張丹瑜，鄧宇傲，劉新瓊，王玲

（深圳市人民醫(yī)院 計(jì)劃生育科，廣東 深圳518020）

DDR1在卵巢癌細(xì)胞中對(duì)轉(zhuǎn)移侵襲和化療抗性的調(diào)控作用

張丹瑜，鄧宇傲，劉新瓊，王玲

（深圳市人民醫(yī)院 計(jì)劃生育科，廣東 深圳518020）

目的探討盤狀結(jié)構(gòu)域受體1（discoidin domain receptor 1，DDR 1）在卵巢癌細(xì)胞中對(duì)轉(zhuǎn)移侵襲和化療抗性的調(diào)控作用。方法選取我院2015年8月至2016年8月正在接受化療治療的40例原發(fā)性卵巢癌患者作為研究對(duì)象，在征得患者知情同意下切取病理組織并獲得卵巢癌細(xì)胞后分別通過Talen基因敲除和過表達(dá)構(gòu)建功能喪失和功能獲得模型各40株，隨后在此基礎(chǔ)上進(jìn)行轉(zhuǎn)移侵襲功能實(shí)驗(yàn)以及順鉑聯(lián)合紫杉醇的化療抗性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，以闡明其在卵巢癌細(xì)胞中對(duì)轉(zhuǎn)移侵襲和化療抗性的調(diào)控作用。結(jié)果功能獲得模型的信號(hào)通路關(guān)鍵因子 IKKbeta、 P50、 P62 的表達(dá)水平分別為 833.47 ± 5.33、 796.89 ± 5.77、 685.55 ± 1.35， 功能喪失模型分別為 678.85 ± 5.25、 633.49 ± 5.61、 547.88 ± 1.32， 組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＜0.05）。 功能喪失模型和功能獲得模型給藥前的卵巢癌細(xì)胞凋亡率、 增殖抑制率分別為 （2.50 ± 0.50） %、 （7.85 ± 0.25） %以及 （2.91 ± 0.48） %、 （8.94 ± 0.26） %，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）；給藥后功能獲得模型 24 h、48 h、72 h、96 h的細(xì)胞凋亡率和增殖抑制率分別為 （20.47±1.13） %、 （47.46 ± 1.34） %、 （95.96 ± 1.38） %、 （20.18 ± 1.32） %和 （19.77 ± 1.23） %、 （27.44 ± 1.56） %、 （36.46 ±1.14） %、 （50.67 ± 1.33） %， 功能喪失模型 24 h、 48 h、 72 h、 96 h 的細(xì)胞凋亡率和增殖抑制率分別為 （5.97 ± 1.03） %、（16.88 ± 1.32） %、 （70.10 ± 1.50） %、 （10.85 ± 1.15） %和 （12.44 ± 1.31） %、 （15.89 ± 1.11） %、 （19.98 ± 1.12） %、（21.28±1.22）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）。結(jié)論DDR 1在卵巢癌細(xì)胞中的生物功能主要涉及轉(zhuǎn)移侵襲和化療抗性調(diào)控兩方面，同時(shí)IKKbeta、P50、P62為DDR 1靶向信號(hào)通路的關(guān)鍵因子，揭示卵巢癌全新靶向作用途徑，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。

盤狀結(jié)構(gòu)域受體1；卵巢癌；轉(zhuǎn)移；侵襲；化療抗性

卵巢癌是目前女性最為常見的生殖器官惡性腫瘤之一，其發(fā)病率僅次于宮頸癌以及子宮體癌而位居第三位且給患者的生命安全帶來嚴(yán)重威脅［1］。由于卵巢的胚胎發(fā)育、組織解剖結(jié)構(gòu)、內(nèi)分泌功能復(fù)雜，使得卵巢癌早期缺乏特異性臨床表現(xiàn)，在被明確診斷時(shí)往往已經(jīng)處于中晚期且絕大多數(shù)發(fā)生擴(kuò)散轉(zhuǎn)移，喪失了最佳手術(shù)時(shí)機(jī)［2］?；熓悄壳爸委熢摷膊∽钣行У氖侄沃唬绕涫请S著基因研究的深入開展，通過調(diào)控靶向信號(hào)通路來提高化療效果成為臨床研究的熱門議題。但是，DDR1在卵巢癌化療治療過程中是否具有調(diào)控腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的能力以及失調(diào)表達(dá)下的DDR1是否會(huì)對(duì)卵巢癌的化療抗性帶來影響目前尚不得而知。本研究分析DDR1在卵巢癌細(xì)胞中對(duì)轉(zhuǎn)移侵襲和化療抗性的調(diào)控作用，具體報(bào)道如下。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選取我院2015年8月至2016年8月正在接受化療治療的40例原發(fā)性卵巢癌患者作為研究對(duì)象，患者年齡38 ～ 59 歲， 平均年齡 （48.45 ± 1.15） 歲； 病程 6 個(gè)月 ～ 2.5年，平均病程 （20.24±0.36）個(gè)月；癥狀表現(xiàn)：疼痛、壓迫癥狀、胃腸道不適。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) 卵巢癌診斷符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)婦科腫瘤學(xué)分會(huì)頒布的 《常見的婦科惡性腫瘤診治指南》以下內(nèi)容：①影像學(xué)檢查提示生殖器官 （包括子宮、卵巢、宮頸及陰道）包塊≥2 cm；②腫瘤標(biāo)志物檢查：CA125陽性；③婦科檢查：內(nèi)診發(fā)現(xiàn)附件腫物質(zhì)硬、表面不平、活動(dòng)度差；④其他檢查：陰道后穹窿穿刺液檢查或腹水細(xì)胞學(xué)檢查陽性［3］。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn) ①經(jīng)病理證實(shí)均為卵巢癌者；②無全身其他嚴(yán)重器質(zhì)性疾病者；③無化療治療禁忌者。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn) ①預(yù)期生存周期≤1個(gè)月者；②妊娠期、哺乳期患者；③不同意本研究方案者。

2 方法

2.1 卵巢癌細(xì)胞原代培養(yǎng) 將新鮮的上皮性卵巢癌細(xì)胞于超凈工作臺(tái)上采用無菌磷酸鹽緩沖液反復(fù)清洗8次后利用眼科剪將周圍壞死組織、血凝塊、脂肪等徹底清除，操作過程中嚴(yán)格按無菌操作規(guī)范執(zhí)行。將收集到的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至另一無菌培養(yǎng)皿中，利用眼科剪將其徹底剪碎，大小以1 mm×1 mm×1 mm為宜。加入0.2 mg／mL膠原酶A溶液10 mL后吹打均勻，于37℃恒溫?fù)u床消化4 h，常溫下3 000 r／min離心15min，去除上清液后收集沉淀部分并使用無菌磷酸鹽緩沖液重懸處理，以相同離心速度離心3次后加入100 mL胎牛血清，轉(zhuǎn)移至3.5 cm培養(yǎng)皿中依次加入霍亂毒素 （100 ng／mL）、白血病抑制因子 LIF （25 ng／mL）、 氫化可的松 （15 μg／mL）、 胰島素 （40 μg／mL）及肝素 （4μg／mL）等細(xì)胞生長(zhǎng)因子，于5%二氧化碳、37℃下靜置3 d后換液，依據(jù)卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)情況每隔2～3 d換液一次，待其80%匯合時(shí)傳代。首先倒掉培養(yǎng)液，加入雙抗生理鹽水或磷酸鹽緩沖液5～10 mL輕輕搖晃均勻后倒掉，加入0.25% ～0.35%胰酶2 mL，促使其均勻分布，待卵巢癌細(xì)胞間隙變大后停止消化。加入含有10%血清的培養(yǎng)液5 mL輕柔吹打，按照1∶3比例傳代培養(yǎng)。

2.2 功能模型構(gòu)建 核酸識(shí)別單元為間隔32個(gè)恒定氨基酸序列的雙連氨基酸且與A、G、C、T有恒定的對(duì)應(yīng)關(guān)系，即NI識(shí)別A，NG識(shí)別T，HD識(shí)別C，NN識(shí)別G。要想獲得卵巢癌細(xì)胞功能喪失及功能獲得模型，只需按照靶點(diǎn)序列將相應(yīng)單元串聯(lián)克隆，其中功能喪失模型利用內(nèi)切酶活性打斷目標(biāo)基因，將（兩個(gè)相鄰）靶點(diǎn)識(shí)別模塊 （分別）克隆入真核表達(dá)載體，得到Talen質(zhì)粒對(duì)，靶點(diǎn)識(shí)別模塊串接成功后需克隆入真核表達(dá)載體中，將T alen質(zhì)粒對(duì)共轉(zhuǎn)入細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)靶基因敲除［4］。而功能獲得模型則是在靶點(diǎn)附近序列由基因組中擴(kuò)增，克隆至驗(yàn)證質(zhì)粒中基因上游并與基因相融合，篩選出穩(wěn)定功能細(xì)胞株。

2.3 卵巢癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲能力實(shí)驗(yàn) 采用Trizol總RNA提取試劑對(duì)卵巢癌細(xì)胞總RNA進(jìn)行提取，隨后取1μL滴入到15μL反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系之中，充分混勻后65℃1 min、30℃5 min、65℃ 30 min、98℃ 5 min、4℃ 5 min后形成反轉(zhuǎn)錄 cDNA。取1μL實(shí)施熒光定量PCR擴(kuò)增，條件為95℃5 s、60℃30 s、72℃15 s，共計(jì)40個(gè)循環(huán)，最后進(jìn)行mRNA相對(duì)定量計(jì)算［5］。

2.4 化療抗性檢測(cè)試驗(yàn) 將功能喪失模型與功能獲得模型卵巢癌細(xì)胞置于10%牛血清培養(yǎng)基中，溫度37℃，待細(xì)胞融合≥80%后制備成為單細(xì)胞混懸液［6］。對(duì)細(xì)胞濃度進(jìn)行計(jì)算后接入細(xì)胞培養(yǎng)孔板常溫下孵育24 h，加入順鉑聯(lián)合紫杉醇，具體給藥方案如下：順鉑75 mg／m2＋紫杉醇 85 mg／m2，孵育箱中孵育48 h后加入MTT溶液，培養(yǎng)5 h后測(cè)定卵巢癌細(xì)胞活性［7－8］。去除培養(yǎng)液后加入PBS緩沖液，甲醛固定后加入染色液，染色5min后采用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡率。

2.5 觀察指標(biāo) ①DDR1信號(hào)通路關(guān)鍵因子，包括 IKKbeta、P50、P62，采用Western Blot檢測(cè)；②卵巢癌細(xì)胞化療抗性，包括給藥前，以及給藥后24 h、48 h、72 h、96 h五個(gè)時(shí)段，分別采用四唑鹽比色法、流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行測(cè)定。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本研究所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差 （±s）表示，采用t檢驗(yàn)，重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)采用方差分析，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 不同模型下DDR1表達(dá)水平比較 功能獲得模型信號(hào)通路關(guān)鍵因子IKKbeta、P50、P62的表達(dá)水平均顯著高于功能喪失模型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05），見表1。提示臨床DDR1在卵巢癌細(xì)胞中具有調(diào)控轉(zhuǎn)移侵襲的能力。

表1 不同模型下DDR1表達(dá)水平比較 （±s）

表1 不同模型下DDR1表達(dá)水平比較 （±s）

分組 n IKKbeta P50 P62功能獲得模型 40 833.47±5.33 796.89±5.77 685.55±1.35功能喪失模型 40 678.85±5.25 633.49±5.61 547.88±1.32 t 17.502 17.948 13.756 P 0.000 0.000 0.000

表2 不同模型下細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞增殖抑制率比較 （±s，%）

表2 不同模型下細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞增殖抑制率比較 （±s，%）

分組 n細(xì)胞增殖抑制率功能喪失模型 40功能獲得模型 40 t P細(xì)胞凋亡率給藥前 24h 48h 72h 96h 給藥前 24h 48h 72h 96h 2.50±0.50 5.97±1.03 16.88±1.32 70.10±1.50 10.85±1.15 7.85±0.25 12.44±1.31 15.89±1.11 19.98±1.12 21.28±1.22 2.91±0.48 20.47±1.13 47.46±1.34 95.96±1.38 20.18±1.32 8.94±0.26 19.77±1.23 27.44±1.56 36.46±1.14 50.67±1.33 0.672 5.804 9.137 7.484 4.992 1.037 3.068 5.239 6.413 7.008 0.318 0.002 0.000 0.000 0.008 0.064 0.017 0.003 0.000 0.000

3.2 不同模型下細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞增殖抑制率比較 給藥前功能獲得模型的細(xì)胞凋亡率以及細(xì)胞增殖抑制率稍高于功能喪失模型，但組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）；給藥后24 h、48 h、72 h、96 h四個(gè)時(shí)段，功能獲得模型的細(xì)胞凋亡率、增殖抑制率均顯著高于功能喪失模型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）；見表2。提示DDR1具有調(diào)控卵巢癌細(xì)胞化療抗性的作用。

4 討論

卵巢癌作為目前我國女性最為常見的惡性腫瘤之一，其治療一直是困擾臨床的棘手問題。雖然化療治療能夠取得較為理想的療效，提高了卵巢癌患者的生存率，但是隨著用藥時(shí)間的延長(zhǎng)，化療抗性問題不可避免地發(fā)生，給臨床治療工作的開展帶來嚴(yán)重阻礙［9］，如何降低化療抗性，提高臨床療效成為當(dāng)務(wù)之急。

本研究結(jié)果顯示，功能獲得模型信號(hào)通路關(guān)鍵因子IKKbeta、P50、P62的表達(dá)水平顯著高于功能喪失模型，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）。化療抗性實(shí)驗(yàn)證實(shí)給藥前功能獲得模型的細(xì)胞凋亡率以及細(xì)胞增殖抑制率稍高于功能喪失模型，但組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）；給藥后功能獲得模型的卵巢癌細(xì)胞凋亡率、增殖抑制率均顯著高于功能喪失模型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）。提示DDR1在卵巢癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲和化療抗性調(diào)控中扮演著至關(guān)重要的角色，尤其是DDR1功能獲得下化療抗性明顯下降，無論是卵巢癌細(xì)胞凋亡率還是增殖抑制率均明顯上升，提示臨床IKKbeta、P50、P62為DDR1重要的靶向信號(hào)通路關(guān)鍵因子，能夠調(diào)節(jié)卵巢癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移侵襲以及化療抗性，給臨床治療工作提供了全新的靶向調(diào)控思路。原因在于DDR1為受體酪氨酸激酶，胞外區(qū)均含有一個(gè)由155個(gè)氨基酸構(gòu)成的圓盤狀結(jié)構(gòu)，在其基因組中包含有17個(gè)外顯子，可被蛋白酶裂解并與IKKbeta、P50、P62受體相結(jié)合，活化誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞表達(dá)，繼而增強(qiáng)其活性［10］。在本研究中，DDR1功能獲得模型的IKKbeta、P50、P62表達(dá)水平均明顯提高，促使正常卵巢細(xì)胞的活性得到增強(qiáng)，抑制癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲。而在給藥后由于卵巢癌細(xì)胞IKKbeta、P50、P62表達(dá)水平降低，其活性受到抑制，化療藥物產(chǎn)生的殺傷效果更佳，因此在細(xì)胞凋亡率、增殖抑制率上均優(yōu)于功能喪失模型，提示DDR1在包括卵巢癌在內(nèi)的惡性腫瘤生長(zhǎng)、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移過程中均發(fā)揮了重要的作用。此外，本研究著眼點(diǎn)在于探尋能同時(shí)作用于卵巢癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)和化療抗性的關(guān)鍵分子并闡明其上下游分子機(jī)制和具體的信號(hào)通路，首次研究DDR1在卵巢癌中的生物功能主要涉及轉(zhuǎn)移侵襲和化療抗性調(diào)控兩個(gè)方面，闡述DDR1在卵巢癌中轉(zhuǎn)移和化療敏感功能發(fā)生的可能共同信號(hào)通路，驗(yàn)證DDR1在卵巢癌細(xì)胞株中的靶向關(guān)系，并由此闡明除了膠原激活外DDR1在卵巢癌中失調(diào)表達(dá)的新分子機(jī)制，彌補(bǔ)了此領(lǐng)域研究的空白，具有一定的創(chuàng)新性。

綜上所述，DDR1在卵巢癌細(xì)胞中的生物功能主要涉及轉(zhuǎn)移侵襲和化療抗性調(diào)控兩方面，并且IKKbeta、P50、P62為DDR1靶向信號(hào)通路關(guān)鍵因子，揭示卵巢癌全新靶向作用途徑，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。

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Regulation Function of DDR1 on Metastasis,Invasion and Chemotherapy Resistance in Ovarian Cancer Cells

ZHANG Danyu,DENG Yuao,LIU Xinqiong,WANG Ling
(Departmentof Family Planning,Shenzhen People's Hospital,Shenzhen 518020,China)

ObjectiveTo explore the regulation function of discoidin domain receptor 1(DDR1)on metastasis,invasion and chemotherapy resistance in ovarian cancer cells.MethodsFrom August2015 to August2016,40 cases of primary ovarian cancer patients undergoing chemotherapy were selected as the research objects.With patients' informed consent,pathological tissue was cut off to obtain the ovarian cancer cells.Gain-of-function model(40 strains)and loss-of-function model(40 strains)were respectively constructed by over expression and knockout of Talen gene.The metastasis-invasion function test and the resistance test of cisplatin combined with paclitaxel were conducted to clarify the regulation of metastasis,invasion and chemotherapy resistance in ovarian cancer cells.ResultsThe expression levels of signal pathway key factors IK Kbeta,P50 and P62were833.47±5.33,796.89±5.77 and 685.55±1.35 in gain-of-function model,and 678.85±5.25,633.49±5.61 and 547.88±1.32 in loss-of-function model,with statistical differences between two different models(P＜0.05).Before drug administration,no statistical difference was found between loss-of-function model and gain-of-function model in the apoptosis rate of ovarian cancer cell[(2.50±0.50)%vs.(2.91±0.48)%]or the proliferation inhibition rate[(7.85±0.25)%vs.(8.94±0.26)%],P＞0.05;24 h,48 h,72 h and 96 h after drug administration,the cell apoptosis rates of gain-of-function model were(20.47±1.13)%,(47.46±1.34)%,(95.96±1.38)%and(20.18±1.32)%respectively,while the cell apoptosis rates of loss-of-function model were(5.97±1.03)%,(16.88±1.32)%,(70.10±1.50)%and(10.85±1.15)%respectively,with statistical differences between two different models(P＜0.05);24 h,48 h,72 h and 96 h after drug administration,the proliferation inhibition rates of gain-of-function model were(19.77±1.23)%,(27.44±1.56)%,(36.46±1.14)%and(50.67±1.33)%respectively,while the proliferation inhibition rates of loss-of-function model were(12.44±1.31)%,(15.89±1.11)%,(19.98±1.12)%and(21.28±1.22)%respectively,with statistical differences between two different models(P＜0.05).Conclusions The biological function of DDR1mainly involves in metastasis,invasion and chemotherapy resistance in ovarian cancer cells.IKKbeta,P50 and P62 are the key factors of targeting signaling pathway,which suggests a novel targeting pathway for ovarian cancer,and has important clinical application value.

Discoidin domain receptor1;Ovarian cancer;Metastasis;Invasion;Chemotherapy resistance

R737.32

A

10.3969/j.issn.1674-4659.2017.10.1361

2017－07-27

廣東省省級(jí)科技計(jì)劃項(xiàng)目 “miR－199a啟動(dòng)子超甲基化誘導(dǎo)DDRI過表達(dá)調(diào)節(jié)卵巢癌轉(zhuǎn)移侵襲及化療抗性的研究” （項(xiàng)目編號(hào)：2014A020212428）

張丹瑜 （1981－），女，廣東梅州人，本科學(xué)歷，主治醫(yī)師，擅長(zhǎng)不孕不育、宮腔鏡及宮腹腔鏡手術(shù)。

（責(zé)任編輯：常海慶）