鐘昌瑞，李玉閩，邱小蘭，闕慶和

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬龍巖市第一醫(yī)院輸血科，福建 龍巖364000)

53份臍帶血干細(xì)胞制備的初探

鐘昌瑞，李玉閩，邱小蘭，闕慶和

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬龍巖市第一醫(yī)院輸血科，福建 龍巖364000)

目的 制備符合臨床治療需求的干細(xì)胞制劑，觀察臍帶血量與提取的細(xì)胞數(shù)之間的關(guān)系。方法 本院產(chǎn)科足月妊娠剖腹產(chǎn)分娩的53例嬰兒胎兒娩出并斷臍后，在清潔狀態(tài)下迅速采集臍帶血于采血袋中，用負(fù)收集法分離提取臍帶血干細(xì)胞。用Sysmex-2100全血細(xì)胞分析儀計數(shù)提取干細(xì)胞懸液的單個核細(xì)胞總數(shù)。結(jié)果 采集的凈臍帶血量為88.9±15.4(70～180)m l，提取干細(xì)胞后的單個核細(xì)胞計數(shù)為3.8±1.73×109[（2.0～6.7）×109]，運用散點圖相關(guān)分析，兩者相關(guān)系數(shù)r為0.82。結(jié)論 提取的單個核細(xì)胞含量隨臍帶血量增加而升高，二者之間呈正相關(guān)（r=0.82）。在日常操作中如果能獲得較多的臍帶血應(yīng)該就能收集到更多的用于移植的細(xì)胞，應(yīng)用這新的造血干細(xì)胞來源，用于任何一個需要移植的病人。

臍血；干細(xì)胞；分離；正相關(guān)

臍帶血（umbilical cord blood，UCB）是產(chǎn)后留存在胎盤和臍帶中的血液，以往被作為醫(yī)學(xué)廢物而丟棄[1]。近十幾年的研究發(fā)現(xiàn)，人臍帶中存在大量間充質(zhì)干細(xì)胞，間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stern cells，MSCs)是成體干細(xì)胞的一種，具有自我更新、高度增殖和多向分化潛能，可以重建人體造血和免疫系統(tǒng)的造血干/祖細(xì)胞，可用于造血干細(xì)胞移植，治療多種疾病[2]。我們采用負(fù)收集混合法，制備了53份臍帶血干細(xì)胞制劑供臨床移植使用，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器人類骨髓、臍帶血干細(xì)胞/祖細(xì)胞體外分離純化試劑盒 （寧夏中聯(lián)達(dá)生物技術(shù)有限公司）。采血袋（四川南格爾生物醫(yī)學(xué)股份有限公司），D5KR低溫離心機(jī)。全自動細(xì)菌培養(yǎng)儀和配套標(biāo)準(zhǔn)的血培養(yǎng)瓶，Sysmex-2100全血細(xì)胞分析儀。分離、純化所用的離心管、移液管一次性無菌產(chǎn)品及0.4%臺盼藍(lán)染液由寧夏中聯(lián)達(dá)生物有限公司提供。蘇凈安泰VS-1300L-U100級的潔凈工作臺、顯微鏡、電動移液器、微量移液器、中科美菱貯血/試劑冰箱。

1.2 供血產(chǎn)婦的選擇供血產(chǎn)婦為本院2011年1月至2016年5月期間產(chǎn)科足月妊娠剖腹產(chǎn)分娩的產(chǎn)婦，排除乙型肝炎、丙型肝炎、艾滋病、梅毒以及其他傳染性疾病，無家族遺傳性疾病和各種急、慢性疾病，妊娠期內(nèi)無嚴(yán)重合并癥。

1.3 臍帶血的采集在產(chǎn)婦及家屬知情并同意捐贈的情況下，用采血袋（CPDA抗凝）封閉式收集第3產(chǎn)程剖宮產(chǎn)的新生兒臍帶血，每袋采臍血 （60～180）ml/例，采集好的臍血迅速送至百級層流細(xì)胞分離實驗室備用。

1.4 臍血干細(xì)胞制備采用負(fù)收集混合法分離提取臍帶血干細(xì)胞。嚴(yán)格按照體外分離純化試劑盒的操作步驟進(jìn)行分離提取，用生理鹽水重復(fù)洗滌3次后，即得干細(xì)胞。每例提取的臍帶血干細(xì)胞以生理鹽水稀釋到100ml制備成干細(xì)胞懸液制劑[3]，立即通過靜脈進(jìn)行干細(xì)胞移植。

1.5 病原微生物的檢測術(shù)前常規(guī)進(jìn)行母體血標(biāo)本的乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）、丙型肝炎抗體（抗-HCV）、人類免疫缺陷病毒抗體（抗-HIV）、梅毒螺旋體（TP）等病原微生物檢測；細(xì)菌學(xué)檢查：取干細(xì)胞制備的上清液10ml（末次離心），用全自動細(xì)菌培養(yǎng)儀和配套標(biāo)準(zhǔn)的血培養(yǎng)瓶進(jìn)行真菌和細(xì)菌檢測，排除干細(xì)胞懸液受污染的可能。上清液在干細(xì)胞懸液的上方，因此，上清液如不受細(xì)菌污染，可以排除干細(xì)胞懸液污染的可能。

1.6 臍血干細(xì)胞含量檢測用Sysmex-2100全血細(xì)胞分析儀的HPC模式，計數(shù)提取干細(xì)胞后單個核細(xì)胞數(shù)[4]。

1.7 細(xì)胞存活率檢測使用0.4%臺盼藍(lán)染色法計數(shù)活細(xì)胞數(shù)目。干細(xì)胞懸液與0.4%臺盼藍(lán)染色液以9：1混合混勻后滴入血球計數(shù)盤內(nèi)，在3min內(nèi)按白細(xì)胞計數(shù)法，分別計數(shù)活細(xì)胞數(shù)和死細(xì)胞數(shù)。統(tǒng)計細(xì)胞存活率=活細(xì)胞數(shù)/（活細(xì)胞數(shù)+死細(xì)胞數(shù)）×100%。

1.8 統(tǒng)計方法運用散點圖相關(guān)分析探討臍帶血量與提取干細(xì)胞后單個核細(xì)胞數(shù)的相互關(guān)系，|r|＞0.95 為顯著相關(guān)，|r|≥0.8 為高度相關(guān)，0.5≤|r|＜0.8為中度相關(guān)，0.3≤|r|0.5為低度相關(guān)，|r|＜0.3為不相關(guān)，r=0為無線性相關(guān)。

2 結(jié)果

2.1 干細(xì)胞制劑安全性檢測53份臍血母體標(biāo)本的病源微生物指標(biāo)檢測全部合格。干細(xì)胞制劑制備的上清液經(jīng)5d的細(xì)菌、真菌培養(yǎng)，均未發(fā)現(xiàn)細(xì)菌、真菌的污染。移植的患者均未發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)及并發(fā)癥，移植后大多數(shù)患者的臨床癥狀明顯改善。

2.2 細(xì)胞數(shù)檢測臍血在手術(shù)當(dāng)天以剖宮產(chǎn)方式取得，采集的凈臍帶血量為88.9±15.4(70～180)ml，提取干細(xì)胞后的單個核細(xì)胞計數(shù)為3.8±1.73×109[（2.0～6.7）×109]， 提取的單個核細(xì)胞含量隨臍帶血量增加而升高，二者之間呈正相關(guān)（r=0.82），具體如圖1所示。

圖1 臍帶血量與單個核細(xì)胞數(shù)的相關(guān)性，且成正相關(guān)，r=0.82。

2.3 干細(xì)胞活力檢測細(xì)胞經(jīng)臺酚藍(lán)染色后，在顯微鏡下可見活細(xì)胞（不著色并保持正常形態(tài)，有光澤），而死細(xì)胞（著淺藍(lán)色并膨大，無光澤）。在鏡下分別計數(shù)活細(xì)胞數(shù)和死細(xì)胞數(shù)，根據(jù)公式計算分離的干細(xì)胞活率為（98.2±0.63%）。

2.4 干細(xì)胞臨床應(yīng)用53例干細(xì)胞主要用于血液性疾病，風(fēng)濕性疾病，股骨頭壞死等，詳見圖2。

3 討論

圖2 53例干細(xì)胞臨床應(yīng)用分布

干細(xì)胞是人體及其各種組織細(xì)胞的最初來源，具有高度自我復(fù)制、增殖和多向分化的潛能。干細(xì)胞按其來源分類可以分為外周血干細(xì)胞、骨髓干細(xì)胞和臍帶血干細(xì)胞[5]。與骨髓和外周血相比，臍帶血具有以下優(yōu)點：⑴臍帶血來源廣泛，目前有許多國內(nèi)外的研究表明可以從臍帶的不同部位(臍帶靜脈內(nèi)皮，內(nèi)皮下層，Wharton's jelly，血管及其周圍組織)分離得到MSCs[6]。⑵臍帶血中的干/祖細(xì)胞較成人骨髓中的干/祖細(xì)胞更原始，有更強的增殖分化能力。⑶臍帶血中淋巴細(xì)胞的免疫功能不夠成熟，未接受外界抗原刺激，其免疫原性較弱，移植物抗宿病發(fā)生率低[7]。⑷臍帶血中不會有腫瘤細(xì)胞[8]。⑸臍帶血中間充質(zhì)干細(xì)胞易于分離[9]。有資料顯示，臍帶血干細(xì)胞制劑中主要以MSCs為主，其含量濃度很高[3]。臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞有多向分化潛能，它在體內(nèi)可以分化為骨、軟骨細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞以及神經(jīng)元細(xì)胞等[10]，因而臍帶血干細(xì)胞具有極大的臨床應(yīng)用價值。

臍帶血干細(xì)胞治療在我院作為新技術(shù)新項目引入，主要通過多個科室間的合作完成，我科負(fù)責(zé)臍帶血干細(xì)胞的分離、純化工作。臍帶血干細(xì)胞分離要求在萬級潔凈實驗室里進(jìn)行，臍帶血和試劑移取要求在局部百級潔凈臺內(nèi)操作。臍帶血分離技術(shù)是臍血干細(xì)胞移植的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，關(guān)于臍血干細(xì)胞提取分離方法還沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。因密度梯度離心法分離臍血單個核細(xì)胞有細(xì)胞得率高、方法簡單等優(yōu)點[11]，現(xiàn)作為常用的分離方法。本文采用負(fù)收集混合法分離提取臍帶血干細(xì)胞，提取干細(xì)胞后的單個核細(xì)胞計數(shù)為 3.8±1.73×109[（2.0～6.7）×109]，提取的單個核細(xì)胞含量隨臍帶血量增加而升高，二者之間呈正相關(guān)（r=0.82）；分離的干細(xì)胞活率為 （98.2±0.63%）；53份干細(xì)胞制劑制備的上清液經(jīng)5d的細(xì)菌、真菌培養(yǎng)，均未發(fā)現(xiàn)細(xì)菌、真菌的污染，移植患者均未發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)及并發(fā)癥，移植后大多數(shù)患者的臨床癥狀明顯改善。因臍帶血干細(xì)胞分離需經(jīng)數(shù)次離心并且多次移液，離心力、離心時間、離心次數(shù)及離心溫度等是影響制備效果的因素。離心力過大，離心時間過長或離心次數(shù)過多會增加干細(xì)胞死亡（細(xì)胞膜破裂）。此外，制備干細(xì)胞懸液勿劇烈震蕩，以免造成細(xì)胞破壞。臍血干細(xì)胞移植成功與否受到諸多因素的影響，如病種、年齡、宿主微環(huán)境、藥物干預(yù)等，供者因素中重要的是輸入細(xì)胞量[5]。為了保證臍帶血干細(xì)胞在臨床中更廣泛的應(yīng)用，更好的療效，在日常操作中如果能獲得較多的臍帶血應(yīng)該就能收集到更多的用于移植的細(xì)胞。因此，對操作人員要有規(guī)范系統(tǒng)的教育培訓(xùn)，以具備操作的專業(yè)知識和能力，才能收集到更多質(zhì)量更好的干細(xì)胞。

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R457.1+2，R446.11+1

A

1674-1129(2017)05-0810-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.05.063

李玉閩。

2017-03-09；

2017-06-05)