李躍東,崔京浩,羅道奇

(1.蘇州市第七人民醫(yī)院·蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院高新區(qū)醫(yī)院藥劑科;2.蘇州大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 蘇州 215151)

白藜蘆醇經(jīng)鼻腔黏膜給藥腦內(nèi)釋藥特性的研究

李躍東1,崔京浩2,羅道奇2

(1.蘇州市第七人民醫(yī)院·蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院高新區(qū)醫(yī)院藥劑科;2.蘇州大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 蘇州 215151)

目的通過(guò)鼻腔灌流給藥與靜脈給藥兩種方式來(lái)考察白藜蘆醇包合以后，經(jīng)鼻入腦釋藥的可能性。方法取新西蘭兔3只，體質(zhì)量約為3 kg，分別經(jīng)鼻腔灌流與靜脈注射白藜蘆醇羥丙基-β-環(huán)糊精包合物，觀察單位質(zhì)量血液、大腦、嗅腦及篩鼻甲中白藜蘆醇的分布情況。結(jié)果靜脈給藥后，單位質(zhì)量組織中白藜蘆醇的含量從高到低依次為血液、大腦、嗅腦和篩鼻甲，分別為(0.143±0.181)μg/g、(0.035 7±0.034 8)μg/g、(0.031 3±0.037 6)μg/g、(0.0297±0.0129)μg/g；鼻腔灌流后，單位質(zhì)量組織中白藜蘆醇的含量從高到低依次為篩鼻甲、嗅腦、血液和大腦，分別為(149.529±2.344)μg/g、(0.124±0.072)μg/g、(0.097±0.104)μg/g、(0.025±0.019)μg/g。鼻腔灌流后，單位質(zhì)量篩鼻甲及嗅腦中白藜蘆醇含量均明顯高于靜脈給藥后(P<0.05或P<0.01)。結(jié)論經(jīng)鼻腔灌流給藥可以改善白藜蘆醇在篩鼻甲和嗅腦中的分布，從而發(fā)揮腦內(nèi)釋藥的作用。

白藜蘆醇;鼻腔灌流;腦內(nèi)釋藥;羥丙基-β-環(huán)糊精

白藜蘆醇是從植物中提取的天然化學(xué)物質(zhì)，是一種常見(jiàn)的二苯乙烯類化4合物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)名稱為3,4’,5-三羥基二苯乙烯，又名芪三酚，分子式為C14H12O3?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究[1-3]表明，白藜蘆醇不僅具有保護(hù)心血管、調(diào)節(jié)血脂代謝、保護(hù)神經(jīng)及抗炎等多種生理活性，還具有抗氧化、抗自由基、延年益壽、提高免疫系統(tǒng)活性的作用。目前，白藜蘆醇在日本、美國(guó)、加拿大等國(guó)家已被廣泛接受，但由于國(guó)內(nèi)白藜蘆醇研究起步較晚，對(duì)其功能認(rèn)識(shí)尚存在一定不足。關(guān)于白藜蘆醇，已研究的制劑主要包括納米粒、脂質(zhì)體、膠囊劑和保健品，但因其水不溶性的特點(diǎn)使普通制劑難以通過(guò)口服給藥途徑在體內(nèi)發(fā)揮良好的生物活性[4-5]。因此，為避免白藜蘆醇的首過(guò)效應(yīng)，提高生物利用度，本實(shí)驗(yàn)擬將白藜蘆醇制備成鼻腔給藥制劑，以初步探討其鼻腔黏膜給藥腦內(nèi)釋藥的特性。

1 材料與方法

1.1一般材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：新西蘭兔3只，體質(zhì)量約為3 kg，由蘇州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。試劑：白藜蘆醇(批號(hào)：ZL01302008，純度>98%，南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司)；甲醇(批號(hào)：10071753，色譜純，美國(guó)斯百全公司)；羥丙基-β-環(huán)糊精(批號(hào)：100301，純度≥98%，上海睿騰化工有限公司)；無(wú)水乙醇(批號(hào)：20120403，江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司)。儀器：高效液相色譜(LC-15C型泵，SPD-15C型檢測(cè)器，日本島津公司)； X-射線衍射儀(X’Pert-Pro MPD，荷蘭帕納科公司)；紅外分光光度計(jì)(Pro Star LC240，美國(guó)瓦里安公司)；紫外分光光度計(jì)(UV-2600型，日本島津公司)。

白藜蘆醇與羥丙基-β-環(huán)糊精包合物采用冷凍干燥法進(jìn)行制備，首先取適量羥丙基-β-環(huán)糊精于干凈燒杯中，加水置磁力攪拌器上攪拌至溶解，取處方量白藜蘆醇于試管中，加乙醇溶解，滴加至上述燒杯中繼續(xù)避光攪拌1.5 h；待包合完成，將包合物溶液置于冰箱，預(yù)凍、真空冷凍干燥，即得白藜蘆醇環(huán)糊精分子包合物。

1.2方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型與實(shí)驗(yàn)裝置 兔耳緣靜脈注射10%水合氯醛(2 mL·kg-1)麻醉，仰臥、固定四肢及頭部后，于手術(shù)臺(tái)上進(jìn)行手術(shù)；切開(kāi)頸部皮膚，暴露氣管和食管，氣管切開(kāi)后插入聚乙烯管，以保證正常呼吸；另取一根細(xì)聚乙烯管通過(guò)氣管插至鼻腔后部，用膠黏劑將鼻腭至口腔的通道封閉，以防止藥液從鼻腔流入口腔中，同時(shí)從兩根聚乙烯管中間結(jié)扎氣管和食管；用聚乙烯管連接蠕動(dòng)泵，將盛有藥液的容器置于37 ℃恒溫水浴器中，封住瓶口，防止水分蒸發(fā)；用蠕動(dòng)泵將藥液以恒定的速度泵入鼻腔，并從兩側(cè)鼻孔流出，定時(shí)取樣以測(cè)定灌流液中的藥物濃度，確定藥物吸收量[6-7]。

1.2.2 鼻腔灌流液取樣及測(cè)定 先以10 mL生理鹽水灌流10 min，測(cè)定灌流前后生理鹽水體積，若灌流液體積變化<0.1 mL，則整個(gè)灌流環(huán)路密封性良好，沒(méi)有漏液。待兔鼻腔灌流適應(yīng)后，排盡所有生理鹽水。取8 mL白藜蘆醇包合物酚紅生理鹽水溶液于密封的量筒中，置于37 ℃水浴恒溫。將蠕動(dòng)泵進(jìn)液管插入量筒底部，啟動(dòng)蠕動(dòng)泵，流速為1.0 mL/min，待兔鼻中藥液滴出時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)，分別于0、5、10、15、20、30、45、60 min讀取量筒中剩余白藜蘆醇藥液的體積Vn后取樣0.1 mL，補(bǔ)加空白生理鹽水0.1 mL，以高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)測(cè)定各時(shí)間點(diǎn)剩余白藜蘆醇的質(zhì)量濃度Cn，通過(guò)不同時(shí)間計(jì)算剩余白藜蘆醇的量Qn。剩余白藜蘆醇的量Qn計(jì)算方法：Qn=V實(shí)際Cn，該公式中Qn為第n個(gè)時(shí)間點(diǎn)的剩余白藜蘆醇的量(μg)，V實(shí)際為鼻腔灌流液的實(shí)際體積=酚紅總量/酚紅實(shí)時(shí)濃度[8]。

1.2.3 生物樣品取樣及測(cè)定 兔鼻腔灌流60 min后，自心臟取血約0.5 mL，以10 000 rpm離心10 min，取上清液0.2 mL，置于1.5 mL離心管中，加濃度為40.5 μg/mL內(nèi)標(biāo)物根皮素20 μL，渦旋混勻；加乙酸乙酯1 mL后，再渦旋3 min，以10 000 rpm離心10 min，取上清液800 μL，氮?dú)獯蹈?，?0 μL甲醇復(fù)溶后，HPLC分析。

取血完畢后，處死新西蘭兔，取出大腦、嗅腦和篩鼻甲，稱重，分別加入2 mL生理鹽水和20 μL濃度為40.5 μg/mL的根皮素，渦旋振蕩混勻后，勻漿。上述各個(gè)樣品中加入2 mL乙酸乙酯，渦旋振蕩3 min，以10 000 rpm離心10 min。取1.4 mL上清液，氮?dú)獯蹈桑蛹状?0 μL復(fù)溶后，HPLC分析[9]。

1.2.4 靜脈給藥 兔耳緣靜脈注射2 mL環(huán)糊精包合物溶液(劑量同灌流液)，60 min后，從心臟取血，血液靜置30 min，10 000 rpm離心10 min，取上清液0.2 mL，加入20 μL濃度為40.5 μg/mL的根皮素(內(nèi)標(biāo)物)；渦旋振蕩均勻后，加入1 mL乙酸乙酯，渦旋振蕩3 min萃取，10 000 rpm離心10 min，取上清液0.8 mL，于通風(fēng)櫥中氮?dú)饬鞔蹈?，加甲?0 μL復(fù)溶；渦旋震蕩均勻后，10 000 rpm離心10 min，取上清液20 μL，行HPLC分析。

取血完畢后，處死新西蘭兔，取出大腦、嗅腦、篩鼻甲，大腦稱取0.5 g，取稱重好的大腦和全部嗅腦，分別加入2 mL生理鹽水和20 μL濃度為40.5 μg/mL的根皮素(內(nèi)標(biāo)物)，渦旋振蕩均勻后，勻漿；篩鼻甲加入2 mL生理鹽水于研缽中研勻，各個(gè)樣品加乙酸乙酯2 mL，渦旋振蕩3 min萃取，每個(gè)樣品離心(10 000 rpm 10 min)，取上清液1.4 mL，于通風(fēng)櫥中氮?dú)饬鞔蹈?，加甲?0 μL復(fù)溶；渦旋震蕩均勻后，離心(10 000 rpm 10 min)，取上清液20 μL，行HPLC分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1鼻腔灌流后白藜蘆醇的吸收量

每只兔的鼻腔灌流白藜蘆醇量為5 369.99 μg，鼻腔灌流60 min后白藜蘆醇平均吸收量為(941.66±428.64)μg，吸收百分比為(17.54±7.94)%。見(jiàn)表1。

表1 鼻腔灌流60 min后白藜蘆醇的吸收量

2.2靜脈給藥后單位質(zhì)量組織中白藜蘆醇的量

每只兔的靜脈給藥量為5 369.99 μg，與鼻腔灌流量相同。靜脈給藥60 min后，單位質(zhì)量組織中白藜蘆醇的含量從高到低依次為血液、大腦、嗅腦和篩鼻甲，分別為(0.143±0.181)μg/g、(0.035 7±0.034 8)μg/g、(0.031 3±0.037 6)μg/g、(0.029 7±0.012 9)μg/g。見(jiàn)表2。

表2 靜脈給藥后單位質(zhì)量組織中白藜蘆醇的量(A)及白藜蘆醇在各組織中的含量(C)

2.3鼻腔灌流后單位質(zhì)量組織中白藜蘆醇的量

鼻腔灌流60 min后，單位質(zhì)量組織中白藜蘆醇的含量從高到低依次為篩鼻甲、嗅腦、血液和大腦，分別為(149.529±2.344)μg/g、(0.124±0.072)μg/g、(0.097±0.104)μg/g、(0.025±0.019)μg/g。鼻腔灌流后，單位質(zhì)量篩鼻甲及嗅腦中白藜蘆醇含量均明顯高于靜脈給藥后(P<0.05或P<0.01)，且大腦、血液中的含量幾乎相當(dāng)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 鼻腔灌流后單位質(zhì)量組織中白藜蘆醇的量(A)及白藜蘆醇在各組織中的含量(C)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)選擇新西蘭兔作為研究對(duì)象，主要考慮與大鼠麻醉易死和插管灌流手術(shù)要求較高不易操作有關(guān)。

由于白藜蘆醇水飽和液溶解度較低，水中溶解度僅為40 μg/mL左右，鼻腔吸收量有限，通過(guò)簡(jiǎn)單實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，在此實(shí)驗(yàn)條件下幾乎沒(méi)有信號(hào)響應(yīng)[10]。因此，本實(shí)驗(yàn)使用羥丙基-β-環(huán)糊精對(duì)白藜蘆醇進(jìn)行包合，以提高白藜蘆醇在水中的溶解度；通過(guò)兔鼻腔灌流給藥與靜脈給藥兩種方式來(lái)考察白藜蘆醇包合以后，經(jīng)鼻入腦釋藥的可能性，旨在為全面系統(tǒng)地評(píng)價(jià)白藜蘆醇鼻腔給藥提供理論依據(jù)。

經(jīng)鼻直接入腦的途徑主要為篩鼻甲-嗅神經(jīng)通路、嗅黏膜上皮通路-嗅腦-大腦。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，白藜蘆醇靜脈給藥和鼻腔灌流給藥均能進(jìn)入腦部，且大腦中的含量幾乎相當(dāng)；鼻腔灌流后，單位質(zhì)量篩鼻甲中白藜蘆醇平均含量遠(yuǎn)大于靜脈給藥后，且嗅腦中的白藜蘆醇平均含量亦明顯大于靜脈給藥后，說(shuō)明白藜蘆醇的含量依次為篩鼻甲>嗅腦>大腦，尤其嗅腦白藜蘆醇含量大于大腦，進(jìn)一步證明白藜蘆醇經(jīng)鼻入腦通路的存在，提示經(jīng)兔鼻腔灌流給藥可以改善白藜蘆醇在篩鼻甲和嗅腦中的分布，白藜蘆醇經(jīng)鼻腔黏膜給藥后達(dá)到腦內(nèi)釋藥是可行的。通過(guò)簡(jiǎn)單的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，增加白藜蘆醇靜脈給藥的量，會(huì)使進(jìn)入腦部的白藜蘆醇含量增加，這可能與白藜蘆醇脂溶性較強(qiáng)，易透過(guò)血腦屏障有關(guān)[11-12]。但增加白藜蘆醇包合物的鼻腔灌流量，進(jìn)入腦部的白藜蘆醇含量卻沒(méi)有靜脈給藥增加的明顯；稍微減少白藜蘆醇鼻腔灌流量，進(jìn)入腦部的白藜蘆醇含量亦未見(jiàn)明顯減少，這可能與鼻腔吸收有飽和性有關(guān)[13-14]。

[1] Jin Z,Feng W,Ji Y,etal.Resveratrol mediates cell cycle arrest and cell death in human esophageal squamous cell carcinoma by directly targeting the EGFR signaling pathway[J].Oncol Lett,2017,13(1):347-355.

[2] Kamaleddin MA.The paradoxical pro-and antiangiogenic actions of resveratrol:therapeutic applications in cancer and diabetes[J].Ann N Y Acad Sci,2016,1386(1):3-15.

[3] Kur?vietien? L,Staneviěien?I,Mongirdien?A,etal.Multiplicity of effects and health benefits of resveratrol[J].Medicina (Kaunas),2016,52(3):148-155.

[4] 趙海濤,陳為濤,李萬(wàn)忠.白藜蘆醇制備與制劑研究進(jìn)展[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥,2009,5(1):113-115.

[5] Zhang LN,Hao L,Wang HY,etal.Neuroprotective effect of resveratrol against glutamate-induced excitotoxicity[J].Adv Clin Exp Med,2015,24(1):161-165.

[6] 王光明,潘艷,孔秋玲,等.細(xì)辛腦羥丙基-β-環(huán)糊精溶液劑鼻腔給藥腦內(nèi)釋藥可行性[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2012,18(3):16-18.

[7] 董宇,狄留慶,吳曉明,等.大鼠鼻腔灌流試驗(yàn)方法改進(jìn)研究[J].南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)自然科學(xué)版,2010,26(1):53-55.

[8] 杜守穎,陸洋,姚宗玲,等.醒腦靜中各成分對(duì)梔子提取物中梔子苷大鼠鼻腔吸收的影響[J].國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2012,18(4):146-150.

[9] 趙靜宜,杜守穎,陸洋,等.艾片經(jīng)靜脈和鼻腔給藥的小鼠組織分布研究[J].中國(guó)中藥雜志,2013,38(7):1071-1074.

[10] 王新春.白藜蘆醇三個(gè)不同載體材料納米口服給藥系統(tǒng)的研究[D].成都：四川大學(xué)，2007.

[11] Wang D,Li SP,Fu JS,etal.Resveratrol defends blood-brain barrier integrity in experimental autoimmune encephalomyelitis mice[J].J Neurophysiol,2016,116(5):2173-2179.

[12] Poulose SM,Thangthaeng N,Miller MG,etal.Effects of pterostilbene and resveratrol on brain and behavior[J].Neurochem Int,2015,89:227-233.

[13] Martignoni I,Trotta V,Lee WH,etal.Resveratrol solid lipid microparticles as dry powder formulation for nasal delivery,characterization and in vitro deposition study[J].J Microencapsul,2016,33(8):735-742.

[14] Nasr M.Development of an optimized hyaluronic acid-based lipidic nanoemulsion co-encapsulating two polyphenols for nose to brain delivery[J].Drug Deliv,2016,23(4):1444-1452.

Studyonthebrainreleasecharacteristicsofresveratrolthroughintranasaladministration

LI Yue-dong1,CUI Jing-hao2,LUO Dao-qi2

(1.DepartmentofPharmacy,TheSeventhPeople’sHospitalofSuzhou,GaoxinDistrictHospital,TheSecondAffiliatedHospitalofSoochowUniversity;2.CollegeofPharmacy,SoochowUniversity,Suzhou215151,Jiangsu,China)

Objective：To explore the possibility of resveratrol into the brain via the nose after clathration through nasal perfusion and intravenous injection.Methods3 New Zealand rabbits with 3 kg of body weight approximately were selected,and resveratrol-hydroxypropyl-β-cyclodextrin inclusion compounds were given respectively by nasal perfusion and intravenous injection.The distribution of resveratrol in blood,brain,rhinencephalon and sieve turbinate per unit mass was observed.ResultsAfter intravenous injection,the content of resveratrol in blood per unit mass was the highest,then was the brain,rhinencephalon and sieve turbinate,and the contents were (0.143±0.181)μg/g,(0.0357±0.0348)μg/g,(0.0313±0.0376)μg/g and (0.0297±0.0129)μg/g,respectively.After nasal perfusion,the content of resveratrol in the sieve turbinate per unit mass was the highest,then was the rhinencephalon,blood and brain,and the contents were (149.529±2.344)μg/g,(0.124±0.072)μg/g,(0.097±0.104)μg/g and (0.025±0.019)μg/g,respectively.After nasal perfusion,the contents of resveratrol in the sieve turbinate and rhinencephalon were significantly higher than those after intravenous injection (P<0.05 orP<0.01).ConclusionNasal perfusion of resveratrol can improve its distribution in the sieve turbinate and rhinencephalon so as to exert the effect of specific delivery in the brain.

Resveratrol;Nasal perfusion;Brain release;Hydroxypropyl-β-cyclodextrin

10.3969/j.issn.1005-3697.2017.05.037

2017-04-11

李躍東(1985-)，男，主管藥師。E-mail:1344050208@qq.com

時(shí)間： 2017-10-10 02∶28

http://kns.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20171010.0228.076.html

1005-3697(2017)05-0778-04

R944.9

A

(學(xué)術(shù)編輯李毅)

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