,是指由重金屬或其化合物造成的環(huán)境污染.隨著城市現(xiàn)代化和工業(yè)化的加速發(fā)展,導(dǎo)致重金屬污染物通過(guò)河流、排泄口、家庭污水管、大氣遷移和沿海傾倒的廢物進(jìn)入海洋.由于重金屬具有不易移動(dòng)、難溶解,以及富集性的特性,很難在環(huán)境中降解,進(jìn)入生物體后也難以被排出,從而造成生物體慢性中毒,以致水體中痕量重金屬通過(guò)食物鏈的各個(gè)環(huán)節(jié)對(duì)生態(tài)系統(tǒng)造成危害并最終危及人類的健康.為了能準(zhǔn)確、及時(shí)、全面地反映海洋環(huán)境質(zhì)量現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢(shì),需要隨時(shí)進(jìn)行環(huán)境檢測(cè)[1].

近年來(lái),單細(xì)胞凝膠電泳(single cell gel eletrophoresis,SCGE),或彗星電泳(Comet assay)技術(shù)常被用于水環(huán)境污染遺傳毒理學(xué)檢測(cè)[2-4].這一技術(shù)最早用于動(dòng)物細(xì)胞 DNA 損傷檢測(cè),具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏等特點(diǎn),現(xiàn)在已廣泛應(yīng)用于各種真核生物不同類型的細(xì)胞試驗(yàn).外界環(huán)境中的理化因素會(huì)對(duì)細(xì)胞DNA造成損傷,進(jìn)而可能引起基因突變或癌變,所以判斷細(xì)胞DNA是否損傷是環(huán)境監(jiān)測(cè)中重要的一環(huán).在1999年舉行的國(guó)際基因毒性檢驗(yàn)程序?qū)ｎ}學(xué)術(shù)討論會(huì)中,單細(xì)胞凝膠電泳(pH>13)被定為確定某物質(zhì)是否具有基因毒性的最佳方法[5].

羅非魚(yú)生長(zhǎng)于16～38℃的水域,為廣鹽性魚(yú)類,海淡水中均可生存,耐低氧.本研究以羅非魚(yú)為實(shí)驗(yàn)材料,采用單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù),檢測(cè)四種重金屬Cr6+、Pb2+、Cu2+、Hg2+脅迫對(duì)羅非魚(yú)外周血細(xì)胞DNA 的損傷,為重金屬脅迫的血液毒理學(xué)以及評(píng)價(jià)重金屬對(duì)海洋環(huán)境中生物的影響提供參考資料.

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器

正常熔點(diǎn)瓊脂糖(NMA, 西班牙),低熔點(diǎn)瓊脂糖(LMA),Triton X-100,肌氨酸鈉, DMSO,上述試劑均為Amresco分裝產(chǎn)品.重鉻酸鉀、硫酸銅、醋酸鉛和氯化汞均為國(guó)產(chǎn)分析純.倒置熒光顯微鏡(德國(guó)Leica 公司DMI 3000),電泳儀(Tanon EPS 300),電泳槽(北京六一,DYCP-33A).

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

羅非魚(yú)購(gòu)自海南省三亞市荔枝溝農(nóng)貿(mào)市場(chǎng),為海水養(yǎng)殖魚(yú),體長(zhǎng)不超過(guò)15 cm.試驗(yàn)前用曝氣自來(lái)水加天然海水,配制成鹽度為17‰～20‰的實(shí)驗(yàn)用水,馴養(yǎng)1 周,每天換水1次,試驗(yàn)時(shí)挑選健康正常個(gè)體進(jìn)行處理.

1.3試驗(yàn)方法

用肝素處理的注射器鰓動(dòng)脈無(wú)菌取血,血液用PBS緩沖液稀釋到105～106cell/mL,等體積分到不同的離心管中.Cr6+、Pb2+、Cu2+、Hg2+離子脅迫濃度分別按《漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》(GB 11607)最高限量值的100倍、500倍和1000倍設(shè)置成低濃度組、中濃度組和高濃度組三個(gè)脅迫濃度組,具體脅迫濃度如表1至表4中所示.空白對(duì)照組不加任何重金屬離子,25 ℃脅迫2 h.脅迫結(jié)束后,血細(xì)胞以1000 r/m離心收集,再用PBS緩沖液沖洗1次,離心,重新加入PBS,調(diào)整細(xì)胞密度,觀察細(xì)胞活力,準(zhǔn)備電泳.

1.4單細(xì)胞凝膠電泳

按Zhang[6]等改良方法進(jìn)行單細(xì)胞凝膠電泳.將潔凈的載玻片在0.6%的常熔點(diǎn)瓊脂糖中浸沒(méi)后取出,置37 ℃烘箱烘烤過(guò)夜以備電泳;將血細(xì)胞懸液和1%低熔點(diǎn)瓊脂糖等體積混合均勻,鋪在預(yù)處理后的載玻片上,4 ℃固化5 min,將載玻片放入新鮮配制的裂解液(2.5 mol·L-1NaCl,0.1 mol·L-1EDTA,0.01 mol·L-1Tris,1%肌氨酸鈉,pH 10,1% Triton X-100,10% DMSO)中,裂解1 h;蒸餾水沖洗后,再放入電泳緩沖液(0.3 mol·L-1NaOH,1mmol·L-1EDTA,pH>13)中,變性解旋20 min;電泳20 min(26 V,300 mA);400 mmol·L-1Tris緩沖液(pH 7.5)中和3次;從裂解到中和的所有過(guò)程需在4 ℃下進(jìn)行.將載玻片置于冰冷的無(wú)水乙醇中,脫水10 min,室溫晾干, EB(20 μg· mL-1)染色,鏡檢,照相.也可不經(jīng)過(guò)脫水過(guò)程,直接染色觀察.

1.5彗星圖像分析和數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)處理隨機(jī)取約50個(gè)細(xì)胞圖像,用CASP軟件進(jìn)行分析,可得到諸多反應(yīng)DNA損傷程度的參數(shù),本文選擇尾部DNA含量(TDNA%)、尾長(zhǎng)(TailLength,TL)、尾矩(TailMomen,TM)和Olive尾矩(Olive TailMoment,OTM)四種參數(shù)作為衡量細(xì)胞DNA損傷程度的評(píng)價(jià)指標(biāo).

用SPSS13.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA),比較各濃度組之間及其與對(duì)照組之間各組數(shù)據(jù)差異的顯著性,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.

2 結(jié)果與分析

2.1重金屬Cu2+脅迫對(duì)羅非魚(yú)血細(xì)胞DNA損傷的形態(tài)觀察

圖1為Cu2+脅迫對(duì)羅非魚(yú)血細(xì)胞影響的幾種典型彗星圖像.其中圖 1A是空白對(duì)照組,其血細(xì)胞核大小均勻,呈圓形熒光團(tuán),彗星頭部DNA集中,亮度強(qiáng),無(wú)拖尾或輕微拖尾現(xiàn)象;DNA 受損的血細(xì)胞由于其DNA鏈斷裂,電泳時(shí)斷片向陽(yáng)極移動(dòng),產(chǎn)生彗星樣拖尾,且隨著Cu2+濃度的提高,DNA鏈斷裂程度由輕到重,彗尾逐漸變長(zhǎng),并在一定程度下熒光強(qiáng)度增加;彗星頭部逐漸變小,熒光強(qiáng)度逐漸變?nèi)?圖 1B、C、D).

注：A:空白對(duì)照組;B:1 mg·L-1 ;C:10 mg·L-1;D:15 mg·L-1圖1 不同濃度Cu2+引起羅非魚(yú)血細(xì)胞 DNA 受損典型彗星電泳圖像(×200)

2.2四種重金屬對(duì)羅非魚(yú)血細(xì)胞DNA損傷的影響彗星電泳結(jié)果

經(jīng)彗星圖像分析軟件CASP軟件處理彗星圖像后,得到的 TDNA%、TL、TM、OTM四個(gè)參數(shù)數(shù)值經(jīng)SPSS統(tǒng)計(jì)處理后,用Mean±SD表示.四種重金屬離子Cr6+、Pb2+、Cu2+、Hg2+對(duì)魚(yú)血細(xì)胞DNA損傷的分析結(jié)果以下列各表所示.

表1 不同劑量Cr6+對(duì)羅非魚(yú)血細(xì)胞DNA損傷的彗星電泳結(jié)果

注：與對(duì)照組比較“*”表示差異顯著(P<0.05),“**”表示差異極顯著(0.05

由表1數(shù)據(jù)可知,低、中和高3個(gè)Cr6+濃度組的4項(xiàng)指標(biāo)值顯著高于對(duì)照組(P<0.05),其中高濃度組與對(duì)照組之間的差異達(dá)到極顯著水平(P<0.01),且與低濃度組和中濃度組之間也具有差異(P<0.05).但是低濃度組與中濃度組之間比較差異不顯著(P>0.05).因此隨Cr6+脅迫濃度的提高,TDNA%、TL、TM和OTM的值也隨之增加,魚(yú)血細(xì)胞DNA損傷越嚴(yán)重.Cr6+脅迫濃度與DNA損傷程度二者間存在著明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系.四種參數(shù)中,TDNA%、TM和OTM最能夠體現(xiàn)出劑量-效應(yīng)關(guān)系.

表2 不同劑量Pb2+對(duì)羅非魚(yú)血細(xì)胞DNA損傷的彗星電泳結(jié)果

注：“*”表示與對(duì)照組比較差異顯著(P<0.05)

由表2可知,隨Pb2+脅迫濃度的增加,TDNA%、TL、TM和OTM的值也隨之增加.高濃度組的四項(xiàng)指標(biāo)分別顯著高于對(duì)照組和低濃度組(P<0.05),中濃度組的TDNA%和OTM與對(duì)照組比較也具有顯著差異(P<0.05),而低濃度組除OTM高于對(duì)照組(P<0.05)外,其他指標(biāo)與對(duì)照組比較沒(méi)有差異(P>0.05).Pb2+脅迫濃度與DNA損傷程度二者間也存在著明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系.

表3 不同劑量Cu2+對(duì)羅非魚(yú)血細(xì)胞DNA損傷的彗星電泳結(jié)果

注：與對(duì)照組比較“*”表示差異顯著(P<0.05),“**”表示差異極顯著(0.05

由表3可知,隨Cu2+脅迫濃度增加,四項(xiàng)指標(biāo)TDNA%、TL、TM和OTM的值也明顯增加.低、中和高三個(gè)濃度組的4項(xiàng)指標(biāo)與對(duì)照組各值比較均有極顯著差異(P<0.01);且高濃度組的4項(xiàng)指標(biāo)還顯著高于中、低兩個(gè)濃度組(P<0.05)(數(shù)據(jù)未顯示).在實(shí)驗(yàn)所設(shè)濃度范圍內(nèi),隨Cu2+脅迫的濃度增加,魚(yú)血細(xì)胞DNA損傷加重,Cu2+濃度與DNA損傷程度之間存在顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系.

表4 不同劑量Hg2+對(duì)羅非魚(yú)血細(xì)胞DNA損傷的彗星電泳結(jié)果

注：與對(duì)照組比較“*”表示差異顯著(P<0.05),“**”表示差異極顯著(0.05

由表4可知,隨Hg2+脅迫濃度的升高,TDNA%、TL、TM和OTM的值隨之增加.高、中和低3個(gè)濃度組的4項(xiàng)指標(biāo)均顯著高于對(duì)照組(P< 0.05),其中高濃度組的TDNA%值顯著大于中、低2個(gè)濃度組(P<0.05).在實(shí)驗(yàn)所設(shè)濃度范圍內(nèi),隨脅迫的Hg2+濃度增加,魚(yú)血細(xì)胞DNA損傷加重,二者間存在明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系.

因此,魚(yú)血細(xì)胞對(duì)四種重金屬污染極為敏感,隨重金屬脅迫濃度升高血細(xì)胞DNA損傷嚴(yán)重.四種參數(shù)TDNA%、TL、TM、OTM中,TDNA%和OTM最能體現(xiàn)出重金屬脅迫濃度與DNA損傷程度之間的劑量-效應(yīng)關(guān)系.

3 討論

重金屬污染與其他污染相比,具有范圍廣、長(zhǎng)期持久和不可逆等特點(diǎn),可以長(zhǎng)期留在水體和土壤中,再通過(guò)富集作用大量積累在植物體內(nèi),或通過(guò)食物鏈進(jìn)入到動(dòng)物體內(nèi).實(shí)驗(yàn)室條件下,海水中的鎘能迅速而大量的蓄積于波紋巴菲蛤的內(nèi)臟團(tuán)、腮和肌肉組織中[7],而近江牡蠣的體內(nèi)也具有蓄積大量鉛的能力[8].進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)的重金屬影響生長(zhǎng)發(fā)育,破壞正常的細(xì)胞活動(dòng),嚴(yán)重時(shí)引起死亡.重金屬脅迫對(duì)動(dòng)物DNA的影響表現(xiàn)為引起堿基損傷、DNA鏈斷裂、鏈內(nèi)或鏈間交聯(lián)等,從而影響DNA的完整性,產(chǎn)生遺傳毒性,因此檢測(cè)動(dòng)物細(xì)胞DNA損傷是評(píng)價(jià)環(huán)境污染物遺傳毒性的一個(gè)重要參數(shù).而單細(xì)胞凝膠電泳是迄今檢測(cè)DNA損傷非常靈敏的方法;魚(yú)類是首批與彗星電泳密切結(jié)合用于水環(huán)境毒理學(xué)領(lǐng)域研究的動(dòng)物模型.Pandrangi等在1995最先將兩種淡水魚(yú)美洲洄魚(yú)(Ameiurusnebulosus)和鯉魚(yú)(Cyprinuscarpio)作為實(shí)驗(yàn)材料檢測(cè)湖底沉積物中有毒廢料的毒性效果[9].但是迄今為止海洋環(huán)境中應(yīng)用于彗星電泳的魚(yú)種類極為有限,僅有十多種.最常用的是鰈形目魚(yú)類[10-11],細(xì)鱗鯻(Theraponjarbua)[12-13],雜斑盔魚(yú)(Corisjulis)[14-15],以及海鱸魚(yú)[16-17],分別用于檢測(cè)重金屬[13,17]、有機(jī)物[10-11]、農(nóng)藥[12]等污染物對(duì)魚(yú)類的影響;我國(guó)僅有大彈涂魚(yú)一種被用于彗星電泳研究,檢測(cè)鎘、鉛、鉻等重金屬對(duì)其外周血細(xì)胞DNA損傷的影響[18-20].我國(guó)用于海洋污染監(jiān)測(cè)的物種,包括魚(yú)類,大多數(shù)未實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化和實(shí)現(xiàn)市場(chǎng)化供應(yīng),因此開(kāi)展海洋污染物生物監(jiān)測(cè)迫切需要建立標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物.

羅非魚(yú)作為彗星電泳的實(shí)驗(yàn)材料曾用于軟骨藻酸(Domoic acid, DA)和苯并(a) 芘的毒性檢測(cè)[21-22].本實(shí)驗(yàn)用四種重金屬Cr6+、Pb2+、Cu2+、Hg2+脅迫羅非魚(yú)血細(xì)胞,彗星電泳檢測(cè)DNA損傷程度,發(fā)現(xiàn)四種重金屬均引起了羅非魚(yú)血細(xì)胞DNA損傷,且損傷的程度隨重金屬脅迫的濃度升高而加劇.說(shuō)明羅非魚(yú)對(duì)環(huán)境污染物,包括重金屬污染較為敏感,可以將這種魚(yú)類作為指示生物用于水環(huán)境污染生物檢測(cè)研究.

[1]閻鐵,呂海晶.海洋環(huán)境污染生物監(jiān)測(cè)規(guī)劃的制定[J].海洋環(huán)境科學(xué),1987,3(6):55-59.

[2]SRUT M,TRAVEN L,STAMBUK A,et al.Genotoxicity of marine sediments in the fish hepatoma cell line PLHC-1 as assessed by the Comet assay [J].Toxicology in Vitro,2011,25(1):308-314.

[3]SULLIVAN C,MITCHELMORE C L,HALE R C,et al.Induction of CYP1A and DNA damage in the fathead minnow (Pimephalespromelas) following exposure to biosolids [J].Science of the Total Environment,2007,384(1-3):221-228.

[4]GUILHERME S,GAIVAO I,SANTOS M A,et al.European eel (Anguillaanguilla) genotoxic and pro-oxidant responses following short-term exposure to Roundup-a glyphosate-based herbicide [J].Mutagenesis,2010,25(5):523-530.

[5]TICE R R,AGURELL E,ANDERSON D,et al.Single cell gel/ comet assay:guidelines for in vitro and in vivo genetic toxicology testing [J].Environmental and Molecular Mutagenesis,2000,35(3):206-221.

[6]ZHANG L J,JIA JF,HAO J G,et al.A modified protocol for the comet assay allowing the processing of multiple samples [J].Mutation Research,2011,721(2):153-156.

[7]于淑池,符修正,王昌昊,等.鎘對(duì)波紋巴非哈(Paphiaundulata)的急性毒性及組織蓄積性研究[J].瓊州學(xué)院學(xué)報(bào),2016,23(2):35-39.

[8]李曉梅,郭體環(huán),張來(lái)軍.鉛對(duì)近江牡蝠的急性毒性研究[J].瓊州學(xué)院學(xué)報(bào),2015,22(5):77-80.

[9]PANDRANGI R,PETRAS M,RALPH S,et al.Alkaline single cell gel (comet) assay and genotoxicity monitoring using bullheads and carp[J].Environmental and Molecular Mutagenesis,1995,26(4),345-356.

[10]LE D,LACOSTE M,AKCHA F,DEVIER M H,et al.Comparative study of different exposure routes on the biotransformation and genotoxicity of PAHs in the flatfish species,Scophthalmus maximus [J].Environmental Science and Pollution Research International,2013,20(2):690-707.

[11]WESSEL N,MENARD D,PICHAVANT-RAFINI K,et al.Genotoxic and enzymatic effects of fluoranthene in microsomes and freshly isolated hepatocytes from sole (Solea solea)[J].Aquatic Toxicology,2012,108(1):33-41.

[12]DEVI V J,NAGARANI N,BABU M Y,et al.Genotoxic effects of profenofos on the marine fish,Therapon jarbua[J].Toxicology Mechanisms and Methods,2012,22(2):111-117.

[13]NAGARANI N,DEVI V J,KUMARAGURU A K.Identification of DNA damage in marine fish Therapon jarbua by comet assay technique[J].Journal of Environmental Biology,2012:33(4):699-703.

[14]TOMASELLO B,COPT C,PUVIRENTI V,et al.Biochemical and bioaccumulation approaches for investigating marine pollution using Mediterranean rainbow wrasse,Coris julis (Linneaus 1798)[J].Ecotoxicology and Environmental Safety,2012,86(4):168-175.

[15]FASULO S,MARINO S,MAUCERI A,et al.A multibiomarker approach in Coris julis living in a natural environment [J].Ecotoxicology and Environmental Safety,2010,73(7):1565-1573.

[16]SRUT M,STAMBUK A,PAVLICA M,et al.Cage exposure of European sea bas (Dicentrarchus labrax) for in situ assessment of pollution-related genotoxicity [J].Arh Hig Rada Toksikol,2010,61(1):29-36.

[17]LABIENIEC M,MILOWSKA K,BALCERCZYK A,et al.Interactions of free copper (II) ions alone or in complex with iron (III) ions with erythrocytes of marine fish Dicentrarchus labrax[J].Cell Biology International,2009,33(9):941-948.

[18]陳寅兒,徐鎮(zhèn).SCGE技術(shù)檢測(cè)鎘對(duì)大彈涂魚(yú)外周血細(xì)胞DNA損傷[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué),2010,29(2):369-374.

[19]梁亞芳,苗亮,李明云,等.鉛、鉻脅迫對(duì)大彈涂魚(yú)血細(xì)胞遺傳損傷的彗星實(shí)驗(yàn)檢測(cè)[J].生物學(xué)雜志,2014,31(6):35-38.

[20]金春華,李明云,劉偉成,等.鎘脅迫對(duì)大彈涂魚(yú)(Boleophthalmuspectinirostris)血細(xì)胞遺傳損傷的研究[J].海洋與湖沼,2010,41(1):80-84.

[21]CAVA T,KNEN S.In vivo genotoxicity testing of the amnesic shellfish poison (domoic acid) in piscine erythrocytes using the micronucleus test and the comet assay [J].Aquatic Toxicology,2008,90(2):154-159.

[22]宋超,范立民,孟順龍,等.苯并(a)芘對(duì)羅非魚(yú)(GIFTOreochromisniloticus) 肝細(xì)胞DNA損傷的影響[J].生態(tài)環(huán)境學(xué)報(bào),2013,22(9):1583-1587.

DNADamageinHemocytesofTilapia(Oreochromisniloticus)InducedbyHeavyMetalswithSCGETechnique

ZHANG Lai-jun, LI Xiao-mei, CHEN Yong-gan, CHEN Pan, HANG Yu-yu, GONG Wei-jie

(School of Life Sciences and Ecology, Hainan Tropical Ocean University, Sanya Hainan 572022, China)

To investigate the toxic effects of heavy metal on marine fish, hemocytes ofOreochromisniloticuswere respectively exposed to four kinds solution— Cr(VI), Pb, Cu and Hg, each with three concentrations.Then the DNA damage to hemolymph cells was detected by single cell gel electrophoresis(comet assay) after two hours, whereas the control group did not add any heavy metal.The detection indexes include tail DNA content, tail length, tail moment and Olive tail moment.Results showed that blood cells were highly sensitive to the four kinds of heavy metal.Furthermore, with the increase of the concentration of heavy metal, the degree of DNA damage increased.Therefore,Oreochromisniloticuscan be a sensitive biological marker to evaluate the genetic toxicity effects of heavy metals.

single cell gel electrophoresis;Oreochromisniloticushemocytes; heavy metal; genetic damage

格式：張來(lái)軍,李曉梅,陳永敢,等.重金屬脅迫對(duì)羅非魚(yú)血細(xì)胞DNA損傷的影響[J].海南熱帶海洋學(xué)院學(xué)報(bào),2017,24(5)：31-35.

2017-06-11

國(guó)家自然科學(xué)基金(31260139);海南省自然科學(xué)基金(313050)

張來(lái)軍(1968-),女,甘肅慶陽(yáng)人,海南熱帶海洋學(xué)院生命科學(xué)與生態(tài)學(xué)院副教授,博士,研究方向?yàn)榧?xì)胞生物學(xué).

Q75；X55

A

2096-3122(2017) 05-0031-05

10.13307/j.issn.2096-3122.2017.05.06

(編校李由明)