田萬年 ， 薛書江 ， 賈立軍 ， 張守發(fā)， 李國江

(1.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，吉林 吉林 132101；2. 預(yù)防獸醫(yī)學(xué)吉林省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 吉林 132101；3. 延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002)

延邊地區(qū)牛卵形巴貝斯蟲病的分子流行病學(xué)調(diào)查

田萬年1,2， 薛書江3， 賈立軍3， 張守發(fā)3， 李國江1,2

(1.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，吉林 吉林 132101；2. 預(yù)防獸醫(yī)學(xué)吉林省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 吉林 132101；3. 延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002)

為了解牛卵形巴貝斯蟲病在吉林省延邊地區(qū)流行情況，本試驗(yàn)應(yīng)用PCR方法對琿春地區(qū)190份牛的血液樣本進(jìn)行牛巴貝斯蟲病的分子流行病學(xué)調(diào)查，并與血液涂片染色鏡檢法進(jìn)行了比較。結(jié)果該地區(qū)牛巴貝斯蟲病的PCR方法檢測陽性率為30.52%，而血涂片染色鏡檢法的陽性率為11.05%。不同地區(qū)和不同飼養(yǎng)方式間牛卵形巴貝斯蟲感染率差異顯著(P<0.05)。遺傳進(jìn)化分析顯示，吉林省延邊地區(qū)牛卵形巴貝斯蟲與日本分離株處于同一分支，而區(qū)別于河南和韓國分離株。調(diào)查表明，吉林省延邊地區(qū)是牛卵形巴貝斯蟲病的流行地區(qū)。

卵形巴貝斯蟲 ； PCR ； 血液涂片鏡檢法 ； 分子流行病學(xué)調(diào)查

牛的卵形巴貝斯蟲病(Babesia ovata)是由巴貝斯科巴貝斯屬的卵形巴貝斯蟲寄生于牛紅細(xì)胞內(nèi)所引起的寄生蟲病[1]。病牛多表現(xiàn)為高熱、貧血、黃疸和血紅蛋白尿，多引起死亡[2-3]。我國于1986年在河南省盧氏縣牛體內(nèi)發(fā)現(xiàn)本病，隨后1994年，在甘肅張家川回族自治縣牛體內(nèi)分離到卵形巴貝斯蟲[4]。目前國內(nèi)對牛卵形巴貝斯蟲研究報(bào)道較少，羅建勛等[5]對牛的巴貝斯蟲18S rRNA基因序列進(jìn)行了比較研究，動(dòng)物感染方式采用人工感染，有關(guān)自然感染條件下牛卵形巴貝斯蟲分子分類學(xué)研究尚未見報(bào)道。本試驗(yàn)通過對吉林省延邊地區(qū)自然感染的牛卵形巴貝斯蟲病進(jìn)行分子流行病學(xué)調(diào)查，并進(jìn)行卵形巴貝斯蟲的分類鑒定，為吉林省延邊地區(qū)牛卵形巴貝斯蟲病的防治提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本來源 血液樣本采自吉林省延邊州琿春80份、汪清45份、安圖30份和敦化35份4個(gè)地區(qū)共190份?？鼓瑫r(shí)制作血液涂片，供染色鏡檢。

1.2 主要試劑 全血DNA提取試劑盒、TaqDNA聚合酶、dNTP、Agarose Gel DNA Extraction Kit、DL-2000 DNA Marker等，均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 血液樣本PCR檢測

1.3.1 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank上登錄的牛卵形巴貝斯蟲18S rRNA基因序列(AY081192)，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)了1對引物。引物P1: 5′-ATTTCAGCCCTTTGGCTTTTCC-3′, P2: 5′-TAGGAGCGACGGGCGGTGTGTA-3′，擴(kuò)增預(yù)期片段大小為954 bp。引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。

1.3.2 牛卵形巴貝斯蟲DNA標(biāo)準(zhǔn)模板的制備 按照全血基因組DNA提取試劑盒說明書操作提取基因組DNA，抽提的DNA用50 μL TE溶解，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 PCR反應(yīng)條件 以提取的牛卵形巴貝斯蟲DNA為模板，PCR反應(yīng)條件如下：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4 卵形巴貝斯蟲18S rRNA基因克隆及序列分析 卵形巴貝斯蟲18S rRNA基因PCR陽性樣品經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，進(jìn)行切膠回收、純化，純化后送往寶生物工程(大連)有限公司進(jìn)行序列測定。測序結(jié)果與GenBank中登錄的卵形巴貝斯蟲、巴貝斯蟲和瑟氏泰勒蟲18S rRNA基因序列為基礎(chǔ)，建立卵形巴貝斯蟲的系統(tǒng)進(jìn)化樹。序列依次為牛卵形巴貝斯蟲(LC125457、AY081192、AY603402、AY603401)、牛巴貝斯蟲(HQ264111、AY603398)、牛雙芽巴貝斯蟲(AY603400、KM046917)。瑟氏泰勒蟲(TQ723015、EU083803、EU083804、AB016074)、環(huán)形泰勒蟲(AY260172、EU083801)。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 運(yùn)用SPSS 19.0 軟件對190份PCR檢測樣本分別進(jìn)行不同區(qū)域、不同飼養(yǎng)方式和不同年齡進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 血液涂片染色鏡檢結(jié)果 190份血涂片經(jīng)姬姆薩染色鏡檢，有21份為陽性，陽性率11.05%。血液涂片姬姆薩染色鏡檢結(jié)果見圖1。

圖1 血液涂片姬姆薩染色鏡檢結(jié)果

2.2 PCR檢測 190份血液樣本經(jīng)PCR檢測，經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，出現(xiàn)954 bp的特異性DNA條帶(見圖2)，陽性率為30.52%。

圖2 部分血液樣本PCR檢測結(jié)果

M：DL-2 000 DNA Marker； 1～19：被檢血液樣本PCR產(chǎn)物； 20：空白對照

2.3 不同地區(qū)牛感染卵形巴貝斯蟲情況 采用PCR方法對分別采自琿春、汪清、安圖和敦化4個(gè)地區(qū)的190份血液樣本進(jìn)行牛卵形巴貝斯蟲感染情況的比較，其結(jié)果見表1。從表1可見，不同地區(qū)牛均可感染卵形巴貝斯蟲病。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，琿春卵形巴貝斯蟲感染率顯著高于其他3個(gè)地區(qū)，差異顯著(P<0.05)。

2.4 不同年齡牛感染卵形巴貝斯蟲情況 將PCR檢測的190份牛血液樣本的檢測結(jié)果，按不同年齡分組進(jìn)行比較，其結(jié)果見表2。

表1 不同地區(qū)牛感染卵形巴貝斯蟲的情況

*：平均感染率

表2 不同年齡牛感染卵形巴貝斯蟲的情況

*：平均感染率

從表2可見，各年齡段的牛均可感染卵形巴貝斯蟲。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，不同年齡段之間牛卵形巴貝斯蟲感染率差異不顯著(P>0.05)。

2.5 不同飼養(yǎng)方式牛感染卵形巴貝斯蟲情況 將PCR檢測的190份牛血液樣本的檢測結(jié)果，按不同飼養(yǎng)方式分組進(jìn)行比較，其結(jié)果見表3。

表3 不同飼養(yǎng)方式牛感染卵形巴貝斯蟲的情況

*：平均感染率

從表3可見，不同飼養(yǎng)方式的牛均感染卵形巴貝斯蟲。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，不同飼養(yǎng)方式牛卵形巴貝斯蟲感染率差異顯著(P<0.05)。

2.6 琿春地區(qū)牛卵形巴貝斯蟲18S rRNA序列分析及遺傳進(jìn)化樹構(gòu)建 將本試驗(yàn)測得牛卵形巴貝斯蟲序列與GenBank登錄的巴貝斯蟲和泰勒蟲序列進(jìn)行對比分析，應(yīng)用DNAMAN軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析(見圖3)。結(jié)果顯示，本次測序獲得吉林琿春地區(qū)牛卵形巴貝斯蟲序列，B.ovataJilin 分離株與日本分離株親緣關(guān)系較近，而區(qū)別于國內(nèi)河南分離株、韓國分離株。牛卵形巴貝斯蟲與雙芽巴貝斯蟲親緣關(guān)系較近，處在同一分支上，與牛巴貝斯蟲親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖3 基于巴貝斯蟲和泰勒蟲18S rRNA基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 討論

目前我國對牛卵形巴貝斯蟲病的診斷主要通過臨床癥狀和血液涂片鏡檢的常規(guī)診斷方法確診本病[6]，但由于染色劑及相似病原體等人為因素影響鏡檢結(jié)果的判定，不適于對該病的早期診斷。牛卵形巴貝斯蟲和瑟氏泰勒蟲在形態(tài)較相似，在顯微鏡下很難進(jìn)行區(qū)別，不能反映動(dòng)物感染的真實(shí)情況[7]。PCR方法是一種特異性強(qiáng)、敏感性高的診斷方法，已廣泛應(yīng)用到梨形蟲病流行病調(diào)查研究[8-9]。本試驗(yàn)采用PCR方法對吉林省190份牛血液樣本進(jìn)行了檢測。調(diào)查結(jié)果顯示，PCR方法陽性率為30.52%，而血液涂片染色鏡檢出的陽性率為11.05%，對PCR檢測的190份血液樣本進(jìn)行了不同地區(qū)、不同年齡及不同飼養(yǎng)方式的比較分析。結(jié)果顯示，不同地區(qū)及不同飼養(yǎng)方式差異顯著，吉林省琿春地區(qū)感染率為43.75%，明顯高于其他地區(qū)(P<0.05)，存在較大差異，可能與地理生態(tài)環(huán)境和跨境交易運(yùn)輸頻率等導(dǎo)致感染率存在差異。放牧牛的感染率為42.86%，顯著高于舍飼20.75%(P<0.05)，分析原因可能為放牧牛與蜱的接觸幾率比舍飼牛高一些。本次調(diào)查結(jié)果顯示，吉林省延邊地區(qū)為牛卵形巴貝斯病流行地區(qū)。

牛的巴貝斯蟲在20世紀(jì)80年代前我國只有牛巴貝斯蟲(B.bovis)和雙芽巴貝斯蟲(B.bigemina)。白啟等從河南牛體內(nèi)分離到一株大型巴貝斯蟲，后經(jīng)證實(shí)為卵形巴貝斯蟲(B.ovata)[10-11]。研究表明牛卵形巴貝斯蟲與牛瑟氏泰勒蟲形態(tài)較相似，均由長角血蜱傳播[6, 12]。目前國內(nèi)有關(guān)牛卵形巴貝斯蟲分子分類學(xué)研究尚未見報(bào)道，本試驗(yàn)通過系統(tǒng)發(fā)育樹的分析發(fā)現(xiàn)，所檢測到的吉林省延邊地區(qū)牛卵形巴貝斯蟲與日本分離株處在同一分支，親緣關(guān)系較近，與河南分離株、韓國分離株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。牛雙芽巴貝斯蟲和牛巴貝斯蟲各自單成一支，說明牛卵形巴貝斯蟲與雙芽巴貝斯蟲、牛巴貝斯蟲在分子生物學(xué)特性上存在明顯區(qū)別。本試驗(yàn)中通過對吉林省延邊地區(qū)牛卵形巴貝斯蟲遺傳進(jìn)化分析，進(jìn)一步豐富了牛卵形巴貝斯蟲分子流行病學(xué)資料。

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MolecularepidemiologicalserveyofBabesiaovatainfectionsincattleinYanbianPrefecture

TIAN Wan-nian1,2, XUE Shu-jiang3, JIA Li-jun3, ZHANG Shou-fa3， LI Guo-jiang1,2

(1.College of Animal Science, Jilin Agricultural Scienceand Technology College, Jilin 132101, China；2.Key Lab of Preventive Veterinary Medicine in Jilin Province, Jilin 132101, China；3.College of Agriculture, Yanbian University, Yanji 133002, China)

In order to study the prevalence ofBabesiaovatainfection in cattle in Yanbian area, a molecular epidemiological survey was conducted to examineBabesiaovatausing PCR. 190 blood samples were analyzed. Results showed that the positive rate of Babesia ovata infection by PCR method was 30.52%, which was significantly higher than 11.05% the positive rate by microscopic examination of Giemsa-stained blood smears. The difference between different counties and grazing was both significant(p<0.05). Phylogenetic analysis indicated thatBabesiaovatain the present study was in the same cluster with the Japan strains, but was separated from Henan or Korea strains. The survey confirmed that Yanbian Prefecture was the epidemic region ofBabesiaovata.

Babesiaovata； PCR ； microscopic examination of Giemsa-stained blood smears ； Molecular epidemiology

s：ZHANG Shou-fa ； LI Guo-jiang

S852.72

A

0529-6005(2017)08-0013-03

2016-11-03.

吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(20150623004TC)；吉林省重點(diǎn)學(xué)科培育項(xiàng)目(吉農(nóng)院合字[2015]第x030號(hào))；吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院種子基金項(xiàng)目(吉農(nóng)院合字[2014]第Z07號(hào))

田萬年(1980-)，男，講師，博士，主要從事動(dòng)物寄生蟲病研究，E-mail:wannian2000@hotmail.com

張守發(fā)，E-mail:shoufazhang@sina.com；李國江，E-mail:illiguojiang@126.com