馬春寶 李沅 景明 樊鉑

復(fù)合磷酸鈣顆粒溶解性能測試研究*

馬春寶 李沅 景明 樊鉑

目的研究復(fù)合磷酸鈣顆粒（HA∶TCP=3∶7）在TRIS緩沖溶液中的體外溶解特性。方法配制一系列濃度逐級遞增的Ca2+標(biāo)準(zhǔn)溶液，繪制Ca2+離子溶液的工作曲線。將復(fù)合磷酸鈣顆粒（HA∶TCP=3∶7）置于pH值為7.4的TRIS緩沖溶液中浸泡，每小時取樣一次（初始階段每3分鐘取樣一次），用高速離心技術(shù)提取上層清液，采用電感耦合等離子體質(zhì)譜法測定各時間點提取液的Ca2+濃度，繪制Ca2+濃度對浸泡時間的溶解曲線。結(jié)果Ca2+離子溶液的工作曲線的線性方程為y=4043.9x+23783，相關(guān)系數(shù)R為0.9999，方法檢出限為0.0063 g/mL，定量限為0.021 g/mL。浸泡后最初的0.5h以內(nèi)，Ca2+濃度隨時間延長急劇升高，0.5h處有明顯轉(zhuǎn)折，0.5 h至20 h，Ca2+濃度仍隨時間增加而升高，但是增加的速率較前0.5 h明顯下降，20 h以后溶解達到基本平衡。復(fù)合磷酸鈣顆粒的溶解過程分為3個階段，首先是Ca2+離子濃度快速升高的溶解過程，第二階段是Ca2+離子溶解與HA或CaHPO4·2H2O沉積的競爭過程，第三階段是Ca2+離子濃度不再繼續(xù)增加的穩(wěn)定過程。結(jié)論 復(fù)合磷酸鈣顆粒（HA∶TCP=3∶7）在TRIS緩沖溶液中的溶解具有一定的規(guī)律性，24 h后溶出的Ca2+離子濃度在1200 g/L左右。

磷酸鈣；溶解行為；電感耦合等離子體質(zhì)譜法

1 前言

羥基磷灰石，其標(biāo)準(zhǔn)鈣磷原子比為1.67，與正常人體骨的鈣磷比相當(dāng)，而且其分子結(jié)構(gòu)與人體骨的無機成分相似，具有良好的生物相容性[1]。目前已廣泛應(yīng)用于骨科植入物，牙科植入物和關(guān)節(jié)涂層等方面，并已形成國家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，如 YY 0305-1998[2]，YY 0303-1998[3]，GB/T 23101.2-2008[4]等。

2 儀器與試劑

電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（NexION300X型，美國Perkin-Elmer公司），pH計（FE20型，梅特勒-托利多儀器上海有限公司），水浴搖床（SW22型，德國優(yōu)萊博公司）。復(fù)合磷酸鈣顆粒（HA∶TCP=3∶7，韓國登騰公司），此種配比的復(fù)合磷酸鈣顆粒臨床應(yīng)用最常見，是目前臨床應(yīng)用的主流產(chǎn)品。三羥甲基氨基甲烷（分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司），Ca離子標(biāo)液（100g/mL，核工業(yè)北京化工冶金研究院），氯化鈉（分析純，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司），氯化鈣（分析純，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司），磷酸鉀（分析純，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司）。

3 試驗方法

3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置

選取100 g/mL的Ca2+標(biāo)液，使用2%的硝酸按質(zhì)量法逐級稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成濃度為300、600、900、1200、1500（ g/L）的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。

3.2 儀器優(yōu)化與工作條件的確定

測試前使用 1g/L（Li、Be、Mg、Fe、In、Ce、Pb、U）的Setup溶液對儀器進行優(yōu)化，確保優(yōu)化評價的各項性能指標(biāo)如靈敏度等達到儀器制造商的要求。本試驗具體的工作條件和參數(shù)（見表1）。

表1 工作條件和參數(shù)

3.3 緩沖液配制

使用三（羥甲基）氨基甲烷，氯化鈉，氯化鈣，磷酸鉀，配置在溫度為（37±0.5）℃時，pH=7.4的TRIS緩沖溶液，并用pH計（測量前先用標(biāo)準(zhǔn)溶液進行標(biāo)定）測量試驗開始之前的pH值。

3.4 磷酸鈣溶解試驗

精確稱取樣品質(zhì)量，依據(jù)美國標(biāo)準(zhǔn) ASTM F1926-2014[13]的要求，按照材料質(zhì)量（mg）/溶液介質(zhì)體積（mL）比例為4：1的比例加入一定體積的 TRIS緩沖液。同樣，依據(jù)美國標(biāo)準(zhǔn)ASTM F1926-2014的要求設(shè)定水浴搖床轉(zhuǎn)速為（100±20）rpm，溫度為（37±0.5）℃。分別于特定的時間間隔（最初的15 min，每3 min取樣；15 min以后，每1 h取樣。）取出容器，經(jīng)高速離心分離，提取溶液部分作為待測樣，測定各取樣時間點Ca2+濃度，并繪制溶解速率曲線。

4 結(jié)果與討論

4.1 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

按照前文中3.1的要求依次配制300、600、900、1200、1500（ g/L）的標(biāo)準(zhǔn)溶液，以信號強度對標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度繪制曲線，并進行線性擬合，得到的線性方程為y=4043.9x+23783,相關(guān)系數(shù)R為0.9999。

檢出限和定量限的計算需對試劑空白對照溶液進行10次測試，計算其標(biāo)準(zhǔn)偏差，并以此標(biāo)準(zhǔn)偏差的3倍值作為方法的檢出限，以標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍值作為方法的定量限[14]。通過以上方法測得本試驗的檢出限為0.0063 g/mL，定量限為0.021 g/mL。

4.2 磷酸鈣材料的溶解速率

分別于 3 min，6 min，9 min，12 min，15 min，1 h，2 h，3 h……24 h，取出溶解試驗后的溶液，立即離心分離，取上層清液利用電感耦合等離子體質(zhì)譜法測定溶液中的Ca2+離子濃度。以溶解時間為橫坐標(biāo)，溶出的Ca2+離子濃度為縱坐標(biāo)，繪制磷酸鈣材料的溶解曲線圖。

圖1 溶解的Ca2+離子濃度與浸泡時間

圖2 第1階段溶解

圖3 第2階段溶解

圖4 pH值隨浸泡時間變化

復(fù)合磷酸鈣顆粒（HA∶TCP=3∶7）在pH值為7.4的TRIS緩沖溶液中浸泡，Ca2+離子濃度會隨著浸泡時間的延長而產(chǎn)生變化。圖1為復(fù)合磷酸鈣顆粒（HA∶TCP=3∶7）浸泡在pH7.4的TRIS溶液中Ca2+離子的溶出速率變化。從圖1和圖2中可看出在最初的0.5h以內(nèi)，Ca2+濃度隨時間延長急劇升高，通過計算得到，0.5 h以內(nèi)曲線的斜率為119.9。0.5 h處有明顯轉(zhuǎn)折，從圖1和圖3看出0.5 h至20 h，Ca2+濃度仍隨時間增加而升高，但是增加的速率較前0.5 h明顯下降，0.5 h至20 h曲線的斜率為25.3，是第一階段的1/5，溶解速率下降接近4/5。20h以后溶解達到基本平衡。

一般認為HA溶解過程中在顆粒表面發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，首先發(fā)生如式（4.2.1、4.2.2）所示的化學(xué)反應(yīng)，隨著 OH-的釋放和 H+的消耗，溶液的 pH值會逐漸升高，但由于式（4.2.1、4.2.2）反應(yīng)速率很小，pH值升高幅度不大，最終趨于平衡，見圖4。隨著浸泡時間的延長和復(fù)合磷酸鈣材料的溶解，其中HA相的結(jié)晶度會逐漸降低，浸泡24 h后，復(fù)合磷酸鈣顆粒的結(jié)晶度下降4%，見圖5。發(fā)生如式（4.2.3、4.2.4）所表示的化學(xué)反應(yīng)。

磷酸三鈣在pH值7.4的TRIS溶液中浸泡時，也會發(fā)生如式（4.2.3-4.2.5）的溶解反應(yīng)，導(dǎo)致鈣離子濃度的增加。這解釋了溶解初期0.5 h，Ca2+離子濃度的快速升高。當(dāng)溶解的Ca2+離子濃度達到過飽和的時候，就會發(fā)生HA或Ca-HPO4·2H2O的沉積反應(yīng)（如式4.2.6、4.2.7）。沉積反應(yīng)消耗了一部分 Ca2+離子，使得 Ca2+離子濃度增長速率放緩，隨著新的Ca2+離子的不斷溶解，以及溶解的Ca2+離子的沉積，最終Ca2+離子濃度在24h以后不再繼續(xù)增加，而是達到一個穩(wěn)定值。復(fù)合磷酸鈣顆粒的溶解過程分為3個階段，首先是Ca2+離子濃度快速升高的溶解過程，第二階段是Ca2+離子溶解與HA或CaHPO4·2H2O沉積的競爭過程，[15]第三階段是Ca2+離子濃度不再繼續(xù)增加的穩(wěn)定過程。

圖5 復(fù)合磷酸鈣顆粒不同浸泡時間的XRD圖

5 結(jié)論

本文采用電感耦合等離子體質(zhì)譜法測定了復(fù)合磷酸鈣材料在pH=7.4的TRIS緩沖溶液中溶解的Ca2+離子濃度，發(fā)現(xiàn)在起初的0.5 h內(nèi)Ca2+離子濃度急劇升高，發(fā)生了突釋，此步驟即為復(fù)合磷酸鈣材料的表面溶解過程，0.5 h后溶解速率放緩，此步驟為磷酸鈣的溶解與HA或CaHPO4·2H2O沉積的競爭過程，沉積消耗了部分Ca2+離子，減緩了Ca2+離子濃度的升高速度。20h以后Ca2+離子濃度穩(wěn)定在1200 g/L左右，此時磷酸鈣的溶解與HA或CaHPO4·2H2O沉積達到了平衡的過程。總體來看，復(fù)合磷酸鈣材料在 TRIS緩沖溶液中的溶解速率和溶出濃度具有一定的規(guī)律性。

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The study on dissolution testing of Calcium phosphate composite particles

Ma Chunbao,Li Yuan,Jing Ming,et al.Supervision and Testing Center for Medical Devices of TianJin,TianJin,300384,China

Objective To study the dissolution characteristics of calcium phosphate composite particles(HA∶TCP=3∶7)in TRIS buffer solution.Methods A series of standard Ca2+solutions with increasing concentration are prepared,and the working curve of Ca2+ion solution was drawn.The composite calcium phosphate particles(HA∶TCP=3∶7)in the pH value for7.4TRIS buffer solution,sampling once per hour(initial samples were collected every3 min),extracted from the supernatant by high speed centrifugation,measured at each time point of the concentration of Ca2+extraction liquid by inductively coupled plasma mass spectrometry.The dissolution curve of Ca2+concentration on soaking time was drawn.ResultsThe linear equation of the working curve of Ca2+ionic solution is y=4043.9x+23783,and the correlation coefficient R is 0.9999.The detection limit is 0.0063 g/mL,and the quantitative limit is 0.021 g/mL.After the initial immersion within 0.5 h,the concentration of Ca2+increased with time dramatically,marked a turning point at 0.5 h,From 0.5 h to 2 h,the concentration of Ca2+ion increased with time,but the rate of increase decreased obviously compared with the first0.5h.After 20 h,the dissolution reached the basic balance.The dissolution process of calcium phosphate composite particles can be divided into 3 stages,the first is the dissolution process of Ca2+ion concentration increased rapidly,the second stage is the competition process of Ca2+dissolution with HA or CaHPO4·2H2O deposition,the third stage is the stable process of Ca2+ion concentration will no longer increase.Conclusion The dissolution of composite calcium phosphate particles(HA∶TCP=3∶7)in TRIS buffer solution has a certain regularity,and the concentration of Ca2+ions dissolved in 24h is about 1200 g/L.

Calcium phosphate;Dissolution behavior;ICP-MS

10.3969/j.issn.1672-5972.2017.05.002

swgk2017-06-00138

R318.08

A

國家科技支撐計劃課題“戰(zhàn)略性新興醫(yī)療器械產(chǎn)業(yè)關(guān)鍵技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)研究”(課題編號：2015BAI44H01)

天津市醫(yī)療器械質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心，天津300384

磷酸三鈣，其標(biāo)準(zhǔn)鈣磷原子比為1.50，與正常人體骨的鈣磷比接近，不但具有良好的生物相容性，而且植入人體后能較快降解且降解產(chǎn)物對人體無毒害作用 [5]。磷酸三鈣材料及產(chǎn)品目前已廣泛應(yīng)用于四肢、脊柱、骨盆等方面，填補那些由創(chuàng)傷或手術(shù)造成的腔洞狀骨缺損，已形成的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)包括YY/T 0683-2008[6]等。

單一的羥基磷灰石或磷酸三鈣材料均具有一定的劣勢。羥基磷灰石材料雖然具有良好的生物相容性，并且能提供一定的支撐作用，但是生物降解速率很慢，降解速率不及自體骨的生長速率。磷酸三鈣材料的生物降解顯著，可能導(dǎo)致人體骨還沒有完全愈合的情況下磷酸鈣已降解完全 [7]。當(dāng)羥基磷灰石或磷酸三鈣獨立使用，不能滿足促進骨再生的要求，需要將其通過物理或化學(xué)的手段復(fù)合在一起，綜合各自組分的優(yōu)點，通過調(diào)節(jié)各組分的比例，達到控制復(fù)合材料降解速率的目的 [8-10]。

目前，關(guān)于磷酸鈣材料的研究均專注于磷酸鈣材料的結(jié)構(gòu)組成、理化性能、生物學(xué)性能等指標(biāo)，對于磷酸鈣材料的降解速率、降解機理等未進行深入研究，而且也沒有形成統(tǒng)一規(guī)范的評價方法 [11,12]。國際標(biāo)準(zhǔn)化組織（ISO）和我國的標(biāo)準(zhǔn)化機構(gòu)均未推出關(guān)于磷酸鈣材料溶解性測試與評價相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。本文研究的主要目的是使用電感耦合等離子體質(zhì)譜法測試復(fù)合磷酸鈣顆粒在TRIS緩沖溶液溶解的Ca2+濃度，分析Ca2+離子濃度隨浸泡時間變化的規(guī)律，探討形成這種變化規(guī)律的原因。