趙樹(shù)臣 ， 潘秋亮 ， 劉克祥 ， 侯振中

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院 ， 黑龍江 哈爾濱 150030)

HCLP法測(cè)定中藥泡騰栓組分含量的研究

趙樹(shù)臣 ， 潘秋亮 ， 劉克祥 ， 侯振中

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院 ， 黑龍江 哈爾濱 150030)

在前期采用正交法篩選出具有清熱解毒抑菌、去腐生肌的中藥組方泡騰栓的基礎(chǔ)上，采用HCLP法測(cè)定該中藥泡騰栓中主要成分綠原酸和黃芩苷的含量，以此評(píng)價(jià)其質(zhì)量，更高效地治療奶牛子宮內(nèi)膜炎。結(jié)果顯示，綠原酸在波長(zhǎng) 349 nm 下和黃芩苷在270 nm下，標(biāo)準(zhǔn)品分別在5.144 min和6.823 min出現(xiàn)明顯的色譜峰，而陰性對(duì)照無(wú)峰出現(xiàn)。綠原酸和黃芩苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)分別為A=10068C-2351.1，R=0.9995；A=20919C-132936，R=0.9999；精密度和重現(xiàn)性均良好；加樣回收率分別為99.46±0.93和99.23±0.64；每粒栓劑中綠原酸和黃芩苷含量分別為2.91±0.031 mg和13.48±0.113 mg。表明建立起來(lái)的HPLC條件可以對(duì)該中藥泡騰栓組分進(jìn)行含量分析，并可評(píng)價(jià)其質(zhì)量，為治療奶牛子宮內(nèi)膜炎中藥栓劑的研發(fā)和生產(chǎn)提供質(zhì)量檢測(cè)保證。

HCLP ； 中藥泡騰栓 ； 奶牛 ； 子宮內(nèi)膜炎

子宮內(nèi)膜炎是造成奶牛不孕癥的主要原因之一。中藥具有副作用小、殘留少和不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn),治療奶牛子宮內(nèi)膜炎多以活血化瘀、清熱解毒、抑菌消炎為原則[1]。將篩選出的中藥組方制備成泡騰栓劑，通過(guò)子宮給藥，通過(guò)泡騰劑作用下產(chǎn)生大量的泡沫，將中藥成分帶入到子宮黏膜皺褶，從而更大程度發(fā)揮藥物的作用，以達(dá)到更好的治療效果[2]。此項(xiàng)研究的目的是采用HCLP法測(cè)定已篩選研發(fā)的中藥組方泡騰栓中主要成分的含量，評(píng)價(jià)制備過(guò)程各主要成分的有效性和質(zhì)量，為中藥栓劑治療奶牛子宮內(nèi)膜炎的研發(fā)和生產(chǎn)提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器 高效液相色譜儀；二極管紫外檢測(cè)器；電子分析天平等。

1.2 主要試劑 檸檬酸、碳酸氫鈉、聚乙二醇(PEG)-6000、吐溫-80等均為分析純，甲醇、冰醋酸，為色譜純；蒲公英、當(dāng)歸、川芎等中藥提取物顆粒。

2 方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制 精確稱(chēng)取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg，用50%甲醇溶液定容配制400 μg/mL的儲(chǔ)備液和不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，備用；精確稱(chēng)取黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品10.4 mg，用50%(v/v)甲醇溶液定容配制416 μg/mL的儲(chǔ)備液和不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，備用。

2.2 供試品溶液的配制 取制備的中藥泡騰栓10粒，研細(xì)，精確稱(chēng)取2 g，置于100 mL容量瓶中，加入適量50%甲醇溶液，超聲處理30 min，用50%甲醇溶液定容，離心，取上清液，有機(jī)微孔濾膜(0.22 μm)過(guò)濾，得到綠原酸的供試品溶液，備用；同樣方法處理得到黃芩苷的供試品溶液，備用。

2.3 色譜條件 色譜柱為Hyper sil BDS C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；綠原酸流動(dòng)相為甲醇-1%冰醋酸(30∶70)，檢測(cè)波長(zhǎng)為349 nm；黃芩苷流動(dòng)相為甲醇-1%冰醋酸(50∶50)；檢測(cè)波長(zhǎng)為 270 nm，流速均為1 mL/min，進(jìn)樣量均為10 μL，柱溫均為25 ℃。

2.4 陰性對(duì)照試驗(yàn) 按處方分別稱(chēng)取不含雙花和蒲公英以及不含黃芩的其他藥材，依照處方加工工藝制備成泡騰栓，然后按照供試品溶液的制備方法制成陰性對(duì)照溶液，按照上述測(cè)定條件進(jìn)行試驗(yàn)。

2.5 陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn) 根據(jù)栓劑組方配比，用雙花、蒲公英和黃芩的中藥提取物顆粒按照供試液的方法制備成綠原酸陽(yáng)性和黃芩苷陽(yáng)性對(duì)照溶液，按照上述測(cè)定條件進(jìn)行試驗(yàn)。

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 精確吸取不同濃度的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液和黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按上述測(cè)定條件分別測(cè)定兩種標(biāo)準(zhǔn)品，并記錄色譜圖及色譜峰面積A，并進(jìn)行色譜分析，用峰面積A為縱坐標(biāo)，以對(duì)照品質(zhì)量濃度C為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

2.7 精密度試驗(yàn) 按上述色譜條件，分別吸取綠原酸和黃芩苷對(duì)照品溶液10 μL進(jìn)樣，重復(fù)進(jìn)樣5次，以綠原酸和黃芩苷的的峰面積計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

2.8 重現(xiàn)性試驗(yàn) 定量稱(chēng)取5份中藥泡騰栓粉末，溶解，定容，按照配制綠原酸供試液和黃芩苷供試液的方法處理，進(jìn)行HPLC測(cè)定，每次進(jìn)樣10 μL，分別計(jì)算峰面積的RSD。

2.9 樣品含量測(cè)定 精確稱(chēng)取中藥泡騰栓粉末，按上述方法分別測(cè)定10個(gè)綠原酸和黃芩苷供試品溶液，每次進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積，分別計(jì)算中藥泡騰栓中綠原酸和黃芩苷的含量。

2.10 加樣回收率試驗(yàn) 精密吸取已知含量的綠原酸供試品和黃芩苷供試品各4份，分別對(duì)應(yīng)加入一定質(zhì)量的綠原酸對(duì)照品溶液和黃芩苷對(duì)照品溶液，按上述條件分別測(cè)定，按下列公式計(jì)算回收率。

3 結(jié)果

3.1 綠原酸和黃芩苷色譜圖 根據(jù)圖1～圖4顯示，在此條件下，綠原酸標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品在5.144 min處有明顯的色譜峰，綠原酸供試液在5.132 min處出現(xiàn)明顯色譜峰，而在此刻附近陰性對(duì)照品溶液幾乎無(wú)峰出現(xiàn)。表明綠原酸的陰性對(duì)照對(duì)其測(cè)定基本無(wú)干擾，綠原酸陽(yáng)性對(duì)照在5.167 min處出現(xiàn)相似峰形。

圖1 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品高效液相色譜圖

圖2 綠原酸陰性對(duì)照品高效液相色譜圖

圖3 綠原酸陽(yáng)性對(duì)照高效液相色譜圖

圖4 綠原酸供試品高效液相色譜圖

圖5 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品高效液相色譜圖

圖6 黃芩苷陰性對(duì)照品高效液相色譜圖

圖7 黃芩苷陽(yáng)性對(duì)照高效液相色譜圖

圖8 黃芩苷供試品高效液相色譜

根據(jù)圖5～圖8顯示，在此條件下，黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品在6.823 min出現(xiàn)明顯的色譜峰，黃芩苷供試液在6.678 min處出現(xiàn)了相同峰形，黃芩苷陽(yáng)性對(duì)照在6.788 min處出現(xiàn)了相同峰形，而此刻附近陰性對(duì)照基本無(wú)峰出現(xiàn)，表明黃芩苷的陰性對(duì)照對(duì)其測(cè)定無(wú)干擾。

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 用峰面積A對(duì)濃度C進(jìn)行回歸處理，得到綠原酸和黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)溶液的線(xiàn)性回歸方程分別為：A=10068C-2351.1，R=0.999 5；A=20919C-132936，R=0.999 9，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)見(jiàn)圖9和圖10。結(jié)果表明，綠原酸和黃芩苷分別在3.2～25.6 μg/mL和20.8～62.4 μg/mL范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

圖9 綠原酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

圖10 黃芩苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

3.3 精密度測(cè)試結(jié)果 綠原酸精密度試驗(yàn)結(jié)果顯示，綠原酸峰面積的RSD為0.85%，表明精密度良好；黃芩苷精密度試驗(yàn)結(jié)果顯示，黃芩苷峰面積的RSD為0.47%，表明精密度良好。

3.4 重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果 綠原酸重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果顯示，綠原酸峰面積的RSD為1.36%，表明綠原酸重現(xiàn)性良好；黃芩苷重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果顯示，黃芩苷峰面積的RSD為0.86%，表明黃芩苷重現(xiàn)性良好。

3.5 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 標(biāo)準(zhǔn)品中加入1.60 mg綠原酸，測(cè)得回收率為99.46±0.93；加入黃芩苷2.08 mg，黃芩苷的平均加樣回收率為99.23±0.64。

3.6 樣品含量測(cè)定結(jié)果 中藥泡騰栓均為重量差異合格，平均栓重2.183 g/粒，每粒栓劑中綠原酸含量為2.91±0.031 mg；每粒栓劑中黃芩苷的含量為13.48±0.113 mg。

4 討論

中草藥治療奶牛子宮內(nèi)膜炎具有很大優(yōu)勢(shì)，而泡騰栓劑則能在泡騰栓崩解過(guò)程中將藥物帶入到子宮黏膜皺褶，從而更大程度地發(fā)揮藥物的作用，以此得到更好的治療效果。此研究是在前期以中藥的抑菌為前提，經(jīng)正交法篩選泡騰栓基質(zhì)最佳配比并制備成中藥泡騰栓劑的基礎(chǔ)上進(jìn)行的后續(xù)研究[3]。HCLP具有分辨率高，重現(xiàn)性好，常用于藥品的質(zhì)量控制、中藥的成分研究等方面[4]。

試驗(yàn)采用HPLC法對(duì)中藥泡騰栓劑中的雙花、蒲公英的主要有效成分綠原酸，以及黃芩的主要有效成分黃芩苷進(jìn)行定量分析。經(jīng)全波長(zhǎng)掃描，發(fā)現(xiàn)綠原酸的最大吸收波長(zhǎng)為349 nm，黃芩苷的最大吸收波長(zhǎng)為270 nm，和中國(guó)藥典(2010版)[5]“金銀花”中的綠原酸的檢測(cè)波長(zhǎng)327 nm，黃芩苷的檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm有所差異，但是也符合測(cè)定范圍，故選擇全波長(zhǎng)掃描結(jié)果為后期測(cè)定的最佳波長(zhǎng)。在綠原酸含量的測(cè)定中，流動(dòng)相甲醇：1%冰醋酸為30∶70時(shí)雜峰基本無(wú)干擾；在黃芩苷含量的測(cè)定中，流動(dòng)相甲醇：1%冰醋酸比例為50∶50時(shí)為最佳。在本試驗(yàn)中建立的色譜條件下，綠原酸和黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品分別在5.144 min和6.823 min出現(xiàn)明顯的色譜峰，而供試液和陽(yáng)性對(duì)照在相近位置出現(xiàn)相同峰形，但陰性對(duì)照無(wú)峰出現(xiàn)，表明陰性對(duì)照對(duì)其測(cè)定無(wú)干擾。在本試驗(yàn)中建立的色譜條件下，綠原酸和黃芩苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的線(xiàn)性關(guān)系、精密度和重現(xiàn)性均良好；通過(guò)陰性對(duì)照試驗(yàn)、回收率試驗(yàn)結(jié)果顯示建立起來(lái)的HPLC條件可以對(duì)該中藥泡騰栓組分進(jìn)行定量分析。

本試驗(yàn)采用HCLP法測(cè)定篩選的中藥組方泡騰栓與同樣的中藥組方中主要成分的含量，評(píng)價(jià)制備中藥泡騰栓劑主要成分在制作過(guò)程的有效性，以及評(píng)價(jià)中藥泡騰栓的質(zhì)量，為治療奶牛子宮內(nèi)膜炎中藥栓劑的研發(fā)和生產(chǎn)提供參考依據(jù)。

[1] 王洪海，王國(guó)卿，郭夢(mèng)堯，等.中草藥治療奶牛子宮內(nèi)膜炎研究進(jìn)展[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志，2010，46(8)：64-66.

[2] 趙樹(shù)臣，李佳劉景輝，等．治療奶牛子宮內(nèi)膜炎溶菌酶泡騰栓的制備[J]．中國(guó)獸醫(yī)雜志，2010，46(5)：69-71．

[3] 潘秋亮， 趙樹(shù)臣， 侯振中.治療奶牛子宮內(nèi)膜炎中藥泡騰栓的篩選及研制[J]，中國(guó)獸醫(yī)雜志，2016，52(6)：111-114.

[4] 費(fèi)揚(yáng)，趙亮，張海，等．高效液相色譜法測(cè)定抗菌消炎片中綠原酸、黃芩苷、黃芩素和大黃酚的含量[J]．第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，10：1191-1194．

[5] 國(guó)家藥典委員會(huì)．中華人民共和國(guó)藥典[M]．2010版二部．

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0529-6005(2017)08-0094-03

2016-11-15

黑龍江省應(yīng)用技術(shù)研究與開(kāi)發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(GZ13B005)；東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物普通疾病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題

趙樹(shù)臣(1976-)，男，副教授，博士，主要從事動(dòng)物生殖內(nèi)分泌和生殖毒理學(xué)研究，E-mail：zscrichard@163.com