田秋菊，宋靜，楊艷琳，許田，王洪剛，封德順

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/作物生物學(xué)國家重點(diǎn)實驗室，山東 泰安 271018)

中間偃麥草TiAP1基因的克隆及生物信息學(xué)分析

田秋菊，宋靜，楊艷琳，許田，王洪剛，封德順

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/作物生物學(xué)國家重點(diǎn)實驗室，山東 泰安 271018)

本研究從煙農(nóng)15和中間偃麥草雜交所得的小偃麥異附加系SN6306中克隆得到TiAP1基因的全長序列，該序列全長1 272 bp，預(yù)測編碼423個氨基酸。通過BlastP分析，發(fā)現(xiàn)其屬于天冬氨酸蛋白酶家族。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，TiAP1蛋白含有信號肽且位于第16和17個氨基酸之間，同時含有兩個木聚糖酶抑制劑結(jié)構(gòu)域，分別位于該蛋白的N端和C端。此外，通過TMHMM預(yù)測，發(fā)現(xiàn)該蛋白無跨膜螺旋結(jié)構(gòu)，因此是胞外蛋白。為了檢測基因的親緣關(guān)系，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)TiAP1基因與烏拉爾圖小麥以及粗山羊草相應(yīng)基因有較近的親緣關(guān)系。上述結(jié)果為研究TiAP1基因的功能奠定了基礎(chǔ)。

小偃麥異附加系；TiAP1；基因克?。簧镄畔W(xué)分析；白粉病

小麥?zhǔn)悄壳叭蚍N植最廣的糧食作物之一。民以食為天，糧食問題一直關(guān)乎著國計民生，而小麥的產(chǎn)量與安全也關(guān)乎著國家的糧食安全。與水稻等農(nóng)作物相比，小麥中含有更加豐富的營養(yǎng)物質(zhì)。小麥與其他農(nóng)作物相比有較長的生長期，抗災(zāi)能力強(qiáng)，經(jīng)濟(jì)效益相對較高，對解決吃糧問題有很重要的現(xiàn)實意義[1]。但是，在生產(chǎn)過程中，有很多生物和非生物脅迫因素影響小麥的產(chǎn)量和品質(zhì)，比如：葉枯病、根腐病、黃葉病等。

小麥白粉病是常見小麥病害之一[2]，其病原菌是一種特殊的病原真菌，屬于禾本科布氏白粉菌(Blumeriagraminisf. sp.tritici)。它是活體營養(yǎng)專性寄生真菌，屬于子囊菌亞門真菌的一種[3]。近幾年來，白粉病蔓延迅速，至今為止，在全國所有麥區(qū)幾乎都有爆發(fā)，減產(chǎn)可達(dá) 1/10至1/5，發(fā)病最嚴(yán)重時減產(chǎn)可達(dá)2/5至3/5[4]，嚴(yán)重影響小麥豐產(chǎn)。

天冬氨酸蛋白酶(aspartic proticinase，APs)是四大類蛋白酶之一，該酶活性較強(qiáng)，即使在酸性環(huán)境下依然可以保持活性[5]，其在真核生物以及微生物中分布廣泛，主要參與機(jī)體的新陳代謝及生物調(diào)控[6]。多種生物體內(nèi)都存在APs，例如：病毒、真菌、哺乳動物及植物[7]。它在不同的植物器官中表達(dá)，比如：種子、莖、葉片、花、根。作為一類蛋白水解酶，天冬氨酸蛋白酶的生物學(xué)功能具有多樣性，其在不同的植物發(fā)育過程和部位行使的功能各有不同[8]。Kadek等[9]研究指出肉食性的豬籠草可以分泌一種液體以此來降解捕獲的昆蟲，為自身提供氮源，通過研究發(fā)現(xiàn)該液體中含有天冬氨酸蛋白酶，這種天冬氨酸蛋白酶最低可以在pH 2.5左右維持活性，且對于高pH值也顯示了不同尋常的活性。該天冬氨酸蛋白酶序列與其他植物、動物APs有很大不同，它含有更多的半胱氨酸殘基，這也可能是豬籠草能抗高溫和耐酸的原因。Chen等[10]在水稻中發(fā)現(xiàn)了96個OsAP基因，其中66個在葉中表達(dá)，種子中的AP基因受激素和黑暗/光照的誘導(dǎo)有不同程度的上調(diào)表達(dá)。

近幾年來，植物體內(nèi)天冬氨酸蛋白酶基因的研究越來越引起人們的關(guān)注。本實驗室在前期的研究中利用RNA-seq技術(shù)發(fā)現(xiàn)了一個新的天冬氨酸蛋白酶基因TiAP1,同時通過VIGS技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)該基因可能與白粉病有關(guān)。本研究則在此基礎(chǔ)上從小偃麥異附加系中克隆TiAP1基因全長，并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，以期為今后TiAP1基因的功能研究及在育種上的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1試驗材料

供試材料為本實驗室利用小麥近緣植物中間偃麥草(Thinopyrumintermedium，2n=42)與普通小麥煙農(nóng)15(TriticumaestivumL.，2n=42)雜交得到的小偃麥異附加系SN6306、小麥煙農(nóng)15以及中間偃麥草。

1.2材料處理

SN6306在蛭石和基質(zhì)比列1∶1的條件下進(jìn)行培養(yǎng)至三葉期，用鑷子涂抹接種白粉病菌生理小種E09，在處理0、12、24、48、72 h和96 h時取葉片，將取得的葉片放入液氮中速凍后，迅速放于-80℃冰箱中冷凍低溫保存，用于RNA的提取。

1.3 RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄

所用材料為經(jīng)白粉病處理12、24、48、72 h和96 h的SN6306葉片各個時間點(diǎn)的混合樣，RNA提取步驟參照全式金的EasyPureTMPlant RNA Kit提取試劑盒說明書進(jìn)行。RNA提取之后先用核酸測定儀 NanoPhotometer P360(Implent，德國)進(jìn)行濃度測定，再用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行RNA濃度和質(zhì)量測定。

以提取的葉片總RNA為模板，利用全式金的TransScript?First-Strand cDNA Synthesis SuperMix(TransGen，China)反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。具體過程如下：在RT管中加入總RNA約3 μg，Oligo(dT)2 μL，加水至終體積為9 μL，冰上操作，輕輕混勻；然后將管置于80℃ 3 min，冰上冷卻2 min；接著向管中加入2×TS Reaction Mix 10 μL，TransScript?RT/RI Enzyme Mix 1 μL，使最終的反應(yīng)體系為20 μL；接著反應(yīng)體系按如下程序進(jìn)行：42℃ 90 min，94℃加熱2 min，冰上放置2 min，輕輕混勻，然后向體系中加入80 μL DNase-free水對第一鏈cDNA 進(jìn)行稀釋，并放于-20℃冰箱待用。

1.4TiAP1基因克隆

根據(jù)先前的RNA-seq結(jié)果中得到的TiAP1基因序列，設(shè)計特異引物對APF: 5′-AGGCAGACCTCACCCAAAC-3′、APR: 5′-ACAGAGAGAATACTACGAGACACGA-3′，以得到的cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系(10 μL)為：cDNA 4 μL(約50 ng)，10 μmol/L APF/R引物各0.5 μL，2×PCR Mix 5 μL。反應(yīng)程序如下：首先94℃預(yù)變性5 min，然后進(jìn)入Touch Down-PCR循環(huán)：94℃變性30 s，退火(65～55℃)1 min，后72℃延伸2 min，退火溫度每個循環(huán)降低1℃，10個循環(huán)后降到55℃，再在55℃下進(jìn)行25個循環(huán)，最后72℃延伸10 min，于10℃保存。PCR反應(yīng)產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，利用EtBr進(jìn)行染色，凝膠成像儀成像。用TaKaRa膠回收試劑盒切取目的條帶進(jìn)行膠回收，回收基因與克隆載體pMD18-T連接，將連接產(chǎn)物交由上海博尚生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。

1.5生物信息學(xué)分析

對TiAP1基因序列和蛋白序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，具體為：TiAP1基因序列的開放閱讀框(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html, ORFfinder)、TiAP1蛋白序列的信號肽(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/, SignalP)、蛋白親疏水性(ProtScale, ExPASy)、蛋白結(jié)構(gòu)(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi, BLAST)等；蛋白質(zhì)的多序列聯(lián)配使用軟件DNAMAN；系統(tǒng)進(jìn)化樹分析使用軟件MEGA5。為了得到更多的TiAP1蛋白特征，進(jìn)行跨膜螺旋預(yù)測(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)[13]、蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)模型預(yù)測(http://www.sbg. bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index, Phyre2)[14，15]、蛋白質(zhì)的Z值計算和蛋白質(zhì)殘基能量的計算(https://prosa.services.came.sbg.ac.at/prosa.php)[16]以及等電點(diǎn)、分子量等預(yù)測。

1.6TiAP1基因組序列的擴(kuò)增比對

YN15、SN6306、中間偃麥草基因組DNA按照CTAB法提取，然后利用設(shè)計的APF/R引物以基因組DNA為模板擴(kuò)增TiAP1的基因組序列。擴(kuò)增體系：2×PCR Mix 5 μL，10 μmol/L APF/R各0.5 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O補(bǔ)至10 μL。反應(yīng)程序：首先94℃預(yù)變性5 min，然后進(jìn)入Touch Down-PCR循環(huán)：94℃變性30 s，退火(72～60℃)1 min，后72℃延伸2 min，退火溫度每個循環(huán)降低1℃，12個循環(huán)后降到60℃，再在60℃下進(jìn)行25個循環(huán)，最后72℃延伸10 min，于10℃保存。PCR反應(yīng)產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，利用EtBr進(jìn)行染色，凝膠成像儀成像。用TaKaRa膠回收試劑盒切取目的條帶進(jìn)行膠回收，回收基因與克隆載體pMD18-T連接，將連接產(chǎn)物交由上海博尚生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。

2 結(jié)果與分析

2.1TiAP1基因的克隆

利用設(shè)計的APF/R引物對TiAP1基因進(jìn)行擴(kuò)增，得到的基因全長為1 272 bp(圖1)，編碼423個氨基酸，通過BlastP分析，發(fā)現(xiàn)該基因?qū)儆谔於彼岬鞍酌讣易?圖2、圖3)。

M：DL2000 Marker；1：TiAP1擴(kuò)增條帶

圖1TiAP1基因擴(kuò)增結(jié)果

2.2TiAP1基因的多序列比對和聚類分析

利用TiAP1基因編碼的氨基酸序列在NCBI中查找，在11個其它物種中找到了APs蛋白，對其進(jìn)行多序列比對分析，結(jié)果表明TiAP1的氨基酸序列與這11個物種中的APs具有很高的相似性(圖4)。對這共計12個APs蛋白進(jìn)行進(jìn)化樹分析，發(fā)現(xiàn)TiAP1編碼的氨基酸序列與烏拉爾圖小麥以及粗山羊草中的APs序列相似，表現(xiàn)為親緣關(guān)系(圖5)。

2.3TiAP1基因組序列的擴(kuò)增比對

利用設(shè)計的APF/R引物，以提取的YN15、SN6306、中間偃麥草DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果(圖6)顯示，在SN6306和中間偃麥草中擴(kuò)出了大小一致的目的條帶，而YN15中卻未擴(kuò)增出任何條帶。測序分析發(fā)現(xiàn)，從SN6306和中間偃麥草中擴(kuò)增到的DNA序列相似性將近99%，而該基因序列與小麥已測序數(shù)據(jù)庫(https://wheat-urgi.versailles.inra.fr/Projects)中的AP基因相似性較低(圖7、圖8)。以上結(jié)果證明了TiAP1基因是來自于中間偃麥草的一個新基因。

圖2TiAP1基因的核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列

圖3 TiAP1蛋白的BlastP分析

TiAP1(Elytrigiaintermedia(Host) Nevski中間偃麥草)、TuAP(EMS56884.1,Triticumurartu烏拉爾圖小麥)、AtAP(EMT20017.1,Aegilopstauschii粗山羊草)、SiAP(XP_004953106.1,Setariaitalica狗尾草)、BdAP(XP_003578403.1,Brachypodiumdistachyon短柄草)、ZmAP(XP_008674331.1,Zeamays玉米)、NaAP(BAF98915.1,Nepenthesalata豬籠草)、VvAP(XP_002264056.1,Vitisvinifera葡萄)、SlAP(XP_004239638.1,Solanumlycopersicum番茄)、MaAP(XP_009410092.1,Musaacuminata野芭蕉)、PdAP(XP_008777368.1,Phoenixdactylifera海棗)、EgAP(XP_010907568.1,Elaeisguineensis油棕)。下圖同。

圖4 TiAP1與其他物種APs蛋白序列比對分析

2.4 TiAP1蛋白的生物信息學(xué)分析

分析發(fā)現(xiàn)TiAP1蛋白含有信號肽且位于第16和17個氨基酸殘基之間(圖9)，但是沒有跨膜螺旋，所以不是分泌蛋白(圖10)。該蛋白含有兩個木聚糖酶抑制劑結(jié)構(gòu)域，分別位于該蛋白的N和C末端(圖11)。

圖5 TiAP1與其他物種APs蛋白序列的聚類分析結(jié)果

M：DL2000 Marker；1：YN15；2：SN6306；3：中間偃麥草

圖6 APF/R引物對YN15、SN6306、中間偃麥草DNA的擴(kuò)增結(jié)果

圖7 SN6306、中間偃麥草TiAP1基因擴(kuò)增序列比對

TaAP-1～ TaAP-3為小麥中的3個AP基因。

圖9 TiAP1蛋白信號肽結(jié)構(gòu)的預(yù)測

圖10 TiAP1蛋白跨膜螺旋的預(yù)測

通過ProtParam對蛋白的理化特性進(jìn)行了分析，比如：分子量等電點(diǎn)(pI)消光系數(shù)以及親水系數(shù)等(表1)。通過SOPMA預(yù)測發(fā)現(xiàn)，在TiAP蛋白二級結(jié)構(gòu)中延伸鏈和無規(guī)則卷曲所占比例較高(表1)。

圖11 TiAP1的蛋白結(jié)構(gòu)域分析

圖12 TiAP1蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用Phyre2對TiAP蛋白進(jìn)行三級結(jié)構(gòu)預(yù)測以及準(zhǔn)確性分析(圖12)。為了識別三級結(jié)構(gòu)中的錯誤，用ProSA對三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行檢測。Z值是蛋白鏈通過X射線晶體照相或者核磁共振(NMR)計算出來的。Z值代表了整個模型的質(zhì)量，Z>0，表明三級結(jié)構(gòu)錯誤較多，而且不穩(wěn)定，Z值為0或負(fù)數(shù)表明三級結(jié)構(gòu)模型比較穩(wěn)定。通過計算該蛋白三級結(jié)構(gòu)模型的Z值為-8.52(圖13)，說明該三級結(jié)構(gòu)模型比較理想。從圖14可以看出氨基酸殘基大部分都小于零，說明目的蛋白是可以構(gòu)建三級結(jié)構(gòu)模型的。

圖13 蛋白質(zhì)Z值的計算

圖14 TiAP1蛋白質(zhì)中氨基酸殘基能量圖

表1 蛋白質(zhì)的初級結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)、翻譯后修飾、跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測

3 討論與結(jié)論

本研究利用RNA-seq技術(shù)從煙農(nóng)15和中間偃麥草雜交所得的小偃麥異附加系SN6306中克隆得到一個新的天冬氨酸蛋白酶基因TiAP1。該基因?qū)儆谔於彼岬鞍酌讣易澹L1 272 bp，編碼423個氨基酸，含有信號肽，與烏拉爾圖小麥以及粗山羊草具有較近的親緣關(guān)系。利用HMHMM對跨膜螺旋進(jìn)行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)沒有跨膜螺旋結(jié)構(gòu)，因此屬于胞外蛋白。對TiAP1蛋白的理化特性進(jìn)行預(yù)測，目的蛋白等電點(diǎn)約為5.9，信號肽的切割位點(diǎn)位于第16和17個氨基酸之間。此外，通過對該蛋白的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)中延伸鏈和無規(guī)則卷曲所占的比例較高，三級結(jié)構(gòu)構(gòu)建的模型比較穩(wěn)定。蛋白的空間結(jié)構(gòu)很大程度上決定了蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能，因此了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)對研究蛋白質(zhì)的功能有重要意義。

有研究發(fā)現(xiàn)天冬氨酸蛋白酶基因在生物體內(nèi)有重要作用。Contour-Ansel等[11]從普通大豆中克隆出一個天冬氨酸蛋白酶基因PvAP1，屬于典型天冬氨酸蛋白酶；同時發(fā)現(xiàn)PvAP1受水分脅迫的影響，影響其轉(zhuǎn)錄水平和翻譯后水平，由此推測天冬氨酸蛋白酶可能參與豆科植物的抗旱過程。Prasad等[12]在水稻中發(fā)現(xiàn)了一種編碼典型天冬氨酸蛋白酶的基因OsCDR1，通過原核表達(dá)系統(tǒng)得到OsCDR1融合蛋白，利用融合蛋白處理擬南芥葉片，發(fā)現(xiàn)PR2轉(zhuǎn)錄本在處理和未處理的葉片中均有表達(dá)，而CDR1編碼的沒有活性的融合蛋白不能誘導(dǎo)PR2轉(zhuǎn)錄本在局部和系統(tǒng)中的表達(dá)，這表明OsCDR1有引起植物體系統(tǒng)防御反應(yīng)的功能。

本研究較系統(tǒng)地研究了TiAP1基因的序列特征、系統(tǒng)進(jìn)化等方面的內(nèi)容，這在一定程度上為進(jìn)一步研究TiAP1基因的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

[1] 郭綿英, 劉紅茹.小麥白粉病的發(fā)生與綜合防治措施[J].農(nóng)技服務(wù), 2012, 29(3):305.

[2] 于艷娟, 李國利, 王學(xué)臣. 小麥白粉病的發(fā)生原因與防治措施[J]. 天津農(nóng)林科技, 2012 (4): 24-25.

[3] 牛祖彪. 白粉病菌誘導(dǎo)小偃麥異附加系SN6306差異表達(dá)基因的克隆與功能分析[D]. 泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué), 2014.

[4] 陳芳. 武隆縣小麥白粉病的發(fā)生原因及防治對策[J]. 南方農(nóng)業(yè), 2012, 6(10):43-44．

[5] Szecsi P B. The aspartic proteases[J]. Scandinavian Journal of Clinical Laboratory Investigation, 1992, 52(S210):5-22．

[6] Guevara M G, Oliva C R, Huarte M, et al. An aspartic protease with antimicrobial activity is induced after infection and wounding in intercellular fluids of potato tubers [J]. European Journal of Plant Pathology, 2002, 108(2):131-137

[7] Gomez-Gomez L, Felix G, Boller T. A single locus determines sensitivity to bacterial flagellin inArabidopsisthaliana[J]. Plant Journal, 1999, 18:277-284.

[8] 陳榮, 汲廣東. 天冬氨酸蛋白酶家族的分類、功能和演化[J]. 魯東大學(xué)學(xué)報, 2011, 27(4):328-334.

[9] Kadek A, Tretyachenko V, Mrazek H, et al. Expression and characterization of plant aspartic protease nepenthesin-1 fromNepenthesgracilis[J]. Protein Expression and Purification, 2014, 95:121-128.

[10] Chen J, Ouyang Y, Wang L. Aspartic proteases gene family in rice: gene structure and expression predicted protein features and phylo-genetic relation[J]. Gene, 2009, 442 (1/2):108-118.

[11] Contour-Ansel D, Torres-Franklin M L, Zuily-Fodil Y, et al. An aspartic acid protease from common bean is expressed ‘on call’ during water stress and early recovery [J]. Journal of Plant Physiology, 2010, 167(18): 1606-1612.

[12] Prasad B D, Creissen G, Lamb C, et al. Heterologous expression and characterization of recombinant OsCDR1, a rice aspartic proteinase involved in disease resistance[J]. Protein Expression and Purification, 2010, 72(2):169-174.

CloningandBioinformaticsofTiAP1GenefromThinopyrumintermedium

Tian Qiuju, Song Jing, Yang Yanlin, Xu Tian, Wang Honggang, Feng Deshun

(CollegeofAgronomy,ShandongAgriculturalUniversity/StateKeyLaboratoryofCropBiology,Taian271018,China)

The wheat-Thinopyrumalien addition line SN6306 was originated from the intergeneric hybridization between YN15 andThinopyrumintermedium(Host) Nevski. Through PCR amplification, the full length cDNA ofTiAP1 gene was obtained. Its open reading frame (ORF) was 1 272 bp and encoded a peptide of 423 amino acids. The BlastP analysis results showed that it belonged to the aspartic protease family. The bioinformatics analysis results showed that TiAP1 protein contained a signal peptide, whose cleavage site was located between the 16th and 17th amino acid, and two xylanase inhibitor domain structures, which located in the N and C end respectively. The TMHMM predicting results showed that the protein had no transmembrane helix structure. So the protein was not secreted protein. The phylogenetic tree showed thatTiAP1 gene was similar to the corresponding gene inTriticumurartuThum.ex Gandil andAegilopstauschii. These results would provide the reference for the research ofTiAP1 gene functions.

Wheat-Thinopyrumalien addition line;TiAP1; Gene clone; Bioinformatics analysis; Powdery mildew

S512.901

A

1001-4942(2017)10-0001-09

10.14083/j.issn.1001-4942.2017.10.001

2017-05-17

國家重點(diǎn)研發(fā)計劃項目(2016YFD0102000)；國家自然科學(xué)基金面上項目(31171552)

田秋菊(1990—)，女，在讀碩士研究生，研究方向為生物技術(shù)在小麥遺傳改良中的應(yīng)用。E-mail: qiujutian@yeah.net

封德順(1970—)，男，教授，主要從事小麥分子生物技術(shù)育種研究。E-mail: dsfeng@sdau.edu.cn