許 瑛，姚兆群，王 蘭，謝建明，趙思峰

(1.新疆綠洲農(nóng)業(yè)病蟲(chóng)害治理與植保資源利用自治區(qū)高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院，新疆石河子 832003；2.塔里木大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾 843300；3.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第十三師紅山農(nóng)場(chǎng)， 839202)

阿拉爾地區(qū)棗園不同時(shí)期棗花、棗果黑斑病菌帶菌量檢測(cè)

許 瑛1，姚兆群1，王 蘭2，謝建明3，趙思峰1

(1.新疆綠洲農(nóng)業(yè)病蟲(chóng)害治理與植保資源利用自治區(qū)高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院，新疆石河子 832003；2.塔里木大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾 843300；3.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第十三師紅山農(nóng)場(chǎng)， 839202)

目的檢測(cè)新疆南疆阿拉爾市棗園不同時(shí)期棗花、棗果上黑斑病菌的帶菌量，確定棗果黑斑病的侵入時(shí)期和侵入部位，明確防治該病害的關(guān)鍵時(shí)期。方法在阿拉爾市周邊3個(gè)棗園分別采集不同時(shí)期的棗花、棗果，采用常規(guī)組織分離法對(duì)其進(jìn)行分離，并對(duì)分離物進(jìn)行鑒定，用交鏈格孢菌特異性引物采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，檢測(cè)不同時(shí)期棗花及棗果各部位帶菌量。結(jié)果在不同時(shí)期采集的棗花及棗果各部位均分離到了鏈格孢菌，累計(jì)獲得276個(gè)分離物，經(jīng)鑒定均為A.alternata；實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)表明，在棗花上就能檢測(cè)到棗果黑斑病菌，其平均含量為2.11 μg/100 mg，在栆果上果肉中鏈格孢菌含量最高，其中胴部果肉含量最高為20.12 μg/100 mg，果柄處果肉為9.34 μg/100 mg，胴部果皮11.48 μg/100 mg，果柄處果皮為3.84 μg/100 mg。結(jié)論棗果黑斑病菌在紅棗開(kāi)花期就可以感染棗花，病菌可在棗果果肉中大量潛伏侵染，待黑斑病顯癥時(shí)，果肉中已有大量病菌存在，對(duì)棗果黑斑病的藥劑防治應(yīng)提前至紅棗開(kāi)花前期。

棗果黑斑?。绘湼矜呔?；RT-PCR；棗花和棗果

0 引 言

【研究意義】新疆南疆地區(qū)光熱資源豐富，氣候干燥，為優(yōu)質(zhì)紅棗生產(chǎn)提供了良好條件[1]，目前已成為我國(guó)最重要的商品棗生產(chǎn)基地[2-3]。近年來(lái)，棗果黑斑病在南疆紅棗種植區(qū)普遍發(fā)生，因棗農(nóng)不清楚該病害病原菌的侵入部位和侵入時(shí)期，在栆果上出現(xiàn)黑斑后才開(kāi)始防治，使得防治效果不佳，通?？稍斐?0%～60%的減產(chǎn)，且多次用藥也易導(dǎo)致栆果中產(chǎn)生農(nóng)藥殘留[4]。檢測(cè)新疆南疆阿拉爾市棗園不同時(shí)期棗花、棗果上黑斑病菌的帶菌量，研究棗果黑斑病的侵入時(shí)期和侵入部位，對(duì)明確防治該病害的關(guān)鍵時(shí)期有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】已有大量文獻(xiàn)報(bào)道導(dǎo)致棗果黑斑病的病原菌與鏈格孢屬真菌密切相關(guān)，其中南疆棗區(qū)黑斑病的致病菌主要為A.alternata[4-7]，該菌可在棗樹(shù)芽鱗、皮痕[8]、老樹(shù)皮、田間病殘?bào)w、落葉、棗園周邊沙棗林等[9-10]場(chǎng)所越冬，其對(duì)棗樹(shù)葉片、棗花和果實(shí)均可以侵染[4,11]，且可能存在潛伏侵染和再次侵染現(xiàn)象[12]。但該菌何時(shí)侵入栆果以及從什么部位侵入栆果等問(wèn)題一直沒(méi)有明確，對(duì)及時(shí)防治該病造成了一定困難。采用常規(guī)組織分離和顯微鏡觀(guān)察等方法難以做到對(duì)鏈格孢菌進(jìn)行定量檢測(cè)，Real-time PCR是一種快速檢測(cè)、定量分析的分子檢測(cè)技術(shù)，具有操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)迅速，準(zhǔn)確靈敏等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)在植物真菌病害的快速診斷和防控工作中發(fā)揮了重要作用[13]，已在棉花黃萎病菌[14]、小麥紋枯病菌[13]、土壤中禾谷絲核菌[15]、蘋(píng)果牛眼果腐病菌[16]等真菌病害檢測(cè)中應(yīng)用廣泛，王鳳軍等[17]已建立了棗褐斑病菌實(shí)時(shí)熒光PCR快速檢測(cè)方法?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】已明確了A.alternata可以侵染棗樹(shù)葉片、棗花和栆果，然而該菌何時(shí)侵入棗花和栆果，是否存在潛伏侵染等問(wèn)題尚未明確。研究棗園不同時(shí)期棗花、棗果黑斑病菌帶菌量并檢測(cè)?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】不同時(shí)期采集阿拉爾市周邊棗樹(shù)上的棗花和棗果進(jìn)行組織分離和病原鑒定，并通過(guò)鏈格孢菌特異性引物，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的技術(shù)檢測(cè)不同時(shí)期棗花及棗果各部位的帶菌量，明確栆果黑斑病初侵染時(shí)期和侵入部位，確定棗果黑斑病的防治關(guān)鍵時(shí)期。

1 材料與方法

1.1 材 料

在第一師阿拉爾市農(nóng)科所棗園、10團(tuán)7連(2塊地)共三個(gè)供試棗園采集棗花和棗果，這3塊棗園歷年均有黑斑病發(fā)生。在3塊棗園中各選擇3株棗樹(shù)定點(diǎn)采樣，從棗花、棗果黑斑病顯癥前期到顯癥初期，每3 d采集1次樣品，每次采集棗花60朵，棗果30顆，三個(gè)棗園各采集棗花11次樣品、棗果10次樣品。從每次采集的棗花中隨機(jī)挑選30朵，棗果隨機(jī)挑選15顆進(jìn)行常規(guī)組織分離，并對(duì)分離獲得的分離物進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，確定病原種類(lèi)，剩余棗花、棗果用于鏈格孢菌的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR參照菌株鐮刀菌(Fusariumsp.)、楊樹(shù)腐爛病菌(V.mali)為石河子大學(xué)綠洲農(nóng)作物病害防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存，蘋(píng)果黑斑病鏈格孢菌(Alternariasp.)為塔里木大學(xué)植物科學(xué)院植物病理研究室分離保存。

1.2 方 法

1.2.1 棗花棗果分離及病原鑒定

1.2.1.1 病菌分離及形態(tài)學(xué)鑒定

按照常規(guī)組織分離法對(duì)采集的10次樣品中300朵棗花150顆棗果進(jìn)行分離[18]，取棗花、棗果(去棗皮)病健交界處0.5 mm組織塊，先用75%乙醇消毒1 min，再用1 g/L HgCl2浸泡40 s，然后用無(wú)菌水沖洗3次、晾干，移置PDA培養(yǎng)基平板，25℃培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)2～3 d后，組織邊緣開(kāi)始長(zhǎng)出菌絲，挑取少量菌絲轉(zhuǎn)至新PDA培養(yǎng)基，待菌落長(zhǎng)3 d后在WA培養(yǎng)基上進(jìn)行單孢純化培養(yǎng)。純化后獲得的分離物保存在試管PDA斜面上，用于后續(xù)形態(tài)學(xué)鑒定。將純化的分離物在PDA上28℃培養(yǎng)5 d后，打直徑為5 mm菌餅，放置在PCA平板上，在菌餅邊緣放置一片無(wú)菌蓋玻片。28℃培養(yǎng)3～5 d，待蓋玻片表面長(zhǎng)滿(mǎn)菌絲后，將其放置于載玻片上，在光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)、孢子形態(tài)等特征并拍照。根據(jù)菌落特征、產(chǎn)孢表型和分生孢子的形態(tài)特征，參照《中國(guó)真菌志:鏈格孢菌》進(jìn)行屬和種的初步鑒定[19]。

1.2.1.2 鏈格孢菌分子生物學(xué)鑒定

選取上述分離獲得的代表菌株接種于轉(zhuǎn)至PDA平板上，28 ℃的培養(yǎng)3～5 d，刮取少量菌絲體至1.5 mL PE管中，使用真菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA。選用β-tubulin(Beta-F：CAGCTCGAGCGTATGAACGTCT和Beta-R：CGGAAGTCGGAAGCAGCCATC)及EF-1α(EF1-728F：CATCGAGAAGTTCGAGAAGG和EF1-986R：RTACTTGAAGGAACCCTTACC)兩條引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增[20-21]。反應(yīng)完成后，各擴(kuò)增產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將擴(kuò)增產(chǎn)物純化后送去測(cè)序。序列結(jié)果登陸到NCBI中BLAST進(jìn)行比對(duì)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)，使用MEGA 5.1軟件中鄰接法(NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.2 鏈格孢菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

1.2.2.1 供試菌株DNA提取

取上述分離鑒定的棗果黑斑病鏈格孢菌株的菌絲100 mg作為陽(yáng)性對(duì)照，使用Biospin真菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA，同時(shí)提取鐮刀菌(Fusariumsp.)、楊樹(shù)腐爛病病原菌(V.mali)、蘋(píng)果黑斑病鏈格孢菌(Alternariasp.)的DNA作為對(duì)照。DNA提取后檢測(cè)DNA濃度，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.2 引物特異性檢測(cè)

棗果黑斑病鏈格孢菌特異性引物設(shè)計(jì)參考王鳳軍[17]設(shè)計(jì)的引物，即Alta1基因引物，F(xiàn)-AltAA：TGTTCCCTTGGTGGGTTCG和R-AltAa：GCATTTCGCTGCGTTCTTC。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為：PCRTaqMix 12.5 μL，10 μmol/L F-AltAA/F-AltAa 各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 9.5 μL，至終體積為25 μL體系。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，59℃退火20 s，72℃延伸，72℃延伸10 min，PCR產(chǎn)物使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR反應(yīng)產(chǎn)物。Real-time PCR 反應(yīng)體系：SYBR PCR premix 5 μL，引物各0.25 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 3.5 μL，共10 μL體系。反應(yīng)條件：第一步，94℃預(yù)變性5 min；第二步，94℃1 min，59℃ 20s，72℃1 min，共40個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min；熔解曲線(xiàn)：95℃ 30 s，55℃ 15 s，95℃ 15 s。

1.2.3 棗花、栆果中鏈格孢菌含量檢測(cè)

1.2.3.1 發(fā)病棗花、棗果DNA提取

取不同時(shí)期的棗花采集的100 mg和棗果(果柄果皮、果柄果肉、胴部果皮、胴部果肉)4個(gè)部位的植物組織材料各100 mg。使用植物基因組DNA提取試劑盒提取各樣品DNA，最終獲得的DNA均使用50 μL TE洗脫2次，放置在-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.2 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備及標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)建立

將鏈格孢菌陽(yáng)性菌株P(guān)CR產(chǎn)物直接與pMD19-T Vector 鏈接，16℃過(guò)夜；取鏈接產(chǎn)物5 μL通過(guò)熱擊轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，37℃過(guò)夜培養(yǎng)。挑取單個(gè)陽(yáng)性克隆于LB液體培養(yǎng)基中(含AMP抗性)，37℃，200 r/min 振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。菌液測(cè)序，使用質(zhì)粒提取試劑盒，從上述陽(yáng)性轉(zhuǎn)化菌中提取重組質(zhì)粒，測(cè)定質(zhì)粒DNA濃度。將上述提取質(zhì)粒DNA按照測(cè)定濃度進(jìn)行10倍遞增梯度稀釋?zhuān)M(jìn)行熒光PCR檢測(cè)。以拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值為x軸，以Ct值為y軸，構(gòu)建RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。計(jì)算公式：拷貝數(shù)/mL=6.02×1023(拷貝數(shù)/mol)×重組質(zhì)粒濃度(g/mL)/MW(g/mol)。其中MW(重組質(zhì)粒分子質(zhì)量)=(目的基因堿基對(duì)數(shù)+載體堿基對(duì)數(shù))bp×660 daltons/base pair計(jì)算重組質(zhì)?？截悢?shù)，即目的基因的拷貝數(shù)。

1.2.3.3 棗果黑斑病菌數(shù)量與目的基因拷貝數(shù)的線(xiàn)性方程繪

將上述提取的鏈格孢陽(yáng)性菌株(100 mg菌絲)DNA，按照10倍遞增梯度稀釋后，進(jìn)行熒光PCR檢測(cè)，將得到的Ct值代入1.2.3.2重組質(zhì)粒的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)中，獲得目的基因拷貝數(shù)的Lg值。以棗果黑斑病鏈格孢菌數(shù)量的 Lg值為橫坐標(biāo)，目的基因拷貝數(shù)的Lg值為縱坐標(biāo)，用 Excel 軟件繪制線(xiàn)性回歸方程。

2 結(jié)果與分析

2.1 棗花、棗果上鏈格孢菌鑒定

2.1.1 鏈格孢菌的形態(tài)鑒定

對(duì)300朵棗花、150顆棗果進(jìn)行了分離，共獲得276個(gè)分離物，分離物單胞純化后，觀(guān)察病原菌的菌落形態(tài)、顏色、質(zhì)地等性狀。選取了20株具有代表性菌株，觀(guān)察形態(tài)，棗花、棗果中分離出的病原物相同，根據(jù)形態(tài)特征及孢子形態(tài)，在PDA平板上菌落形態(tài)呈邊緣整齊的圓形，菌落初期白色后期顏色加深呈灰色，菌絲呈棉絮狀(圖1A，圖1B)。在PCA平板上26℃下培養(yǎng)5～7 d，可產(chǎn)生淡褐色的分生孢子和5～9個(gè)孢子組成的孢子鏈，分生孢子梗合軸分支產(chǎn)孢或者不分支產(chǎn)孢(圖1C)。分生孢子單生，呈倒棍棒狀或倒梨形，淡褐色，具3～6個(gè)橫隔膜和0～2個(gè)縱隔膜或斜隔膜，同時(shí)參照《中國(guó)真菌志:鏈格孢屬》，初步鑒定棗花、棗果病原菌為A.alternata[19]。圖1

2.1.2 鏈格孢菌的分子鑒定

使用EF-1α和β-tubulin引物對(duì)棗花、棗果中分離的病原菌的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，兩組引物分別獲得大小約為250 bp、800 bp左右清晰條帶。選取棗花黑斑病代表菌株(NKSXY-H3、NKSXY-H4)和棗果黑斑病代表菌株(NKSXY-Z3、NKSXY-Z4)的擴(kuò)增產(chǎn)物純化測(cè)序。將測(cè)得的序列登陸NCBI中BLAST同源性比較。EF-1α構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)與已經(jīng)登錄菌株A.tenuissima和A.alternata聚在一個(gè)分支上。棗果黑斑病的代表菌株NKSXY-Z3、NKSXY-Z4與A.alternata(KU145273.1)親緣關(guān)系較近，支持率為99%。棗花代表菌株NKSXY-H3、NKSXY-H4與A.tenuissima(KU145274.1)和A.alternata(KJ008705.1)親緣關(guān)系較近，支持率為99%，但代表菌株與其他鏈格孢種不在一個(gè)分支上。β-tubulin構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可知棗果黑斑病的代表菌株NKSXY-Z3、NKSXY-Z4和棗花黑斑病代表菌株NKSXY-H3、NKSXY-H4與A.alternata(KJ008679.1)、A.alternata(KF680870.1)聚在一個(gè)亞分枝上，支持率達(dá)到99%，表明代表菌株NKSXY-Z3、NKSXY-Z4、NKSXY-H3、NKSXY-H4與A.alternata親緣關(guān)系最近。綜合形態(tài)學(xué)鑒定及分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，確定感病棗花、棗果中病原菌為A.alternata。圖2，圖3

A～B：PDA培養(yǎng)基上菌落形態(tài)，C～D：PCA培養(yǎng)基上分生孢子梗及分生孢子

A-B: Colony morphology on PDA,C-D:Conidiophores and conidia on PCA

圖1 紅棗果黑斑病病原菌形態(tài)學(xué)鑒定
Fig.1 Morphology of pathogen causing jujube black spot

圖2 基于EF-1α 構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)
Fig.2 Phylogenetic tree based on EF-1α gene sequences of representative strains

圖3 基于β-tubulin序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)
Fig.3 Phylogenetic tree based on β-tubulin gene sequences of representative strains

2.2 熒光定量PCR檢測(cè)

2.2.1 引物特異性驗(yàn)證

利用鏈格孢菌的特異性引物F-AltAA和F-AltAa分別擴(kuò)增棗果黑斑病(A.alternata)、蘋(píng)果黑斑病(Alternariasp.)、鐮刀菌(Fusariumsp.)、楊樹(shù)腐爛病菌(V.mali)中提取的DNA。僅在棗果中分離出來(lái)的鏈格孢菌擴(kuò)增出了單一清晰明亮的條帶，其它供試菌株均無(wú)條帶，證明該引物可作為棗果黑斑病鏈格孢菌的特異性引物用于后續(xù)熒光定量檢測(cè)。圖4

注：M: Marker(200bp)泳道；1:水；2:鐮刀菌；3:楊樹(shù)腐爛病菌；4:蘋(píng)果黑斑病菌；5:棗果黑斑病菌

Note:M: Marker(200bp) Lane； 1:water； 2:Fusariumsp. ； 3:V.Mali； 4:Alternariasp. ； 5:A.alternata

圖4 引物特異性熒光定量檢測(cè)
Fig.4 The PCR validation test of specific primer

2.2.2 重組質(zhì)粒熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立

將1.2.3.2制備的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品按濃度梯度稀釋?zhuān)亟M質(zhì)粒初始濃度為15 ng/μL。計(jì)算質(zhì)?？截悢?shù)，以拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，以Ct值為縱坐標(biāo)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為y= -3.114x+32.794，相關(guān)系數(shù)R2=0.991 4。其線(xiàn)性關(guān)系良好，可用于棗果黑斑病鏈格孢菌定量檢測(cè)。圖5

2.2.3 棗果黑斑病菌數(shù)量與目的基因拷貝數(shù)的線(xiàn)性方程

將上述100 mg鏈格孢菌絲中提取的DNA，進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)l(fā)現(xiàn)其CT值重復(fù)性較好。根據(jù)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)y= -3.114x+32.794把該CT值轉(zhuǎn)換為目的基因拷貝數(shù)的Lg值。再根據(jù)鏈格孢菌菌量的Lg值(x)與其目的基因拷貝數(shù)的Lg值(y)建立線(xiàn)性回歸方程y=0.975 8x+0.798 9，R2=0.967 1。其線(xiàn)性關(guān)系良好，可用于棗果黑斑病鏈格孢菌定量檢測(cè)。圖6

圖5 重組質(zhì)粒 RT-PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)
Fig.5 Standard curve for recombinant plasmid of RT-PCR

圖6 鏈格孢菌數(shù)量與目的基因拷貝數(shù)回歸曲線(xiàn)
Fig.6 Regression curve for A.alternata and target genecopy number by RT-PCR

2.2.4 棗果中各部位鏈格孢菌PCR檢測(cè)

將1.2.3.1提取的DNA模板，先通過(guò)鏈格孢菌特異性引物F-AltAA/F-AltAa PCR驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，棗花、棗果(果柄果皮、果柄果肉、胴部果皮、胴部果肉)提取的DNA只有一部分可以擴(kuò)增出大小約140 bp片段，說(shuō)明這些泳道所對(duì)應(yīng)的樣品中有鏈格孢菌A.alternata。未檢測(cè)到的樣品可能與隨機(jī)取樣和鏈格孢菌含量有關(guān)，對(duì)能擴(kuò)增出條帶的樣品和隨機(jī)部分未擴(kuò)增出條帶的可以檢測(cè)到濃度的樣品進(jìn)行下一步熒光定量檢測(cè)。圖7

注：M: Marker(200 bp)；1～4:胴部果肉；4～8:胴部果皮；9～12:果柄果肉；13～16:果柄果皮；17～19:棗花

Note:M: Marker(200bp)Lane；1-4: bottom flesh； 4-8: bottom peel； 9-12: carpopodium flesh； 13-16:carpopodium peel； 17-19:flower

圖7 特異引物擴(kuò)增棗花、棗果結(jié)果
Fig.7 The PCR results of specific primer

2.2.5 棗花和棗果不同部位鏈格孢菌量的動(dòng)態(tài)檢測(cè)

5月18日采集樣品中就能檢測(cè)到病菌存在，其含量為0.83 μg/100 mg，隨著開(kāi)花期的延長(zhǎng)，鏈格孢菌檢測(cè)量越來(lái)越高，6月17日棗花外觀(guān)明顯發(fā)黑(圖8C)，此時(shí)菌量達(dá)到了4.25 μg/100 mg(圖9)。盡管棗果上沒(méi)有表現(xiàn)任何癥狀，但從8月18日就可在胴部果肉、胴部果皮、頂端果肉和頂端果皮檢測(cè)到鏈格孢菌，其中胴部果肉中的菌量可達(dá)8.32 μg/100 m，胴部果皮為3.06 μg/100 m，頂端果肉和頂端果皮中菌量較少。隨著棗果逐漸成熟，棗果各部位的帶菌量不斷增加，到9月14日時(shí)，胴部果肉中菌量達(dá)到34.98 μg/100 m，果皮達(dá)到22.67 μg/100 m，在紅棗外觀(guān)看到的是一個(gè)小黑斑，但內(nèi)部果肉已經(jīng)大片發(fā)黑(圖10A，圖10B)，頂端果肉和頂端果皮的鏈格孢菌也有大量積累(圖11)。圖8～11

A：健康棗花；B：發(fā)病初期；C發(fā)病后期

A: Jujube flowers; B: The initial stage symptom of flowers; C: The later stage symptom of flowers

圖8 棗花黑斑病癥狀
Fig.8 Black spot disease symptoms of jujube flower

圖9 不同時(shí)期采集的棗花中鏈格孢菌菌量
Fig.9 The hyphae amount of A.alternata jujube flowers in different periods

A：胴部發(fā)病初期；B：胴部果肉；C：果柄

A: Initial stage symptoms of bottom; B: bottom flesh; C: Jcarpopodium

圖10 棗果黑斑病癥狀
Fig.10 Black spot disease symptoms of jujube fruit

圖11 不同時(shí)期采集的棗果中各部位鏈格孢菌菌量
Fig.11 The hyphae amount of A.alternata in different parts of jujube fruit collected in different periods

3 討 論

棗果黑斑病已成為南疆棗園重要的病害，近幾年給南疆紅棗產(chǎn)業(yè)造成了很大影響，該病主要是在紅棗紅熟期開(kāi)始普遍顯癥，隨著紅棗成熟度不斷增加，黑斑病逐漸加重，廣大棗農(nóng)通常是在棗果上出現(xiàn)黑色斑塊后開(kāi)始打藥，所用藥劑既有殺細(xì)菌的，也有殺真菌的，還有噴施微肥的，然而各種方法防效均不好。此次研究結(jié)果進(jìn)一步證明了鏈格孢菌A.alternata既可以感染棗花，也可以感染棗果，這與孫潔[11]等、董寧[4]等認(rèn)為危害棗葉、棗花和果實(shí)病原菌為同一種致病菌A.alternata的結(jié)果相一致，因此棗果黑斑病用藥應(yīng)以殺真菌劑為主，可輔助噴施微肥以提高棗果抗病性。

目前，主要通過(guò)常規(guī)的組織分離、實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)、GFP標(biāo)記的方法檢測(cè)病菌侵入及分布，李菲菲等[22]通過(guò)組織分離法確定了柑橘炭疽病菌在柑橘花器和果實(shí)上的帶菌率。肖蕊等[14]通過(guò)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)了棉花黃萎病菌。賈娜娜等[23]通過(guò)GFP標(biāo)記確定了梨腐爛病菌侵入及擴(kuò)展情況。而這幾種檢測(cè)方法在紅棗黑斑病中的報(bào)道較少，王鳳軍等[17]僅建立了棗果褐斑病菌熒光定量PCR檢測(cè)方法，并沒(méi)有做深入研究。而研究在熒光定量PCR基礎(chǔ)上，通過(guò)絕對(duì)定量的方法檢測(cè)了不同時(shí)期采集的棗花、棗果不同部位中鏈格孢菌的含量，檢測(cè)結(jié)果表明，鏈格孢菌可以侵染棗花，造成棗花發(fā)病，也可以感染棗果，盡管棗果表皮上看不到黑斑病的癥狀，但在果肉和果皮中已經(jīng)能夠檢測(cè)到鏈格孢菌的存在，病原菌可以在果肉中潛伏侵染，待棗果轉(zhuǎn)色糖分積累期病菌數(shù)量迅速增加并顯癥，若遇到合適的溫度和濕度，病害開(kāi)始爆發(fā)，等棗農(nóng)看到顯癥后開(kāi)始用藥，已經(jīng)無(wú)法控制病害的發(fā)生，因此對(duì)棗果黑斑病的防治時(shí)期，應(yīng)當(dāng)提前至紅棗開(kāi)花前將病原菌初次侵染量減下來(lái)，棗果膨大期減少再次侵染，從而達(dá)到較好控制棗果黑斑病的效果。

4 結(jié) 論

對(duì)田間發(fā)病棗花、棗果上病原菌進(jìn)行分離鑒定表明，不同時(shí)期采集的棗花、棗果上侵染的病原菌均為鏈格孢菌A.alternata。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果表明，在棗花、棗果各部位均檢測(cè)到了鏈格孢菌，并且隨著時(shí)間的增加病原菌數(shù)量不斷增加，病原菌在棗果果肉中存在潛伏侵染的情況。對(duì)棗果黑斑病的防治，應(yīng)提前至紅棗開(kāi)花前或開(kāi)花初期，所用藥劑為殺真菌劑。

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DetectionoftheAmountofFungiintheDifferentInfectionPeriodsofJujubeBlackSpotDiseaseinAlarArea

XU Ying1，YAO Zhao-qun1，WANG Lan2，XIE Jian-ming3，ZHAO Si-feng1

(1.KeyLaboratoryforOasisAgriculturalPestManagementandPlantResourceUtilizationatUniversitiesofXinjiangUygurAutonomousRegion/CollegeofAgronomy,ShiheziUniversity,ShiheziXinjiang832003,China; 2.CollegeofPlantScience,TarimUniversity,AlarXinjiang843300,China;3.HongshanFarm, 13thDivision,XPCC,AlarXinjiang839202,China)

ObjectiveTo clarify different infection periods and infection locations of jujube black spot disease in the Alar area. The hyphae amount ofA.alternatain flowers and fruits of jujube was detected with RT-PCR in the hope of providing theoretical basis to predict and control the disease.MethodJujube flowers and fruits of different periods in the 3 surrounding orchards in Alar City area were collected and the conventional tissue separation method was used to isolate them, after that, these isolates were identified. And the fungi in flowers and fruits at different periods were detected with the specific primers ofA.alternataby real-time fluorescence quantitative PCR method.ResultA total of 276 isolates were obtained and these isolates were identified asA.alternataby morphological characteristic and β-tubulin, EF-1α gene sequencing analysis. The real-time fluorescence quantitative PCR detection results showed thatA.alternatawas checked and the amount ofA.alternatawas 2.11 μg/100 mg in the flower. The highest amount ofA.alternatawas checked in sarcocarp of fruit body and amount of fungi was 20.12 μg/100 mg. The amount ofA.alternatawas 9.34 μg/100 mg in the sarcocarp of fruit body carpopodium. The amount ofA.alternatawas 11.48 μg/100 mg in the pericarp of fruit body and 3.84 μg/100 mg in the carpopodium pericarp.ConclusionJujube black spot disease pathogens in flowering period can invade flowers. When the disease has appeared, there has been a large number ofA.alternatain the sarcocarp of fruit body, so chemical control of it should be advanced to the earlier flowering stage of red jujube.

jujube black spot disease；Alternariasp.；RT-PCR；jujube flowers and fruits

ZHAO Si-feng (1975-), male, native place: Bazhong Sichuan. Professor, PhD. research field: Biological control of plant pest. (E-mail) Zhsf_agr@shzu.edu.cn

S41-30

A

1001-4330(2017)10-1911-09

10.6048/j.issn.1001-4330.2017.10.017

2017-07-21

國(guó)家星火計(jì)劃“南疆紅棗主要病蟲(chóng)害綠色防控技術(shù)示范與推廣(2015GA891007)”；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目“鏈格孢菌Alternariaalternata對(duì)南疆駿棗果實(shí)的侵染機(jī)制(31660504)”

許瑛(1991-)，女，甘肅武威人，碩士研究生，研究方向?yàn)橹参锊±韺W(xué)，(E-mail)xyella@163.com

趙思峰(1975-)，男，教授，博士，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹参锊∠x(chóng)害防治，(E-mail)zhsf_agr@shzu.edu.cn

Supported by: China Spark Program"Demonstration and promotion of green prevention and control techniques for main diseases and insect pests of jujube in southern Xinjiang"(2015GA891007) and National Natural Science Foundation of China"Infection mechanism of Alternaria alternata to Jujube fruits in southern Xinjiang"(31660504)