丁 劍 ， 馬 勛 ， 陳 朔 ， 曹樹珠 ， 王貝貝 ， 杜冬冬 ， 張奇文

(石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 ， 新疆 石河子 832000)

食源性單增李斯特菌LPXTG蛋白基因的檢測(cè)

丁 劍 ， 馬 勛 ， 陳 朔 ， 曹樹珠 ， 王貝貝 ， 杜冬冬 ， 張奇文

(石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 ， 新疆 石河子 832000)

單核細(xì)胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes，LM)作為四大重要食源性病原菌之一，對(duì)人類及多種畜禽健康威脅極大。LM細(xì)胞胞壁表面分布多種毒力蛋白，在感染機(jī)體過程中發(fā)揮重要作用，其中有一類至關(guān)重要的表面蛋白其C末端含有保守基序LPXTG，分選酶A能夠識(shí)別基序LPXTG，共價(jià)結(jié)合到肽聚糖上，呈現(xiàn)在細(xì)胞表面發(fā)揮毒力作用。本試驗(yàn)以不同食品中分離得到的24株單增李斯特菌為試驗(yàn)對(duì)象，設(shè)計(jì)合成了41對(duì)預(yù)測(cè)含LPXTG基序表面蛋白的引物，利用PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增，凝膠電泳成像系統(tǒng)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小，計(jì)算24株食品源單增李斯特菌LPXTG基序表面蛋白的攜帶。結(jié)果表明，不同LM分離株LPXTG蛋白基因的攜帶率不同：其中僅有12.5%(3/24)的分離株攜帶率在85%以上；不同LPXTG蛋白基因的檢出率不同，在41個(gè)檢測(cè)對(duì)象中，有8個(gè)基因的檢出率100%，有3個(gè)基因的檢出率不足20%，Lmo1115基因在所有分離株中均未檢測(cè)到。本研究對(duì)了解食品源LM分離株的LPXTG蛋白基因的分布以及探明食品源LM的致病性具有重要意義。

單核細(xì)胞增多性李斯特菌 ； LPXTG基序表面蛋白 ； PCR

單核細(xì)胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes, LM)是一種胞內(nèi)寄生的革蘭陽(yáng)性菌，重要的食源性人獸共患病原菌之一[1]，可引起人和多種動(dòng)物的胃腸炎、腦膜炎、敗血癥、流產(chǎn)等[2]。該菌在 4 ℃的環(huán)境中仍可生長(zhǎng)繁殖，可以通過污染奶及奶制品、蔬菜、水產(chǎn)品、肉制品等食物導(dǎo)致人群感染，是冷藏食品中威脅人類健康的主要病原菌之一[3]。該菌分布范圍極廣，環(huán)境耐受性較強(qiáng)。大多數(shù)發(fā)達(dá)國(guó)家人類李斯特菌病發(fā)生率約為每100萬(wàn)人2～15例，死亡率為20%～30%[4]，給人及動(dòng)物的健康帶來嚴(yán)重的危害。

在LM細(xì)胞胞壁的表面分布著多種發(fā)揮重要作用的表面蛋白，這些蛋白在感染機(jī)體和適應(yīng)環(huán)境的過程中發(fā)揮著重要作用。其中有一類至關(guān)重要的表面蛋白，其前體蛋白C端含有保守基序LPXTG，目前研究表明，這類蛋白由分選酶SrtA通過識(shí)別 LPXTG保守基序，將蛋白共價(jià)結(jié)合到細(xì)胞壁肽聚糖上，呈現(xiàn)在細(xì)胞表面發(fā)揮重要毒力作用。 本研究以不同食品中分離得到的24株單增李斯特菌為試驗(yàn)對(duì)象，設(shè)計(jì)合成了41對(duì)預(yù)測(cè)含LPXTG基序表面蛋白的引物，利用PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增，凝膠電泳成像系統(tǒng)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小，計(jì)算24株食品源單增李斯特菌LPXTG基序表面蛋白的攜帶率。

1 材料與方法

1.1 菌株 24株食品源單增李斯特菌均分離自新疆各師局2014-2015年送檢的食品。其中LM6072小、LM6072大和LM6008分離自熟肉制品；LM2947和LM2956分離自調(diào)理雞柳；LM5470、LM5563、LM5570、LM5567、LM5573、LM3103-1、LM5474、LM3189、LM3197和LM3195分離自調(diào)理肉制品；LM3251、LM2941、LM4786、LM4788、LM502、LM2935和LM502-2分離自調(diào)理肉制品冷凍魚糜制品；LM461和LM472分離自外賣配送的盒飯。

1.2 引物 部分引物設(shè)計(jì)參照Mariscotti J F等[5]所提供的，具體如下(表1)。

1.3 主要試劑與儀器 PCR Mix、ddH2O、DL-2 000 DNA Marker，均購(gòu)自廣州東盛生物科技有限公司；腦心浸液培養(yǎng)基(BHI)，購(gòu)自青島高科技園海博生物技術(shù)有限公司；PCR儀(Bio-Rad MyCycler thermal)；電泳系統(tǒng)和凝膠成像系統(tǒng)(BIO-RAD-2000，美國(guó))。

2 方法

2.1 菌種活化 將菌株從-80 ℃保存的甘油管接種于BHI平板，37 ℃培養(yǎng)24 h。

2.2 PCR反應(yīng)體系和參數(shù) PCR擴(kuò)增體系：菌液2 μL；上下游引物各1 μL；2×PCR Mix 10 μL，然后加ddH2O至體積20 μL。

PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸1 min；35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳：瓊脂糖凝膠加EB染色后電泳，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物及2 000 Marker，上樣10 μL；電壓110 V，電流60 mA，20 min后觀察電泳結(jié)果，并對(duì)其進(jìn)行分析。

3 結(jié)果

PCR擴(kuò)增后經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠在TBE電泳緩沖液中進(jìn)行電泳，與DS 2000相比，目的片段均與所有預(yù)期片段一致。

不同LPXTG蛋白基因的檢出率也不同，在檢測(cè)的基因中有inlA、inlJ、Lmo1413、inlH、Lmo0331、Lmo0610、Lmo1799、Lmo2085的檢出率為100%。lmo0801、Lmo0435，Lmo2026的檢出率不到20%。而Lmo1115蛋白在所有分離株中均未檢測(cè)到(表1)。

不同LM分離株LPXTG蛋白基因的攜帶率不同。攜帶率最高為95.1%(39/41)，攜帶率最低為56.1%(23/41)；攜帶率在85%以上的分離株有3株，均為調(diào)理肉制品分離株；攜帶率在76%～85%之間的分離株有9株，其中4株是調(diào)理肉制品分離株，4株是冷凍魚糜分離株，1株是調(diào)理雞翅分離株；攜帶率在66%～75%之間的分離株有3株，分屬熟肉制品、調(diào)理雞柳和冷凍魚糜制品；攜帶率在65%以下的分離株有9株，其中3株調(diào)理肉制品分離株，2株是冷凍魚糜分離株，2株是熟肉制品分離株和2株盒飯分離株(表2)。

4 討論

單增李斯特菌的表面蛋白比其他G+菌的表面蛋白都要豐富。當(dāng)表面蛋白其C末端含有保守基序LPXTG，分選酶A能夠識(shí)別基序LPXTG，共價(jià)結(jié)合到肽聚糖上，呈現(xiàn)在細(xì)胞表面發(fā)揮毒力作用。根據(jù)EDG-e株全基因組序列，發(fā)現(xiàn)41個(gè)帶有LPXTG基序的單增李斯特菌蛋白，其中19個(gè)蛋白同時(shí)具有LRR區(qū)[6]。研究比較清楚的有Lmo0262(InlG)、Lmo0263(InlH)、Lmo0433(InlA)、InlJ、Lmo0327、Lmo0610、Lmo0842和Lmo1413等，研究結(jié)果表明，這些表面蛋白與毒力有關(guān)[7-9]。

24株食品源LM分離株LPXTG蛋白基因的攜帶率不同。其中調(diào)理肉制品分離株的攜帶率普遍較高，而熟肉制品和盒飯分離株的攜帶率普遍偏低，這是否與食品加工環(huán)節(jié)溫度有關(guān)，另外不同LPXTG蛋白基因的檢出率也不同，這與菌株的致病性是否密切相關(guān)都需要進(jìn)一步的研究。

表1 41個(gè)LPXTG基序表面蛋白引物序列及檢出率

表2 24株食品源單增李斯特菌LPXTG基序蛋白基因統(tǒng)計(jì)

“+”：有 ； “-”：無(wú)

基因名稱菌株編號(hào)LM6072小LM6072大LM3251LM2941LM502-2LM2956LM5470LM4786LM5563LM5570LM3103-1LM6008lmo2026--+---------lmo2396+-+---+--++-inlJ++++++++++++lmo0171+-++-+++-++-lmo0732+-++-+++-++-lmo0175++++++++-+++lmo0327+-----+--++-inlI++-+++++++++lmo0835+++++++-++++lmo1413++++++++++++lmo2178++++++++++++lmo2179-+++++++++++lmo0130+++++++++++-lmo0159++++++++-++-lmo0160++++++++++++inlH++++++++++++lmo0320---+-+-++--+lmo0331++++++++++++lmo0435-----+------lmo0463-+-+++-++-++lmo0514-+++++++-+++lmo0550+-++++++++++lmo0610++++++++++++lmo0627+-++-+++-++-lmo0725+++++++-++++lmo0801--+--+------lmo0842+-+---+-+++-lmo0880-++++-++++++lmo1115------------lmo1136+-++-+++-++-lmo1289---+-+-+----lmo1290-+++++++-+++lmo1666+++++++-++++lmo1799++++++++++++lmo2085++++++++++++lmo2576+-++-++++++-lmo2714++-++++-++++inlA++++++++++++inlE--++--++-++-inlF+-+++-++-++-inlG+-+---+--++-攜帶率/%70．756．180．580．561．078．082．970．756．182．985．456．1

“+”：有 ； “-”：無(wú)

目前，由LM引起的食物中毒越來越多。自1926年首次分離到本病病原后，李氏桿菌病現(xiàn)已呈世界性分布。近年來因食品污染本菌而引起的食物中毒病例頻繁發(fā)生，使李氏桿菌病作為一種重要的食源性傳染病在世界范圍內(nèi)對(duì)食品安全及人類健康造成極大的危害[10]。我國(guó)近年來將食品中單增李斯特菌的污染檢測(cè)作為一項(xiàng)必檢的安全指標(biāo)，WHO 將單增李斯特菌列為20世紀(jì)90年代食品中四大病原菌(致病性大腸桿菌、嗜水氣單胞菌、肉毒梭菌)之一[11]。本試驗(yàn)采用PCR檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)了食品源LM分離株的LPXTG蛋白基因，為探明食品源LM的致病性有著重要的意義。

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DetectionofLPXTGproteingenesinFood-borneListeriamonocytogenes

DING Jian, MA Xun, CHEN Shuo, CAO Shu-zhu, WANG Bei-bei, DU Dong-dong , ZHANG Qi-wen

(Shihezi University School of Animal Science and Technology,Shihezi 832000, China)

Listeria monocytogenes (Lm) is well known as one of the most important foodborne pathogens, posing a great threat to the health of human and various livestock and poultry. Lm has a variety of virulence-associated proteins that are closely involved in the pathogenicity. One type of the surface proteins which have a conserved LPXTG motif at COOH-terminal cell can be cleaved by sortase and anchored peptidoglycan to present on the cell surface to play a role in virulence. Twenty-four food-borne Lm strains were isolated from different foods. Forty-one primers were designed and synthesized for putative LPXTG surface proteins. The geges were detected by PCR and gel electrophoresis imaging system. The results showed that the rate of carrying LPXTG protein genes in different LM isolates was different. And 12.5% Lm isolates(3/24)carried more than 85% LPXTG protein genes.The detection rate of LPXTG protein genes was different. Among the 41 LPXTG protein genes, only 7 genes were 100% detected ; 3 genes were under 20%; the Lmo1115 gene was not detected. It is of importance for studying the pathogenicity of food-borne Lm to test the distribution of LPXTG motif surface proteins.

Listeriamonocytogenes; LPXTG motif surface protein ; PCR

MA Xun

R378

A

0529-6005(2017)08-0017-05

2016-12-02

國(guó)家自然科學(xué)基金(31360614)

丁劍(1991-)，女，碩士生，研究方向?yàn)閯?dòng)物傳染病的診斷與防治，E-mail:598283567@qq.com

馬勛，E-mail:maxun779@126.com