闞 威，蔡金山，趙全邦 ，沈艷麗，馬占全，胡廣衛(wèi) 李 靜，王小紅，才 華

(1．青海省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 ， 青海 西寧 810000 ； 2．青海省貴南縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 ， 青海 貴南 813100 ；3．青海省澤庫(kù)縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 ， 青海 澤庫(kù) 811400)

棘球蚴基因工程亞單位疫苗免疫綿羊的效果研究

闞 威1，蔡金山1，趙全邦1，沈艷麗1，馬占全1，胡廣衛(wèi)1李 靜1，王小紅2，才 華3

(1．青海省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 ， 青海 西寧 810000 ； 2．青海省貴南縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 ， 青海 貴南 813100 ；3．青海省澤庫(kù)縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 ， 青海 澤庫(kù) 811400)

采用羊棘球蚴基因工程亞單位疫苗對(duì)2 315只3～20月齡藏系綿羊進(jìn)行3次免疫試驗(yàn)，并用間接ELISA對(duì)免疫后的抗體進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。檢測(cè)結(jié)果顯示,首免前、首免1周后、二免1周后、二免1年后、三免1周后、三免后6個(gè)月的血清抗體陽(yáng)性率依次為0%、98.75%、94.94%、40.74 %、98.72%、50%。同時(shí)，對(duì)同齡、同群、同草場(chǎng)放牧的羊三免1年后進(jìn)行剖檢，免疫組59只、對(duì)照組60只。結(jié)果顯示，對(duì)照組感染率、感染強(qiáng)度為86.67%和3.43，免疫組感染率、感染強(qiáng)度為45.76%和0.86，免疫保護(hù)率(減囊率)為69.38%。

棘球蚴病 ； 棘球蚴基因工程亞單位疫苗 ； 免疫研究

棘球蚴病(Echinoccosis)俗稱(chēng)包蟲(chóng)病(Hydatidosis),是一種人獸共患寄生蟲(chóng)病。據(jù)調(diào)查，在我國(guó)西北畜牧業(yè)發(fā)達(dá)地區(qū)的人群血清陽(yáng)性率為1.06%～32%，患病率為1.0%～7.64%[1]，而我國(guó)動(dòng)物感染棘球蚴病每年造成的畜產(chǎn)品經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)8億元以上[2]。青海省是我國(guó)棘球蚴病高發(fā)流行區(qū)，家畜和人的感染率位居全國(guó)前列。2006年，王虎等[3]調(diào)查顯示，1995-2005年青海省人與動(dòng)物棘球蚴病血清陽(yáng)性率和患病率逐年升高，而動(dòng)物棘球蚴的血清陽(yáng)性率和患病率以果洛、玉樹(shù)、黃南三州最高，海南、海北兩州次之，海東、西寧及柴達(dá)木盆地的海西州較低。2000年，蔡金山[4]等對(duì)青海省牛、羊棘球蚴病流行情況就有調(diào)查研究，其調(diào)查結(jié)果顯示，在青海省稱(chēng)多、甘德、澤庫(kù)、德令哈、貴南5縣(市)羊棘球蚴感染率為53.14%，平均感染強(qiáng)度為4.41，牛棘球蚴感染率60.36%，平均感染強(qiáng)度5.59。2010年對(duì)貴南、稱(chēng)多、德令哈3個(gè)縣(市)羊棘球蚴平均感染率為39.02%，平均感染強(qiáng)度2.4，牛棘球蚴平均感染率為33.12%，平均感染強(qiáng)度1.3?？傊畮啄?，青海省人群和動(dòng)物都患有或感染不同程度的棘球蚴病，防治工作刻不容緩。本試驗(yàn)旨在研究羊棘球蚴病基因工程亞單位疫苗對(duì)藏系綿羊的免疫效果，為在藏系綿羊使用該疫苗提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 免疫疫苗 羊棘球蚴(包蟲(chóng))病基因工程亞單位疫苗：由重慶澳龍生物制品有限公司生產(chǎn)。疫苗生產(chǎn)批號(hào)：20121001。

1.2 試驗(yàn)羊的篩選及免疫方法 結(jié)合近幾年青海省棘球蚴病流行病學(xué)調(diào)查報(bào)告，綜合分析選擇貴南縣森多鄉(xiāng)和澤庫(kù)縣和日鄉(xiāng)部分牧戶飼養(yǎng)的6周齡左右的新生羔羊進(jìn)行免疫頸部皮下注射，并雙耳標(biāo)標(biāo)識(shí)。同時(shí)，在各試驗(yàn)羊群設(shè)等數(shù)量、同齡、同草場(chǎng)放牧的羊作為對(duì)照組。試驗(yàn)組羊共免疫3次，首免：6周齡第1次免疫；二免：首免4周后加強(qiáng)免疫1次；三免：首次免疫1年后再加強(qiáng)免疫1次。每次免疫后觀察7 d，通過(guò)對(duì)羊只的體溫、呼吸頻率、運(yùn)動(dòng)狀況、采食情況和注射部位的感官變化對(duì)疫苗的安全性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.3 抗體檢測(cè)時(shí)間 分別在首次免疫前、首免后1周后、二免1周后、二免1年后、三免1周后、三免后6個(gè)月采集試驗(yàn)羊血樣，檢測(cè)血清抗體，共檢測(cè)血清892份。

1.4 免疫抗體檢測(cè) 應(yīng)用重慶澳龍生物制品有限公司生產(chǎn)的羊棘球蚴(包蟲(chóng))ELISA抗體檢測(cè)試劑盒(生產(chǎn)批號(hào)：20141101)進(jìn)行血清抗體檢測(cè)。主要操作程序：抗原包被-封閉，37 ℃，溫育60 min-洗板-加兔抗羊酶標(biāo)抗體-封閉，37 ℃，溫育60 min-洗板-加底物顯色-終止反應(yīng)-用酶標(biāo)儀450 nm測(cè)定OD值。判定標(biāo)準(zhǔn)：樣品450 nm>0.6，判為陽(yáng)性。

1.5 免疫保護(hù)效果的檢驗(yàn) 三免6個(gè)月后剖檢免疫組和對(duì)照組羊共159只，其中澤庫(kù)縣對(duì)照組30只、免疫組29只，貴南縣對(duì)照組30只、免疫組30只。按寄生蟲(chóng)檢查法取其肝、肺、腎、脾和心臟進(jìn)行剖檢， 記錄每只羊感染棘球蚴包囊的數(shù)量、包囊大小，分別計(jì)算棘球蚴的感染率、感染強(qiáng)度，免疫保護(hù)率(減囊率)=(1-免疫組平均包囊數(shù)/對(duì)照組平均包囊數(shù))×100%。

2 結(jié)果

2.1 疫苗的安全性 本試驗(yàn)前后共進(jìn)行3次免疫， 共免疫2～20月齡羊2 315只。在疫苗使用過(guò)程中，加入滅菌生理鹽水后溶解度好，呈均勻混濁。每次注射疫苗后觀察7 d，羊體溫、呼吸頻率、運(yùn)動(dòng)狀況和采食情況均正常，免疫7 d后觸摸注射部位無(wú)異常感覺(jué)，使用該疫苗免疫羊群后未出現(xiàn)不適反應(yīng)，疫苗安全性高。

2.2 ELISA免疫抗體檢測(cè)結(jié)果 對(duì)首次免疫前、首免1周后、二免1周后、二免1年后、三免1周后、三免后6個(gè)月采集的892份血清樣品進(jìn)行抗體檢測(cè)，結(jié)果顯示，2個(gè)縣首免前血清抗體平均陽(yáng)性率為14.04%，首免后1周抗體平均陽(yáng)性率98.75%，二免后1周陽(yáng)性率為94.94%，二免1年后陽(yáng)性率40.74%，三免1周后陽(yáng)性率98.72%，三免6個(gè)月后陽(yáng)性率為50%(表1、圖1)。

表1 ELISA免疫抗體檢測(cè)結(jié)果

圖1 ELISA免疫抗體檢測(cè)結(jié)果

2.3 血清OD值測(cè)定結(jié)果 通過(guò)ELISA法檢測(cè)定期采集的血清，按相應(yīng)的免疫階段和血清抗體OD吸收值進(jìn)行匯總統(tǒng)計(jì)，免疫組羊首免前、首免1周后、二免1周后、二免1年后、三免1周后、三免6月后血清抗體OD吸收值有明顯的變化，其OD值與免疫羊特異性抗體呈正相關(guān)水平。從每個(gè)階段免疫羊特異性抗體的動(dòng)態(tài)變化可以看出，用棘球蚴基因工程亞單位疫苗二免1周后和三免1周后血清抗體水平顯著升高，二免1年后、三免6個(gè)月后血清抗體OD吸收值為0.592和0.403，說(shuō)明免疫羊群經(jīng)兩次免疫一年后抗體水平開(kāi)始下降(表2、圖2)，但是抗體水平依然維持在較高水平。

2.4 感染率和感染強(qiáng)度變化 在貴南和澤庫(kù)縣對(duì)三免后6個(gè)月的羊和對(duì)照組的羊進(jìn)行剖檢，共剖檢了119只羊，免疫羊59只、對(duì)照羊60只。結(jié)果，澤庫(kù)縣30只對(duì)照羊中有26只羊感染有不同發(fā)育程度的包蟲(chóng)囊，感染率為86.67%，感染強(qiáng)度為3.36；29只免疫羊中有12只羊感染有發(fā)育程度較低的包蟲(chóng)囊，感染率為41.38%，感染強(qiáng)度為0.52。貴南縣30只對(duì)照羊中有26只感染有不同發(fā)育程度的包蟲(chóng)囊，感染率為86.67%，感染強(qiáng)度為3.50，30只免疫羊中有15只羊感染有發(fā)育程度較低的包蟲(chóng)囊，感染率為50.00%，感染強(qiáng)度為1.2。兩縣合計(jì)，對(duì)照組平均感染率為86.67%、感染強(qiáng)度為3.43，荷囊數(shù)為0～19 個(gè)不等，荷囊數(shù)最多的達(dá)19個(gè)，包囊直徑最大達(dá)20 mm；免疫組平均感染率為45.76%、感染強(qiáng)度為0.86，荷囊數(shù)為0～12個(gè)不等，最多的12個(gè)，包囊直徑最大的12 mm(表2)，免疫保護(hù)率(減囊率)為69.38%。

表2 免疫組羊血清抗體OD平均吸收值

圖2 免疫組羊血清抗體OD吸收值變化

表3 剖檢統(tǒng)計(jì)結(jié)果

3 討論與小結(jié)

在較長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)，經(jīng)國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究證實(shí)，細(xì)粒棘球蚴絳蟲(chóng)六鉤蚴階段具有良好的免疫保護(hù)效果，就針對(duì)六鉤蚴階段分泌物(ES)抗原，Osborn等(1982)[5]、朱興全等(1991)[6]、哈江等(1994)[7]對(duì)羔羊進(jìn)行免疫研究，研究結(jié)果顯示，該分泌物抗原對(duì)羔羊免疫后均可獲得十分理想的免疫保護(hù)效果，其免疫保護(hù)率分別為99.4%、96.04%和97.3%，Heath等[8](1996)對(duì)細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)六鉤蚴階段的分泌物抗原分析發(fā)現(xiàn)，其中23～25 kD 的蛋白(Eg95)成分為特異性保護(hù)抗原，并通過(guò)免疫試驗(yàn)證實(shí)，羔羊可獲得93%的保護(hù)效果。因此，利用基因工程技術(shù)研制的以Eg95 重組蛋白為主要成份的疫苗，是目前世界上惟一用于預(yù)防羊棘球蚴的疫苗， 該疫苗在新西蘭、澳大利亞、阿根廷等國(guó)的綿羊免疫試驗(yàn)表明，對(duì)不同棘球絳蟲(chóng)蟲(chóng)株的感染具有很好的免疫保護(hù)作用。

本次試驗(yàn)所用疫苗由重慶澳龍生物制品有限公司生產(chǎn)，其主要成分是Eg95 重組蛋白，對(duì)藏羊免疫一年后血清抗體陽(yáng)性率達(dá)到94.94%，一年內(nèi)免疫保護(hù)率為100%，第二年的免疫保護(hù)率達(dá)到69.38%，與前述報(bào)道結(jié)果一致，對(duì)藏羊棘球絳蟲(chóng)的感染具有較好的免疫保護(hù)作用，達(dá)到了通過(guò)對(duì)羊進(jìn)行免疫降低棘球蚴感染率和感染強(qiáng)度下降的目的。雖然第二年測(cè)得的直接減囊保護(hù)率為69.38%，按照實(shí)際荷囊數(shù)、包囊大小和育囊不育囊所占的比例分析，實(shí)際保護(hù)率遠(yuǎn)高于69.38%。為便于推廣棘球蚴(包蟲(chóng))病基因工程亞單位疫苗應(yīng)用，建議采取3次免疫的免疫程序，對(duì)新生羊羔6周齡首免，間隔期1個(gè)月二免，第2年三免。

[1] Current on Chinese significance parasitosis by Department of Health to issue[C].MOH web， 2005:5：17.

[2] Extended review onechinocciasisprevalence in our country[J].Chines Journal of Epidemiology，2006，2:14-127.

[3] 王虎,張靜宵,Schantz P M,等. 1995-2005年青海省棘球蚴病流行病學(xué)調(diào)查分析[J] .中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào),2006,22(12):1 129-1 134.

[4] 蔡金山,馬睿麟,李連芳,等. 青海省牛、羊棘球蚴病流行病學(xué)調(diào)查[J].中國(guó)動(dòng)物檢疫,2013,30(1):46-47.

[5] Osborn P J ,Heath D D.Immunisation of lambs against Echinococcus granulosus using antigens obtained by incubation of oncospheres in vitro[J]. Res Vet Sci,1982, 33 :132-133.

[6] 朱興全,竇蘭清,史曉紅,等.細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)排泄分泌抗原研究-六鉤蚴排泄分泌抗原的原性[J].中國(guó)獸醫(yī)科技,1991,21(9):6-9.

[7] 哈江,吐?tīng)柡?張壯志,等.棘球蚴(包蟲(chóng))病的預(yù)防研究[J].草食家畜,1994,(增刊):28-31.

[8] Heath D D,Lawrence S B .Antigenic polypeptides of Echinococcus granulosus oncosphercs and definition of protective molecules[J].Parasite Immunology,1996, 18:347-357.

TheprophylacticeffectoftheSheepRecombinantHydatidsSubunitvaccineonhydatiddisease

KAN Wei1, CAI Jin-shan1, ZHAO Quan-bang1, SHEN Yan-li1, MA Zhan-quan1, HU Guang-wei1, LI Jing1, WANG Xiao-hong2, CAI Hua3

(1.Animal Disease Prevention and Control Center of Qinghai Province, Xining 810003, China ;2.Animal Disease Prevention and Control Center of GuiNan Country, Guinan 813100，China ;3. Animal Disease Prevention and Control Center of ZeKu Country, Zeku 811400，China)

This study aims to establish three immune experiments for 2315 Tibetan sheep about 3 ～ 20 months in Zeku and Guinan county of Qinghai province by using the Sheep Recombinant Hydatids Subunit vaccine, and the antibody was analyzed by Indirect ELISA dynamic monitoring. The results showed that the positive rate of primary immunization、primary immunization after a week、booster immunization after a week，booster immunization after a year,he third immune after a week and the third immune after six months serum antibody was 0,98.75%,94.94%,40.74 %,98.72% and 50%. At the same time , 59 sheep were selected from the same age, the same group, and the same free grazing pastures sheep for autopsy 1 years later the third immune, and the control number was 60. The results showed that infection rate and infection intensity of the control group were 86.67% and 3.43, infection rate and infection intensity of the immunized group was 45.76% and 0.86, and immune protection ratio was 69.38%.

Hydatid disease ; Recombinant Hydatids Subunit vaccine ; Immune research

CAI Jin-shan

S852.73+2

A

0529-6005(2017)08-0010-03

2016-11-21

中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心“棘球蚴病綜合防控技術(shù)集成與示范項(xiàng)目”

闞威(1986-)，男，獸醫(yī)師，碩士，從事動(dòng)物防疫工作，E-mail：Kanweid@163.com

蔡金山，E-mail：cjshlyf@163.com