廣東省河源市疾病預防控制中心（517000）黃豐光

廣東省河源出入境檢驗檢疫局（517000）王旸

大腸埃希氏菌為埃希氏菌屬，在人體中與自然界均廣泛分布，大部分菌種均不會損害人類健康，存在于人體中來保障正常的腸道功能[1]。其中，致瀉性大腸埃希氏菌可誘發(fā)不同程度消化系統(tǒng)問題，其致病過程較為復雜，所引發(fā)的胃腸道癥狀也相對嚴重，在上世紀90年代便被歸為主要食品致病菌之一[2]。根據(jù)致瀉性大腸埃希氏菌的致病情況差異，可將其分為腸出血性（EHEC）、腸道侵襲性（EIEC）、腸道致病性（EPEC）、腸毒素性（ETEC）與腸集聚性黏附性（EAEC）等5種類型以及11種相關(guān)毒力基因[3]。致瀉性大腸埃希氏菌在食品中毒中占據(jù)顯著地位[4]，在食品安全風險中開展相關(guān)檢測對維持安全飲食具有重要意義。本研究采用多重PCR法檢測食品中致瀉性大腸埃希氏菌及其毒力基因，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 選用本市食品安全風險監(jiān)測中心提供的80株大腸埃希氏菌，均為食品致病因子安全風險檢測所獲得。

1.2 儀器與試劑 采用杭州大微DW-800多重PCR食品致病菌核酸檢驗系統(tǒng)，英國Oxoid R8311002生化鑒定系統(tǒng)，北京卓誠惠生生物科技有限公司提供的5種致瀉性大腸埃希氏菌多重PCR試劑盒，廣州健侖生物科技有限公司提供的大腸埃希氏菌血清，上海滬震實業(yè)有限公司提供的大腸埃希氏菌O157顯色培養(yǎng)基，上海古朵生物科技有限公司提供的營養(yǎng)瓊脂斜面與EC肉湯，北京蘭伯瑞生物技術(shù)有限責任公司提供的革蘭氏陰性桿菌鑒定卡。

1.3 檢測方法

1.3.1 細菌分離與血清反應 根據(jù)我國《食品安全風險監(jiān)測手冊》中致瀉性大腸埃希氏菌檢測方法，對食品標本進行分離培養(yǎng)、血清凝集試驗。

1.3.2 核酸DNA提取 按照北京卓誠惠生生物科技有限公司的指示說明書進行核酸提取與核酸檢驗。首先，制備菌懸液（0.5～4.0個麥氏濁度），采用離心機對菌懸液進行離心處理（13000rpm，3min），取其上清液再注入核酸提取液50μL，使其均勻、充分混合后再行沸水浴與離心處理（13000rpm，10min），最后取其上清液為參考模板。

附表 80株大腸埃希氏菌的毒力基因與血清型檢測結(jié)果

附圖 80株大腸埃希氏菌的致病型檢測結(jié)果

1.3.3 多重PCR擴增 根據(jù)北京卓誠惠生生物科技有限公司提供的5種致瀉性大腸埃希氏菌多重PCR試劑盒說明書進行操作，反應條件如下：95℃ 4min，95℃ 30s，62℃ 30s，72℃ 90s 30次，72℃ 5min，取2μL大腸埃希氏菌DNA，研究中陰性對照物為雙蒸水，陽性對照物為5種致瀉性大腸埃希氏菌多重PCR試劑盒中陰性對照品，均以標準株為準開展質(zhì)控工作。

1.3.4 多重PCR產(chǎn)物分析 PCR產(chǎn)物采用毛細管電泳系統(tǒng)自動化分析，大腸埃希氏菌均存在1條1480bp uidA擴增條帶，如出現(xiàn)則可判作為致瀉性大腸埃希氏菌，在評定毒力基因類型時參考毒力組合方式與擴增條大小。其中，EPEC型毒力基因包括bfp8（910bp）、escV（544bp），陽性判定依據(jù)為escV（+）、bfpB（+）、stx1（-）、stx2（-）或escV（+）、bfpB（-）、stx1（-）、stx2（-）；EHEC型毒力基因包括escV（544bp）、stx1（244bp）、stx2（3 2 4 b p），陽性判定依據(jù)為e scV（+/-）、bfpB（-）、stx1（+）、stx2（-）或escV（+/-）、bfpB（-）、stx1（-）、stx2（+）或escV（+/-）、bfpB（-）、stx1（+）、stx2（+）；ETEC型毒力基因包括elt（655bp）、estla（157bp）、estlb（171bp），陽性判定依據(jù)為estla、estlb與elt中有1條及以上為陽性；EIEC型毒力基因包括invE（766bp），陽性判定依據(jù)為invE（+）；EAEC型毒力基因包括astA（102bp）、aggR（400bp）與pic（1111bp），陽性判定依據(jù)為pic、aggR與astA中有1條及以上為陽性。

2 結(jié)果

2.1 80株大腸埃希氏菌的致病型檢測結(jié)果 如附圖所示，20株（25.0%）為EAEC型，21株（26.3%）為EPEC型，7株（8.8%）為ETEC型，0株為EHEC型，1株（1.3%）為EIEC型，31株（38.8%）為不明類型。

2.2 80株大腸埃希氏菌的毒力基因與血清型檢測結(jié)果 如附表所示，7株ETEC樣本的血清型包括025K11、0114+∶K-、078K80、0126K71，1株EIEC樣本的血清型為028K73，20株EAEC樣本的血清型包括086K61、044K74、078K80，21株EPEC樣本的血清型包括086K61、0157+∶H7-、044K74、026K60、0128K67、0126K71、028K73。

3 討論

大腸埃希氏菌廣泛存在于人體與自然界中，其中大部分菌株均不會對人體造成明顯危害，但部分攜帶毒力基因菌株則會嚴重影響人類消化系統(tǒng)健康，感染后便會出現(xiàn)不同程度的胃腸道癥狀，嚴重時甚至會誘發(fā)地區(qū)性腹瀉爆發(fā)。本次研究選擇食品安全風險監(jiān)測中心提供的80株大腸埃希氏菌，分別進行多重PCR監(jiān)測。結(jié)果表現(xiàn)EAEC型20株（25.0%），EPEC型21株（26.3%），ETEC型7株（8.8%），EHEC型0株，EIEC型1株（1.3%），不明類型31株（38.8%），主要以EAEC型與EPEC型最為多見。同時，ETEC樣本的血清型包括025K11、0114+∶K-、078K80、0126K71，EIEC樣本的血清型為028K73，E A E C 樣本的血清型包括0 8 6 K 6 1、044K74、078K80，EPEC樣本的血清型包括086K61、0157+:H7-、044K74、026K60、0128K67、0126K71、028K73。根據(jù)結(jié)果分析大腸埃希氏菌的血清型與毒力基因存在一定程度差異，進而單純依賴血清檢驗對食品污染缺乏準確性，也表現(xiàn)出食品安全風險監(jiān)測中大腸埃希氏菌具有一定特異性，在常規(guī)血清檢驗基礎上開展毒力基因檢測更有利于細菌致病型的辨別。目前，臨床已知的大腸埃希氏菌毒力基因有十余種，而不同致病型可對其噬菌體與質(zhì)粒進行傳播，進而全面開展相關(guān)毒力基因檢測才能準確評估細菌致病性。以往單重PCR法并不適合應用于大樣本量檢測中，多重PCR檢驗法可同時進行多基因測定，在明確細菌菌種的基礎上全面檢測多毒力基因，保證了食品檢驗的高效性與便捷性，可作為食品安全風險監(jiān)測的重要手段。

綜上所述，食品安全風險監(jiān)測中采用多重PCR檢測致瀉大腸埃希氏菌毒力基因能夠輔助辨別其致病型，具有良好應用價值。