何 煒，孫繼芾，蔣潤宇，張志堅，陳 謙，黃永輝

1江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院骨科，江蘇鎮(zhèn)江 212001 2江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)與臨床醫(yī)學(xué)研究中心，江蘇鎮(zhèn)江 212013

·論著·

大鼠脊髓神經(jīng)元缺氧復(fù)氧損傷中鈣敏感受體對其凋亡的影響及意義

何 煒1，孫繼芾1，蔣潤宇1，張志堅2，陳 謙2，黃永輝1

1江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院骨科，江蘇鎮(zhèn)江 2120012江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)與臨床醫(yī)學(xué)研究中心，江蘇鎮(zhèn)江 212013

目的探究大鼠脊髓神經(jīng)元缺氧復(fù)氧損傷中鈣敏感受體對其凋亡的影響及意義。方法將新生SD大鼠脊髓神經(jīng)元隨機分為正常對照組、缺氧復(fù)氧組、激動劑(GdCl3)組和抑制劑(NPS- 2390)組4組。采用95%氮氣通入置有細胞培養(yǎng)板的密閉通氣盒中15 min，37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1 h，再用含2%B27、10%胎牛血清的Neurobasol-A液培養(yǎng)細胞24 h復(fù)制缺氧復(fù)氧模型。應(yīng)用免疫熒光技術(shù)鑒定脊髓神經(jīng)元并觀察鈣敏感受體的表達定位，Western blot法檢測各組鈣敏感受體及凋亡相關(guān)蛋白Caspase- 3、Bax、Bcl- 2的表達水平，激光共聚焦顯微鏡測定細胞內(nèi)游離鈣的變化，Tunel法觀察各組細胞凋亡情況。結(jié)果缺氧復(fù)氧組的鈣敏感受體(t=5.462，P=0.006)、細胞內(nèi)游離鈣(t=8.573，P=0.001)、細胞凋亡(t=4.899，P=0.008)、Caspase- 3(t=5.118，P=0.007)和Bax(t=10.930，P=0.001)表達水平均明顯高于對照組，激動劑組的鈣敏感受體(t=4.975，P=0.008)、細胞內(nèi)游離鈣(t=4.899，P=0.008)、細胞凋亡(t=7.746，P=0.002)、Caspase- 3(t=4.776，P=0.009)和Bax(t=5.281，P=0.006)表達水平均明顯高于缺氧復(fù)氧組，抑制劑組的鈣敏感受體(t=3.674，P=0.021)、細胞內(nèi)游離鈣(t=3.846，P=0.018)、細胞凋亡(t=4.281，P=0.013)、Caspase- 3(t=3.521，P=0.024)和Bax(t=3.473，P=0.026)表達水平均明顯低于缺氧復(fù)氧組；缺氧復(fù)氧組的Bcl- 2表達水平明顯低于對照組(t=6.242，P=0.003)，激動劑組明顯低于缺氧復(fù)氧組(t=3.028，P=0.004)，抑制劑組明顯高于缺氧復(fù)氧組(t=2.840，P=0.047)。結(jié)論在缺氧復(fù)氧損傷過程中，鈣敏感受體表達增多，細胞內(nèi)游離鈣增加，脊髓神經(jīng)元凋亡增多。

缺氧復(fù)氧；鈣敏感受體；凋亡；脊髓神經(jīng)元

脊髓缺血再灌注損傷是指在短時間脊髓血供中斷，一定時間內(nèi)恢復(fù)血供，在原有缺血性損害基礎(chǔ)上發(fā)生更嚴重的損傷[1]。鈣超載是引起缺血再灌注損傷的主要機制。鈣離子在正常生理情況下是脊髓神經(jīng)元的重要信號分子，調(diào)節(jié)其諸多功能，而在缺血再灌注損傷中，鈣離子在胞內(nèi)積聚，往往導(dǎo)致脊髓神經(jīng)元損傷甚至死亡[2]。關(guān)于誘發(fā)脊髓神經(jīng)元中鈣超載的研究目前甚少，其中Wang等[3]已證實鈣敏感受體(calcium-sensing receptor，CaSR)能介導(dǎo)心肌細胞內(nèi)鈣濃度的升高，引起鈣超載，最終導(dǎo)致細胞凋亡[4]。本研究通過體外培養(yǎng)脊髓神經(jīng)元，模擬缺氧/復(fù)氧損傷模型，檢測大鼠脊髓神經(jīng)元中是否存在CaSR及其表達水平，探究CaSR表達增多是否誘發(fā)鈣超載并引起神經(jīng)元的凋亡，為進一步研究脊髓缺血再灌注損傷的發(fā)生機制提供依據(jù)。

材料和方法

材料出生1 d的新生SD大鼠由江蘇大學(xué)動物中心提供[動物許可證號：SYXK(蘇)2008- 0024]；Neurobasal-A培養(yǎng)基、DMEM/F12、無糖DMEM、胎牛血清、胰蛋白酶、B27添加劑(美國Gibco公司)，神經(jīng)絲蛋白抗體NF200、Caspase- 3、Bax、Bcl- 2、羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗、Cy3-羊抗兔二抗(武漢博士德生物科技)，CaSR(英國Abcam公司)，CaSR激動劑三氯化釓(GdCl3，上海紫一試劑廠)，CaSR抑制劑NPS- 2390(美國Tocris公司)，熒光染料Hoechst33258(碧云天生物公司)；Tunel試劑盒(凱基生物)，多聚賴氨酸、鈣離子熒光探針(Fluo- 3/AM)(美國Sigma公司)。

新生大鼠脊髓神經(jīng)元的培養(yǎng)在無菌條件下分離出新生1 d的SD大鼠脊髓，剝離脊膜和血管組織，剪碎后用0.125%的胰蛋白酶溶液37 ℃消化20 min，隨后棄去消化液置于培養(yǎng)液(DMEM/F12+10%胎牛血清+2 mmol/L谷氨酰胺+100 U/ml氨芐西林+100 U/ml鏈霉素)中，再用巴式管吹打后用篩網(wǎng)制成細胞懸液，以6×105/ml的密度接種于預(yù)先用0.1 mg/ml多聚賴氨酸包被的6孔培養(yǎng)板。最后置于37 ℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。12 h后，將培養(yǎng)液更換為含有2%B27和10%胎牛血清的Neurobasal-A培養(yǎng)液(100 U/ml氨芐西林+100 U/ml鏈霉素)。細胞培養(yǎng)7～8 d后用于實驗。

免疫熒光法鑒定神經(jīng)元并觀察CaSR的表達定位將培養(yǎng)板中的細胞用PBS輕微沖洗，4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗3遍；1%Triton X- 100室溫通透30 min，PBS洗3遍；滴加1%山羊血清(BSA)37 ℃封閉60 min；分別用神經(jīng)絲蛋白(NF200)、CaSR抗體(1∶100)4 ℃孵育過夜；PBS洗3遍，熒光二抗(1∶200)濕盒中避光37 ℃孵育2 h，PBS洗3遍；Hoechst33258(1∶5000)避光孵育30 min，PBS洗3遍后用甘油封片，在熒光顯微鏡下采集圖像。

細胞缺氧復(fù)氧模型的建立用無糖DMEM培養(yǎng)液替換正常培養(yǎng)液，置于密閉通氣盒中，通入95%氮氣15 min后，37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1 h，之后用正常培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后處理。

細胞分組將培養(yǎng)的神經(jīng)元隨機分成4組：(1)對照組：細胞不經(jīng)任何處理；(2)缺氧復(fù)氧組：為缺血缺氧模型神經(jīng)元；(3)激動劑組：復(fù)氧剛開始時加入400 μmol/L GdCl3；(4)抑制劑組：復(fù)氧剛開始時加入25 μmol/L NPS- 2390。

Westernblot檢測CaSR、Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白的表達生長良好的神經(jīng)元分組施加因素后去除培養(yǎng)液，用PBS洗3次，刮取細胞移入Eppendorf管并加入全細胞裂解液，冰上孵育10 min，4 ℃條件下12 000 r/min離心15 min，取上清。采用考馬斯亮藍法測定蛋白定量值。隨后取30 μg蛋白樣品于10% SDS-PAGE凝膠上分離蛋白質(zhì)(80 V/30 min，120 V/60 min)；使用Bio-Rad的標準濕式轉(zhuǎn)膜裝置，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上(350 mA，4 ℃轉(zhuǎn)膜2 h)；脫脂奶粉(TBST5%稀釋)室溫封閉1 h；分別用CaSR(1∶600)，Caspase- 3、Bax、Bcl- 2(1∶300)4 ℃孵育過夜，洗膜后二抗(1∶8000)室溫孵育1 h，TBST洗3次，最后曝光顯色。

激光共聚焦檢測細胞內(nèi)游離鈣濃度將分組處理后的細胞用PBS輕微沖洗，加入Fluo- 3/AM(10 μmol/L)，37 ℃恒溫箱中避光孵育60 min，PBS沖洗。在激光共聚焦顯微鏡下掃描細胞內(nèi)熒光強度，激發(fā)波長為488 nm，探測波長為520 nm。分別取10個細胞記錄其均值。

Tunel法檢測細胞凋亡分組處理后的細胞用PBS輕微沖洗，4%多聚甲醛固定30min，PBS洗3次；1%TritonX- 100室溫通透30min，PBS洗3次；滴加3%H2O2封閉液，室溫封閉60min，PBS洗3次；每個樣本滴加50μl標記預(yù)混液，37 ℃避光反應(yīng)90min，PBS洗3次；DAB染色液室溫顯色10min，PBS洗3次；加入1%鹽酸甲醇溶液分化5s，立即用蒸餾水沖洗；分別用70%、85%、95%、無水乙醇洗5min；晾干后加上中性甘油，光學(xué)顯微鏡下觀察。

統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

脊髓神經(jīng)元的鑒定及CaSR表達定位神經(jīng)絲蛋白免疫熒光染色結(jié)果顯示，脊髓神經(jīng)元胞體及突起呈陽性染色。CaSR在脊髓神經(jīng)元中表達，分布于神經(jīng)元的胞質(zhì)和突起部(圖1)。

圖1 神經(jīng)絲蛋白(NF200)熒光染色(A)及鈣敏感受體的表達定位(B)

Fig1 Fluorescent staining of neurofilament(NF200)(A)and expression and localization of calcium-sensing receptor(B)

CaSR的表達情況Western blot檢測結(jié)果顯示，正常脊髓神經(jīng)元中有CaSR表達。對照組、缺氧復(fù)氧組、激動劑組和抑制劑組的CaSR表達水平分別為0.1733±0.0285、0.3867±0.0318、0.6133±0.0339和0.2612±0.0219，其中，缺氧復(fù)氧組明顯高于對照組(t=5.462，P=0.006)，激動劑組明顯高于缺氧復(fù)氧組(t=4.975，P=0.008)；抑制劑組明顯低于缺氧復(fù)氧組(t=3.674，P=0.021)(圖2)。

細胞內(nèi)游離鈣水平對照組、缺氧復(fù)氧組、激動劑組和抑制劑組的細胞內(nèi)游離鈣水平分別為256.3±57.7、633.3±33.3、1021.0±61.6和474.4±24.4，其中，缺氧復(fù)氧組明顯高于對照組(t=8.573，P=0.001)，激動劑組明顯高于缺氧復(fù)氧組(t=4.899，P=0.008)，抑制劑組明顯低于缺氧復(fù)氧組(t=3.846，P=0.018)(圖3)。

Mr：相對分子質(zhì)量；A/R：缺氧復(fù)氧

Mr：relative molecular mass；A/R：anoxia/reoxygenation

圖2 Western blotting檢測各組鈣敏感受體的表達

Fig2 Expression of calcium-sensing receptor in each group detected by Western blotting

細胞凋亡情況細胞Tunel染色后，凋亡細胞呈棕褐色。對照組、缺氧復(fù)氧組、激動劑組和抑制劑組的細胞凋亡水平分別為10.33±2.96、28.33±1.67、46.68±1.68和18.38±1.62，其中，缺氧復(fù)氧組的凋亡細胞明顯多于對照組(t=4.899，P=0.008)，激動劑組明顯多于缺氧復(fù)氧組(t=7.746，P=0.002)，抑制劑組明顯低于缺氧復(fù)氧組(t=4.281，P=0.013)(圖4)。

凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、Bax、Bcl-2的表達情況Western blot檢測結(jié)果顯示，對照組、缺氧復(fù)氧組、激動劑組和抑制劑組的Caspase- 3剪切體表達水平分別為0.8412±0.0551、1.2610±0.0608、1.6800±0.0635和1.0070±0.0384，Bax表達水平分別為0.8233±0.0694、1.8100±0.0577、2.3670±0.0882和1.3120±0.1312，其中，缺氧復(fù)氧組Caspase- 3剪切體(t=5.118，P=0.007)和Bax(t=10.930，P=0.001)的表達均明顯高于對照組，激動劑組的Caspase- 3剪切體(t=4.776，P=0.009)和Bax(t=5.281，P=0.006)的表達均明顯高于缺氧復(fù)氧組，抑制劑組的Caspase- 3剪切體(t=3.521，P=0.024)和Bax(t=3.473，P=0.026)的表達明顯低于缺氧復(fù)氧組。對照組、缺氧復(fù)氧組、激動劑組和抑制劑組的Bcl- 2水平分別為2.5330±0.1764、1.5400±0.1778、1.0200±0.1850和1.9530±0.1633，其中，缺氧復(fù)氧組明顯低于對照組(t=6.242，P=0.003)，激動劑組明顯低于缺氧復(fù)氧組(t=3.028，P=0.004)，抑制劑組明顯高于缺氧復(fù)氧組(t=2.840，P=0.047)(圖5)。

圖3 激光共聚焦檢測細胞內(nèi)游離鈣濃度

Fig3 Measurement of the concentration of intracellular calcium by laser confocal scanning microscopy

圖4 脊髓神經(jīng)元Tunel染色

Fig4 Tunel staining of spinal cord neurons

討 論

CaSR屬G蛋白耦聯(lián)受體超家族 C家族成員。自1993年Brown等[5]從牛甲狀旁腺細胞首次克隆出以來，其在生物體中的作用越來越受到人們的重視。研究表明，CaSR 具有維持和調(diào)節(jié)細胞內(nèi)鈣離子和其他礦物離子體內(nèi)平衡的作用，同時也參與細胞分泌、增殖、分化、趨化、凋亡、基因表達、維持膜電位、離子通道開關(guān)、衰老等過程的調(diào)控[6- 7]。CaSR除廣泛分布于調(diào)節(jié)細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)的組織中，如甲狀腺、甲狀旁腺、腎臟、胃腸道、骨組織等，在其他器官組織如血管平滑肌、神經(jīng)系統(tǒng)、胰腺、骨髓、腦垂體及乳腺等中也有表達[8- 9]。本研究采用Western blot法檢測了不同組別CaSR表達水平，結(jié)果顯示，缺氧復(fù)氧組和激動劑組CaSR的表達明顯高于對照組，提示脊髓神經(jīng)元缺氧復(fù)氧過程中CaSR的表達增加。

脊髓缺血再灌注損傷的具體機制尚不清楚，但鈣離子超載、氧自由基介導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、興奮性氨基酸、前列腺素等因素在脊髓損傷機制中起重要的作用已得到公認[10]。一般認為，鈣超載在脊髓缺血再灌注損傷中發(fā)揮關(guān)鍵作用。細胞內(nèi)鈣超載引起的瀑布樣效應(yīng)是神經(jīng)細胞損傷的共同通路[11]。2003年，Wang等[3]首次證實在大鼠心肌組織中有CaSR的表達，CaSR能通過G蛋白-PLC-IP3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，引起肌漿網(wǎng)內(nèi)鈣離子釋放增加，導(dǎo)致細胞內(nèi)游離鈣增加，造成細胞凋亡[4]。本研究采用激光共聚焦測定細胞內(nèi)游離鈣濃度，結(jié)果顯示脊髓神經(jīng)元的缺氧復(fù)氧組和激動劑組鈣離子的熒光強度明顯高于對照組，存在明顯的鈣超載現(xiàn)象。由此推測在脊髓神經(jīng)元的缺氧復(fù)氧損傷過程中，CaSR的激活可能介導(dǎo)了細胞內(nèi)游離鈣的升高，引發(fā)細胞內(nèi)鈣超載。

圖5 凋亡相關(guān)蛋白的表達

Fig5 Expressions of apoptosis-related proteins

Caspase家族是細胞凋亡的啟動者和最后的執(zhí)行者。研究表明，Caspase- 3是Caspase級聯(lián)“瀑布”下游最關(guān)鍵的凋亡執(zhí)行蛋白酶。受凋亡刺激因素(缺血、細胞內(nèi)鈣超載等)作用后激活，引起細胞形態(tài)的變化，最終導(dǎo)致細胞凋亡[12- 13]。Bcl- 2家族是凋亡的重要調(diào)控基因。在細胞內(nèi)Bax和Bcl- 2的蛋白濃度處于動態(tài)平衡之中。當細胞受到死亡刺激時，基因表達的調(diào)節(jié)類型發(fā)生改變，結(jié)果是Bax的增加或Bcl- 2的減少，從而激活凋亡[14- 16]。本研究檢測了各組Caspase- 3、Bax、Bcl- 2的蛋白表達水平，結(jié)果顯示，缺氧復(fù)氧組的Caspase- 3、Bax表達較對照組均明顯增加，Bcl- 2表達明顯降低。與缺氧復(fù)氧組比較，激動劑組的Caspase- 3和Bax表達明顯上調(diào)，Bcl- 2表達明顯下調(diào)；而抑制劑組的Bcl- 2表達明顯上調(diào)，Caspase- 3和Bax表達明顯下調(diào)。由此推斷在脊髓神經(jīng)元缺氧復(fù)氧損傷過程中，CaSR的激活介導(dǎo)了細胞內(nèi)鈣的升高，從而引發(fā)細胞內(nèi)鈣超載，進而造成凋亡相關(guān)蛋白的變化，最終導(dǎo)致細胞凋亡的發(fā)生。

綜上，本研究結(jié)果顯示，在脊髓神經(jīng)元缺氧復(fù)氧過程中，CaSR的表達增高，可能破壞了細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)，造成細胞內(nèi)的鈣超載，從而引起凋亡相關(guān)蛋白表達增多，經(jīng)過一系列的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，最終引起細胞凋亡。但引起脊髓神經(jīng)元缺氧復(fù)氧損傷的具體機制以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑錯綜復(fù)雜，有待于更進一步的研究。

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EffectofCalcium-sensingReceptorontheApoptosisofRatSpinalCordNeuronsinAnoxia/ReoxygenationInjuryandItsSignificance

HE Wei1，SUN Jifu1，JIANG Runyu1，ZHANG Zhijian2，CHEN Qian2，HUANG Yonghui1

1Department of Orthopaedics，Affiliated Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang，Jiangsu 212001，China2Basic and Clinic Medical Research Center，School of Medicine，Jiangsu University，Zhenjiang，Jiangsu 212013，China

HUANG Yonghui Tel：0511- 85082251，E-mail：huangyh8855@163.com

ObjectiveTo investigate the effect and significance of calcium-sensing receptor (CaSR) on the apoptosis of rat spinal cord neurons in anoxia/reoxygenation(A/R) injury.MethodsThe spinal cells were in ischemia and hypoxia environment for 1 h and in normal environment for 24 h to establish a model of A/R. After spinal A/R model was established，the spinal cells were divided into four groups randomly：the control group，A/R group，A/R+GdCl3 group，and A/R+NPS- 2390 group. The expression of CaSR in each group was detected by immunofluorescence and Western blotting. The concentration of intracellular calcium was measured by laser confocal scanning microscopy. The expressions of Caspase- 3，Bax，and Bcl- 2 were detected by using Western blotting. The apoptotic rate of spinal cells was detected by Tunel assay.ResultsCompared to the control group, there was a significant increase in the level of CaSR (t=5.462,P=0.006), the concentration of intracellular calcium (t=8.573,P=0.001), the apoptotic rate (t=4.899,P=0.008), Caspase- 3 (t=5.118,P=0.007), and Bax (t=10.930,P=0.001) in A/R group. Compared to the A/R group, there was a significant increase in the level of CaSR (t=4.975,P=0.008),the concentration of intracellular calcium (t=4.899,P=0.008), the apoptotic rate (t=7.746,P=0.002), Caspase- 3 (t=4.776,P=0.009), and Bax (t=5.281,P=0.006) in A/R+GdCl3 group. Compared to the A/R group, there was a significant decrease in the level of CaSR (t=3.674,P=0.021), the concentration of intracellular calcium (t=3.846,P=0.018), the apoptotic rate (t=4.281，P=0.013), Caspase- 3 (t=3.521,P=0.024), and Bax(t=3.473,P=0.026) in A/R+NPS- 2390 group. However, compared to the control group, there was a significant decrease in the level of Bcl- 2 (t=6.242,P=0.003) in A/R group. Compared to the A/R group, there was a significant decrease in the level of Bcl- 2(t=3.028,P=0.004) in A/R+GdCl3 group. Compared to the A/R group, there was a significant increase in the level of Bcl- 2 (t=2.840,P=0.047) in A/R+NPS- 2390 group.ConclusionDuring the process of A/R injury in rat spinal cord neurons，the expression of calcium sensing receptor increases，along with increase in intracellular calcium and spinal neuron apoptosis.

anoxia/reoxygenation；calcium-sensing receptor；apoptosis；spinal cord neurons

黃永輝 電話：0511- 85082251，電子郵件：huangyh8855@163.com

R364.1

A

1000- 503X(2017)05- 0623- 06

10.3881/j.issn.1000- 503X.2017.05.005

ActaAcadMedSin，2017,39(5)：623-628

2016- 08- 26)