孫術(shù)國，王若暉，林親錄，蔣春燕，丁玉琴，曹建中

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利用蛋白質(zhì)組學技術(shù)研究不同儲藏條件稻谷陳化機制

孫術(shù)國，王若暉，林親錄※，蔣春燕，丁玉琴，曹建中

（中南林業(yè)科技大學食品科學與工程學院/稻谷及副產(chǎn)物深加工國家工程實驗室，長沙410004）

為了研究儲藏過程中不同溫度和氣調(diào)條件對稻谷品質(zhì)劣化的影響，利用蛋白質(zhì)組學技術(shù)探討稻谷儲藏陳化的分子機理，研究溫度37 ℃、25 ℃和25 ℃+CO2氣調(diào)下稻谷儲藏90 d品質(zhì)和蛋白質(zhì)組的變化。結(jié)果表明，較37、25 ℃貯藏，25 ℃+CO2氣調(diào)下稻谷儲藏脂肪酸值升高最少，發(fā)芽率下降最少(<0.05)。稻谷儲藏產(chǎn)生125個差異蛋白點，其中37個蛋白得到鑒定，根據(jù)蛋白質(zhì)的功能可分為5類，包括代謝（45.9%），細胞結(jié)構(gòu)（29.7%），抗脅迫（2.7%），功能性蛋白（5.4%）和其他蛋白（16.3%）。并鑒定出4個目標蛋白，分別為蛋白酶體亞基-1（B26、D09和F16），葡糖-1-磷酸腺苷?；D(zhuǎn)移酶（C01和E07），ADP-葡萄糖焦磷酸化酶大亞基(B04和F04)和乙酰輔酶A（A06和C05）。采用蛋白質(zhì)組學技術(shù)分析稻谷儲藏過程中蛋白質(zhì)組變化，結(jié)果表明高溫儲藏促進稻谷差異蛋白表達，CO2氣調(diào)儲藏可降低差異蛋白表達。對差異表達蛋白功能分析表明，稻谷陳化可能與糖代謝紊亂、蛋白質(zhì)分解能力降低，抗氧化酶活性降低，脂肪水解和氧化增強有關(guān)。研究結(jié)果為稻谷的合理、安全儲藏提供參考。

蛋白；儲藏；品質(zhì)控制；蛋白質(zhì)組學；陳化；稻谷

0 引 言

稻谷是世界半數(shù)以上人口的主要糧食，其生產(chǎn)具有很強的季節(jié)性特點，在稻谷生產(chǎn)當季只有少部分稻谷被加工成糙米或精米銷售，絕大部分稻谷需要儲藏保鮮。稻谷在儲藏過程中品質(zhì)會下降，這種自然和自發(fā)的變化叫做陳化[1]。陳化會導致稻谷物理、化學和生物特性變化，影響其生物活性和發(fā)芽率，以及影響其作為食品的蒸煮、加工、食用和營養(yǎng)品質(zhì)，最終影響其商業(yè)價值[2]。因此，選擇合適儲藏方式，提高稻谷儲藏性意義重大。

影響稻谷儲藏性能的因素較多，包括稻谷的品種、稻谷加工方式以及稻谷儲藏的環(huán)境條件（溫度、濕度、環(huán)境氣體等）等[3-5]。目前，中國在稻谷儲藏保鮮研究方面也取得了一定進展，如采用低溫儲藏[6]、CO2氣調(diào)儲藏等技術(shù)[7]，這些稻谷儲藏保鮮技術(shù)一定程度上實現(xiàn)了稻谷的安全儲藏，減少了儲藏過程中稻谷品質(zhì)劣化和營養(yǎng)損失。同時，有學者研究分析稻谷儲藏過程中淀粉、脂肪酸、可溶性蛋白和氨基酸的變化，以及這些變化對稻谷的蒸煮品質(zhì)、質(zhì)構(gòu)品質(zhì)、凝膠特性、風味品質(zhì)、感官屬性以及生物酶活性的影響，旨在獲得稻谷陳化機制[8]。這些研究發(fā)現(xiàn)稻谷在儲藏過程中蛋白質(zhì)含量變化不大，但幾種主要蛋白會發(fā)生不同程度的降解、變性或是結(jié)構(gòu)的變化[9-10]。這種蛋白質(zhì)水平的變化，與稻米陳化后米飯蒸煮品質(zhì)劣化（米飯硬度增大和黏性降低）有著密切的聯(lián)系，但導致這種蛋白質(zhì)變化的分子機制至今仍不清楚。

隨著基因組學、蛋白質(zhì)組學等高通量技術(shù)的高速發(fā)展，使得人們從系統(tǒng)生物學角度研究特定環(huán)境、特定時空條件下細胞或組織中各組分的變化成為可能，進而揭示食物原料或經(jīng)加工后其深層品質(zhì)變化機制[11-13]。近年來，蛋白質(zhì)組學技術(shù)開始廣泛應(yīng)用于以茭白、豆類、蛋類、肉類和魚類等為研究對象的食品領(lǐng)域[14-17]。也有學者將蛋白質(zhì)組學技術(shù)應(yīng)用于研究不同品種的稻谷種子儲藏特性，分析了自然儲藏條件對稻谷發(fā)芽率的影響[18]。這些研究為研究稻谷陳化機理以及與陳化相關(guān)的功能性蛋白提供了一種系統(tǒng)性的分析手段，從動態(tài)角度描述蛋白水平表達的差異，并且鑒定出與其生理變化相關(guān)的蛋白，分析不同儲藏條件對稻谷陳化的影響，為稻谷陳化機理的研究提供了一種技術(shù)方法。本文從蛋白質(zhì)分子水平研究了不同儲藏溫度及氣調(diào)儲藏條件下稻谷蛋白的表達情況，并將鑒定出來的蛋白與已知的理化變化進行相關(guān)性分析，為分析稻谷陳化機理提供一種新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

試驗稻谷來源于國家雜交水稻工程技術(shù)研究中心提供的晚秈稻黃華粘（2014年當年生產(chǎn)的稻谷）。稻谷從收割到試驗控制在1個月內(nèi)，試驗進行前，將試驗稻谷在50 ℃干燥至含水率13.5%±0.5%（卡爾費休法測定含水率）。

AKF-3卡爾費休氏水分測定儀（上海禾工科學儀器有限公司）；UV-2600紫外可見分光光度計（日本島津公司）；GE Ettan IPGphor 3等電聚焦儀（美國通用電氣公司）；Ultraflex III TOF/TOF質(zhì)譜儀（德國布魯克公司）；MS105DU電子分析天平（日本島津公司）；T70智能電位滴定儀（瑞士梅特勒公司）；PRX-150A智能人工氣候箱（寧波賽福試驗儀器有限公司）；DHG-9123A電熱鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；H5050R冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）。

1.2 稻谷儲藏試驗

準備54個密封罐，每個放置150 g稻谷，將這些密封罐分為3組，每組18個。其中第一組置于37 ℃的恒溫箱中儲藏，第二組置于25 ℃的恒溫箱中儲藏，第三組密封罐中充入濃度99%的CO2，置于25 ℃的恒溫箱中儲藏，每隔15 d從每組取3罐測定稻谷發(fā)芽率和脂肪酸值，另外取同樣樣品采用液氮冷凍，再利用蛋白質(zhì)組學技術(shù)分析稻谷蛋白質(zhì)表達差異。

1.3 稻谷發(fā)芽率和脂肪酸值的測定

稻谷發(fā)芽率按照GB/T 3543.3-1995方法測定，脂肪酸值按GB/T 29405-2012方法測定。

1.4 蛋白質(zhì)組雙向電泳

1.4.1 稻谷樣品的研磨

研磨前先在研缽中倒入液氮預(yù)冷，然后將10 g稻谷樣品置于研缽中，迅速加入液氮研磨，直至組織變成粉末，立刻在研缽中加入20 mg聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl- polypyrrolidone，PVPP），用藥勺將粉末轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中。

1.4.2 蛋白質(zhì)提取

在50 mL離心管中加入10mL提取液（0.7 mol/L蔗糖，0.1 mol/L氯化鉀，50 mmol/L乙二胺四乙酸二鈉，0.5 mol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩存液，pH值7.5），再加入10 mLTris飽和酚，充分振蕩后于冰上保溫，每隔5 min振蕩一次，總共6次。然后在4 ℃，5 000 r/min，離心30 min，吸出上層酚相，轉(zhuǎn)移到15 mL離心管中[19]。

1.4.3 蛋白質(zhì)純化

1）在離心管中加入與酚相等體積的提取液，充分振蕩后于冰上保溫，每隔5 min振蕩一次，總共6次，4 ℃，5 000 r/min，離心30 min，吸出上層酚相，轉(zhuǎn)移至新的15 mL離心管中。重復一次操作。

2）加入最后得到的酚的5倍體積的醋酸銨甲醇溶液對蛋白進行沉淀，充分振蕩后置于冰上保溫每隔5 min振蕩一次，總共6次，?20 ℃沉淀過夜。

3）對沉淀過夜的蛋白質(zhì)4 ℃，5 000 r/min，離心30 min，傾倒上清液，加入5 mL甲醇對蛋白進行洗滌，除去蛋白中的色素及鹽，用移液器（1 mL）反復吹打均勻后，4 ℃，5 000 r/min，離心30 min。重復一次操作。

4）加入5 mL丙酮對蛋白進行洗滌，用移液器（1 mL）反復吹打均勻之后，在4 ℃，5 000 r/min，離心30 min。重復一次操作。洗滌兩次之后最后一次加入4 mL丙酮，吹打均勻之后將蛋白質(zhì)平均分到4支1.5 mL 微型離心管EP（eppendorf）中，在4 ℃，12 000 r/min，離心20 min。倒去上清液后，室溫下干燥，即可得到處理后的蛋白質(zhì)團塊，?80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.4 蛋白質(zhì)定量

取5、10、15、20、25、30、35g的牛血清白蛋白BSA（bovine serum albumin，質(zhì)量濃度為5g/L）標準品制作標準曲線，樣品一般取2～3L，雙復管測定。每支管加入1mLBradford溶液，渦旋振蕩20 s，使其充分混勻后即可測定吸光值（OD595）。加入液體時要均勻，避免產(chǎn)生氣泡。定量分兩次進行，第一次為初步定量，計算得到各樣品的濃度后，將所有樣品濃度盡量調(diào)至比較接近，再進行第二次定量，為了保證定量的準確性，每次定量都需制作標準曲線（=6.7305+0.0134，2=0.998）。

1.4.5 雙向電泳

蛋白質(zhì)的提取、雙向電泳、凝膠轉(zhuǎn)移及銀染等步驟按照丁承強等[20]的方法進行。

1.4.6 凝膠的掃描和保存

掃描模式設(shè)定為256灰階透視掃描，分辨率為300 像素。掃描完的凝膠用保鮮膜包好后置于4 ℃保存。

1.4.7 圖像分析

分析軟件為Image Master 2Dplatinum5.0(GE)。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

上述所有試驗重復3次，取平均值，試驗采用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 儲藏溫度及CO2氣調(diào)儲藏條件對稻谷脂肪酸值和發(fā)芽率影響

由圖1a可以看出，隨著稻谷儲藏時間的延長，其脂肪酸值也隨之升高，尤其在37 ℃下升高最明顯，與25 ℃和25 ℃+CO2氣調(diào)兩組相比，差異顯著（<0.01）。這主要是由于高溫條件下稻谷游離脂肪酸增多，且進一步氧化后，產(chǎn)生難聞的戊醛、己醛等揮發(fā)性羰基化合物，蛋白質(zhì)也容易引起水解，游離氨基酸上升，導致稻谷脂肪酸值升高[21]。在同樣25 ℃下儲藏的稻谷，CO2氣調(diào)儲藏脂肪酸值增長趨勢小于非氣調(diào)組（<0.05）。隨著稻谷儲藏時間的延長，稻谷發(fā)芽率逐漸降低，這與Gao等觀察的結(jié)果一致[18]。儲藏溫度對稻谷發(fā)芽率影響非常大，在同樣的儲藏時間下，儲藏溫度越高，稻谷發(fā)芽率越低；但在同樣的溫度條件下，氣調(diào)儲藏的稻谷發(fā)芽率高于非氣調(diào)組（<0.05）（圖1b），而種子發(fā)芽率直接反映種子的活力水平，這些結(jié)果充分說明氣調(diào)儲藏可以較好地保持種子活力，進而起到對稻谷儲藏保鮮效果[7]。上述結(jié)果充分表明CO2氣調(diào)儲藏有利于稻谷品質(zhì)的保持，可能原因在于CO2氣調(diào)使儲藏的稻谷處于低氧或者無氧的環(huán)境，降低了稻谷中不飽和脂肪酸氧化，減少了游離脂肪酸和一些自由基產(chǎn)生，對稻谷種子起到一定的保護作用[22]。

圖1 不同儲藏條件下稻谷脂肪酸值和發(fā)芽率的變化規(guī)律

2.2 稻谷蛋白的雙向電泳分析及與稻谷陳化關(guān)系

利用雙向電泳研究了稻谷在不同儲藏條件下的蛋白表達情況，結(jié)果如圖2所示，結(jié)果表明，與儲藏初始相比，在37 ℃儲藏條件下（圖2b、c）共發(fā)現(xiàn)46個差異蛋白，其中16個表達上調(diào)，30個表達下調(diào)；在25 ℃儲藏條件下的稻米（圖2d、e）中共發(fā)現(xiàn)39個差異蛋白，其中12個表達上調(diào)，27個表達下調(diào)；在25 ℃+CO2氣調(diào)儲藏條件下（圖2f、g），發(fā)現(xiàn)差異蛋白30個，其中16個表達上調(diào)，14個表達下調(diào)。這些結(jié)果亦表明，稻谷陳化過程中蛋白質(zhì)組的變化對溫度敏感，高溫可能導致更多差異蛋白質(zhì)的表達，在同樣溫度儲藏條件下，CO2氣調(diào)儲藏可以降低溫度所造成的蛋白質(zhì)的差異表達，間接說明CO2氣調(diào)儲藏可以降低稻谷在儲藏過程中蛋白質(zhì)分子水平上生理生化變化，延緩稻谷的陳化。

圖2 不同儲藏條件下的稻谷蛋白質(zhì)雙向電泳圖

2.3 稻米差異蛋白的質(zhì)譜鑒定

利用質(zhì)譜儀對所有125個差異蛋白點進行質(zhì)譜分析，利用BioTools（Bruker Dalton）軟件搜索美國國立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）數(shù)據(jù)庫，對稻谷貯藏過程中發(fā)生顯著變化的蛋白質(zhì)進行鑒定。共鑒定出37個差異蛋白，不同功能蛋白的編號和名稱見表1。根據(jù)蛋白質(zhì)的功能可分為5類，包括代謝（45.9%），細胞結(jié)構(gòu)（29.7%），抗脅迫（2.7%），功能性蛋白（5.4%）和其他蛋白（16.3%），具體分析如下。

表1 不同儲藏條件下稻谷差異蛋白的Ultraflex III TOF/TOF質(zhì)譜鑒定

結(jié)合表1和圖2b、c顯示，37 ℃儲藏下鑒定出的18個差異蛋白，其中8個表達上調(diào)，10個表達下調(diào)。在表達上調(diào)的蛋白中，4個（A08、A13、A14、A15）與細胞結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白表現(xiàn)出極高的匹配度。在10個表達下調(diào)的蛋白中，B03、B17被鑒定為未知蛋白；5個蛋白（B01、B04、B11、B26、B27）與代謝相關(guān)，經(jīng)鑒定分別為葡糖-1-磷酸腺苷?；D(zhuǎn)移酶大亞基、ADP-葡萄糖焦磷酸化酶大亞基、葡萄糖磷酸變位酶、蛋白酶體亞基-1、1-半胱氨酸過氧化物酶。2個蛋白（B14、B25）為功能蛋白，分別鑒定為輸入蛋白亞基-1和增殖細胞核抗原。

結(jié)合表1和圖2d、e顯示，25 ℃儲藏下鑒定出的16個差異蛋白，其中5個上調(diào)，11個下調(diào)。在表達上調(diào)的蛋白中，3個代謝蛋白（C01、C04、C05），經(jīng)鑒定分別為葡糖-1-磷酸腺苷?；D(zhuǎn)移酶、異檸檬酸脫氫酶和乙酰輔酶A。在表達下調(diào)的蛋白中，大多數(shù)蛋白（D04、D08、D10、D12）為與細胞結(jié)構(gòu)相關(guān)匹配性較高的蛋白，2個蛋白（D02和D06）與代謝相關(guān)，經(jīng)鑒定分別為二氫硫辛酸脫氫酶和精氨酸酶。D07和D14經(jīng)鑒定為轉(zhuǎn)錄因子與-球蛋白。

結(jié)合表1和圖2f、g結(jié)果，25 ℃氣調(diào)儲藏下共鑒定出14個差異蛋白，其中表達上調(diào)3個，表達下調(diào)11個。表達上調(diào)的蛋白E09和E10均與代謝相關(guān)，經(jīng)鑒定分別為丙酮酸脫氫酶和葡萄糖和核糖醇脫氫酶同系物。表達下調(diào)的蛋白（F01、F02、F21）經(jīng)質(zhì)譜和生物信息學分析，表明這3種蛋白可能與代謝相關(guān)；2種蛋白F05和F13經(jīng)鑒定分別為抗脅迫功能的熱休克蛋白和功能未知的Os04g0404400蛋白。

2.4 不同儲藏條件下稻谷蛋白組的變化及其與稻谷陳化關(guān)系

2.4.1 不同儲藏溫度條件下稻谷的蛋白變化與稻谷陳化關(guān)系

通過將稻谷分別置于37和25 ℃溫度條件儲藏90 d，結(jié)果如圖2所示，結(jié)果表明，與新鮮稻谷作對照，37 ℃高溫條件導致稻谷產(chǎn)生46個差異蛋白，其中16個表達上調(diào)，30個表達下調(diào)，這些差異表達蛋白經(jīng)質(zhì)譜和生物學信息學分析，發(fā)現(xiàn)表達上調(diào)的多為結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白。而25 ℃條件下儲藏的稻谷差異蛋白點有所降低，只有39個，其中共鑒定出16種差異蛋白，上調(diào)的5個蛋白中，多為代謝相關(guān)蛋白。由此可見，在稻谷儲藏過程中，不同溫度對稻谷蛋白表達差異明顯，溫度越高，差異表達蛋白越多，稻谷品質(zhì)劣化越明顯（圖1），適當?shù)蜏貤l件下有利于稻谷儲藏保鮮。

針對稻谷儲藏過程產(chǎn)生差異蛋白，利用質(zhì)譜和生物學信息學，系統(tǒng)研究這種蛋白質(zhì)差異表達對稻谷陳化影響。結(jié)果表明：

1）在25 ℃儲藏條件下，稻谷表達上調(diào)蛋白C01（E07）為葡糖-1-磷酸腺苷?；D(zhuǎn)移酶，是淀粉合成過程中一種重要的酶，而該酶在高溫條件下表達下調(diào)（表1），說明在較高溫度的條件下，該酶的表達受到抑制，從而導致稻谷淀粉合成受阻，進而影響了稻谷食用品質(zhì)。表達上調(diào)蛋白C04經(jīng)鑒定異檸檬酸脫氫酶，其參與三羧酸循環(huán)，負責催化異檸檬酸氧化脫羧成-酮戊二酸，是循環(huán)途徑中的限速酶，上述兩種酶類都與核苷酸代謝有關(guān)，他們表達上調(diào)說明核苷酸降解，導致稻谷代謝失調(diào)，最終加速了陳化。表達上調(diào)蛋白C05（A06）經(jīng)鑒定為乙酰輔酶A，乙酰輔酶A是質(zhì)體中脂肪酸合成的前體物，脂肪酸合成的第一步是由乙酰輔酶A羧化酶參與完成，催化合成的丙二酰輔酶是脂肪酸合成和脂酰鏈延伸系統(tǒng)等重要代謝反應(yīng)的底物[23]，因此，乙酰輔酶A表達上調(diào)，說明在陳化過程中脂肪酸增加。表1顯示乙酰輔酶A在高溫及25℃條件下都有表達上調(diào)，但是相對來說，高溫上調(diào)表達更為明顯，其表達上調(diào)說明會導致稻谷脂肪酸值增加，進而導致稻谷品質(zhì)下降，因此推測高溫條件稻谷品質(zhì)劣化越明顯。而根據(jù)施利利等[24]研究20種陳化糙米脂肪酸值平均值增加了2倍，變化最大的津稻168，脂肪酸值增加了3.67倍。據(jù)此也可以推測，高溫條件促進脂肪酸增加，因此會加劇稻谷品質(zhì)的劣化。表達下調(diào)蛋白D02經(jīng)鑒定為二氫硫辛酸脫氫酶，作為丙酮酸脫氫酶系的一種，其參與三羧酸循環(huán)的第二階段，使得丙酮酸氧化脫羧形成乙酰CoA[25]，由于丙酮酸脫氫酶體系的復雜，該酶的表達下調(diào)可以推測丙酮酸脫羧反應(yīng)受到影響，導致CoA的表達上調(diào)。

2）在37 ℃儲藏條件下，B11鑒定為葡萄糖磷酸變位酶，是淀粉合成需要的葡萄糖磷酸變位酶。B01為葡糖-1-磷酸腺苷?；D(zhuǎn)移酶（AGPP）大亞基，它是淀粉合成的一個限速酶，催化1-磷酸葡萄糖（G-1-P）與三磷酸腺苷（ATP）反應(yīng)形成腺苷二磷酸葡萄糖（ADPG）并釋放焦磷酸（PPi）。而ADPG作為活化葡萄糖基供體將糖基部分加到-1,4葡聚糖引物的還原端，被淀粉合成酶用來催化形成淀粉顆粒，因此直鏈淀粉和支鏈淀粉都與其相關(guān)[26]。抑制AGPP的活性將導致淀粉合成的部分或全部終止[27]。淀粉作為大米中比例最高的成分，其淀粉變化和稻谷陳化后質(zhì)構(gòu)特性變化具有一定關(guān)聯(lián)，如淀粉在儲藏過程中直鏈淀粉含量略增加，平均分子量下降，不溶性直鏈淀粉的比例顯著增加，最終導致米飯蒸煮過程中水分難以滲透，淀粉溶解度和糊化度下降，米飯黏性較小，口感較硬[28-30]。圖2c中與儲藏初始比較表達下調(diào)蛋白點B27為具有抗氧化作用的1-半胱氨酸過氧化物酶，其作用為預(yù)防稻谷重要蛋白和淀粉氧化，該酶表達下降，說明了稻谷儲藏過程中抗氧化作用下降，更易陳化。B26（D09，F(xiàn)16）經(jīng)鑒定為蛋白酶體，蛋白酶體是一個廣泛分布于生物體內(nèi)的多亞基大分子復合物，具有多種催化功能，可選擇性降解細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)，是細胞新陳代謝的一個重要組成部分，能維護細胞內(nèi)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)[31]，其表達下調(diào)說明蛋白質(zhì)代謝的不穩(wěn)定也是導致稻谷陳化的一個重要原因。

2.4.2 氣調(diào)與非氣調(diào)儲藏條件下稻谷蛋白的變化與稻谷陳化關(guān)系

通過將稻谷置于25 ℃氣調(diào)和非氣調(diào)條件下儲藏90 d，結(jié)果如圖2所示，結(jié)果表明，氣調(diào)儲藏下稻谷差異蛋白為30個，與非氣調(diào)儲藏條件比較差異明顯，結(jié)合圖1，表明稻谷氣調(diào)儲藏陳化速度變慢。

針對稻谷氣調(diào)和非氣調(diào)儲藏過程產(chǎn)生差異蛋白，利用質(zhì)譜和生物學信息學，系統(tǒng)研究這種蛋白質(zhì)差異表達對稻谷陳化影響。結(jié)果表明：在25 ℃氣調(diào)儲藏條件下，表達上調(diào)蛋白E09（表1），經(jīng)鑒定為丙酮酸脫氫酶，該酶是丙酮酸脫氫酶系中的核心結(jié)構(gòu)，主要作用于三羧酸循環(huán)第二階段，催化生成乙酰CoA，該酶的表達上調(diào)說明稻谷在CO2氣調(diào)儲藏期間一定程度能保持生理活性正常，相關(guān)代謝酶活性保持較好。由表1對比，研究發(fā)現(xiàn)B26、D09與F16為不同儲藏條件下的相同蛋白點，經(jīng)鑒定為蛋白酶體，結(jié)合前文分析，在稻谷的儲藏中，無論是高溫、室溫或是室溫下氣調(diào)儲藏，蛋白質(zhì)本身將會發(fā)生一系列的降解，分解成精氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、亮氨酸和谷氨酸等小分子物質(zhì)，但稻谷在非氣調(diào)儲藏條件下，蛋白酶體表達量下降非常大，而CO2氣調(diào)儲藏能較好維持蛋白酶體表達，有利于稻谷品質(zhì)維持（圖1和表1）。因此，可以推測稻谷蛋白質(zhì)代謝對其品質(zhì)影響較大，蛋白質(zhì)代謝減弱，特別是蛋白質(zhì)分解代謝降低可能是導致稻谷陳化一個重要的原因。蛋白F04（B04）經(jīng)鑒定為ADP-葡萄糖焦磷酸化酶大亞基，其在37和25 ℃非氣調(diào)儲藏條件下均表達下調(diào)（表1），而氣調(diào)儲藏其表達上調(diào)維持不變，這很好說明氣調(diào)能較好維持淀粉合成代謝，從而控制稻谷劣化，延緩其陳化。

總之，稻谷在儲藏過程中會產(chǎn)生差異蛋白，這些蛋白當中一部分目標蛋白與稻谷陳化密切相關(guān)，經(jīng)鑒定分別為蛋白酶體亞基-1（B26、D09和F16），葡糖-1-磷酸腺苷?；D(zhuǎn)移酶（C01和E07），ADP-葡萄糖焦磷酸化酶大亞基（B04和F04）和乙酰輔酶A（A06和C05），這些目標蛋白有潛力成為稻谷品質(zhì)劣化程度的生物標示物（Biomarker）。

3 結(jié) 論

1）稻谷儲藏過程中脂肪酸值增加，發(fā)芽率降低。而37 ℃儲藏條件導致脂肪酸值增加更快，25 ℃+CO2氣調(diào)儲藏能降低脂肪酸增加。稻谷高溫儲藏致使稻谷發(fā)芽率下降更快，而CO2氣調(diào)儲藏能延緩稻谷發(fā)芽率下降。上述結(jié)果說明稻谷在儲藏過程中品質(zhì)易陳化，高溫會導致陳化更加嚴重，而CO2氣調(diào)儲藏能減緩稻谷陳化。

2）高溫能影響稻谷差異蛋白表達，產(chǎn)生更多差異蛋白。在同樣儲藏溫度條件下，與非氣調(diào)儲藏比較，CO2氣調(diào)儲藏能一定程度降低稻谷差異蛋白的表達，減輕高溫所導致的稻谷蛋白差異表達，對差異蛋白生物信息學進行分析，鑒定出4個目標蛋白，分別為蛋白酶體亞基-1（B26、D09和F16），葡糖-1-磷酸腺苷?；D(zhuǎn)移酶（C01和E07），ADP-葡萄糖焦磷酸化酶（B04和F04）和乙酰輔酶A（A06和C05），將其與稻谷儲藏過程品質(zhì)變化規(guī)律相偶聯(lián)，從蛋白質(zhì)分子代謝視角發(fā)現(xiàn)高溫儲藏加速稻谷陳化，CO2氣調(diào)儲藏能延緩稻谷陳化。

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Molecular mechanism of rice aging during different storage conditions based on protein levels

Sun Shuguo, Wang Ruohui, Lin Qinlu※, Jiang Chunyan, Ding Yuqin, Cao Jianzhong

(/410004,)

In this study, proteomics technology was used to study the molecular mechanism of rice grain stored under different conditions. The changes in the proteomic profiles of rice during storage at 37oC, 25oC, 25°C and CO2controlled atmosphere were analyzed; the effects of temperature and CO2controlled atmosphere storage on the quality of rice grain were also investigated. The results showed that a total of 125 differentially expressed proteins in the process of rice storage were detected and 37 protein spots were identified by mass spectrometry. According to the function of protein, the 37 identified proteins can be divided into five groups: metabolic (45.9%), cell structure (29.7%), stress (2.7%), functional protein (5.4%), and unclassified proteins (16.3%). We identified four groups of the target proteins, respectively expressed by the down-regulate proteasome subunit beta 1 (B26, D09 and F16), the up-regulate glucose-1-adenosine phosphate acyltransferase (C01 and E07), the down-regulate ADP-glucose pyrophosphorylase large subunit (B04 and F04), and the up-regulate acetyl coenzyme A (A06 and C05). The functional properties of these differentially expressed proteins and their essential role in plant metabolism were evaluated according to the bioinformatics method, combined with the analysis of changes in physicochemical properties of rice during storage under different conditions. The results indicated that high temperature storage led to a higher level of differential protein expression in rice. The appearance of numerous differential protein expressions might disturb glucose metabolism, which reduced the synthesis of the starch granule. In rice, high temperature storage resulted in a reduction of antioxidant activity of key enzymes and proteins and an increase of free fatty acid, the antioxidant activity played an important role in the prevention of protein, starch, and lipid oxidation and the reduction in the aging degree of rice. High temperature storage of rice might disturb protein metabolism and brought about a decrease in catabolism for protein degradation. The greater changes of protein expression, antioxidant activity, glucose metabolism, free fatty acid, and protein metabolism in rice at higher temperature might contribute to a fast deterioration of rice quality and a rapid aging of rice. Thus, functional analysis of these differentially expressed proteins showed that the high temperature promoted the differential protein expressions in rice at the molecular level, which could lead to the aging of the rice, and the mechanism of rice aging might involve glucose metabolism, protein decomposition, fat hydrolysis and oxidation. In our experiment, the surprising finding was that low-oxygen high-carbon dioxide controlled atmosphere storage of rice could effectively reduce the level of differential protein expression under high temperature conditions. Protein metabolism in rice stored during controlled atmosphere storage with carbon dioxide could be to a certain extent maintained at normal levels, disorders of glucose metabolism in rice was effectively suppressed by the low-oxygen high-carbon dioxide controlled atmosphere storage of rice. At the same time, the metabolism on the levels of starch synthesis tended to be normal and natural aging-related biochemical changes in rice were reduced, which thus delayed the process of quality deterioration in rice at high temperature. Our study provides new research ideas and methods for rice storage.

proteins; storage; quality control; proteomics; aging; rice

10.11975/j.issn.1002-6819.2017.18.036

TS205; Q816; S645.2

A

1002-6819(2017)-18-0277-08

10.11975/j.issn.1002-6819.2017.18.036 http://www.tcsae.org

2017-06-19

2017-09-03

湖南省重點研發(fā)計劃項目（2016NK2146）；國家自然科學基金面上項目（31571874）；長沙市科技計劃重點項目（k1508009-21）。

孫術(shù)國，湖南新邵人，副教授，博士，主要研究方向為食品貯藏保鮮。Email：sshuguo@163.com

林親錄，湖南洞口人，教授，博士，博士生導師，主要研究方向為糧食加工和貯藏保鮮。Email：linql0403@126.com