熊 進，黃魁英，夏楓耿，陳舒潔，胡海艷

（廣州市微生物研究所，廣東廣州 510663）

耐高溫β-甘露聚糖酶畢赤酵母菌M27-8發(fā)酵條件優(yōu)化

熊 進，黃魁英，夏楓耿，陳舒潔，胡海艷*

（廣州市微生物研究所，廣東廣州 510663）

為獲得產(chǎn)β-甘露聚糖酶發(fā)酵最佳條件，本研究以克隆篩選獲得的產(chǎn)耐高溫β-甘露聚糖酶的畢赤酵母菌M27-8菌株為研究對象，對不同氮源含量、葡萄糖含量、pH、發(fā)酵時間、接種量、溫度和轉(zhuǎn)速進行優(yōu)化。結(jié)果表明：最佳產(chǎn)酶條件為6%玉米漿、3%葡萄糖、pH 5.5、發(fā)酵60 h、2%接種量、28℃、225 r/min，最大酶活達到452.7 U/mL，是優(yōu)化前酶活138 U/mL的3.3倍。綜上，此發(fā)酵培養(yǎng)基可用較廉價的玉米漿取代YPD培養(yǎng)基，從而節(jié)省成本，為工業(yè)生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

β-甘露聚糖酶；畢赤酵母；發(fā)酵條件；優(yōu)化

甘露聚糖作為半纖維素的第二大組分（Scheller等，2010；St。albrand等，1993），廣泛存在于木材和各種植物組織中（Kansoh等，2004）。β-甘露聚糖酶能夠水解含有甘露聚糖的有機物，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于飼料、造紙、醫(yī)藥、食品、精細化工等領(lǐng)域（Kansoh 等，2004；Bhat等，2000）。 甘露聚糖酶因在飼料應(yīng)用中對酶的純度要求不高，無需精制純化，通過簡單的發(fā)酵生產(chǎn)并噴霧干燥獲得酶粉，一般就可作為飼料添加物混合使用（Chen等，2005）。在常用飼料原料中半纖維素含量豐富，因其在單胃動物消化道內(nèi)會形成凝膠狀，從而影響畜禽吸收和飼料利用率（Nunes等，1992）。β-甘露聚糖酶可添至飼料中，消除其中甘露聚糖的抗?fàn)I養(yǎng)作用，提高飼料利用率，并且可促進腸道內(nèi)有益菌群的增殖，增強畜禽免疫力（Cerqueira等2011；Zou 等，2006）。

目前許多工業(yè)用酶，要求具有高活性酶的同時，還需要耐熱和耐酸性條件，因此，獲得耐熱性、耐酸性的β-甘露聚糖酶菌株的研究成為熱點。目前，表達耐高溫、耐酸性β-甘露聚糖酶的菌株應(yīng)用到工業(yè)化生產(chǎn)中的不多。本研究對構(gòu)建組成型β-甘露聚糖酶畢赤酵母高效表達體系，篩選的高酶活、耐熱性和耐酸性較強的β-甘露聚糖酶菌株M27-8為研究對象，對培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，提高該菌株的產(chǎn)酶水平，為進一步擴大生產(chǎn)奠定良好基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 蛋白胨（貴州新華生化科技發(fā)展有限公司）、玉米漿干粉（山東康源生物科技有限公司）、酵母提取物（湖北安琪酵母股份有限公司）；葡萄糖、磷酸氫鈉、磷酸氫二鉀、瓊脂等試劑為國產(chǎn)分析純。畢赤酵母菌M27-8（Pichia pastoris M27-8），由廣東省種質(zhì)資源庫提供。

DHZ-DA大容量全溫振蕩器（江蘇省太倉市實驗設(shè)備廠）；752N紫外可見分光光度計（上海精科儀器有限公司）；HR/T20M臺式高速冷凍離心機（湖南赫西儀器裝備有限公司）；XW-80旋渦混合儀 （海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；PHS-3C pH計（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 試劑 PTM1微量元素：CuSO4·5H2O 6.0 g/L、NaI 0.08 g/L、MnSO4·H2O 3.0 g/L、Na2MoO4·2H2O 0.2 g/L、H3BO30.02 g/L、CoCl20.5 g/L、ZnCl220.0 g/L、FeSO4·7H2O 65.0 g/L、 生物素 0.2 g/L、 濃 H2SO45.0 ml/L，過濾除菌。發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵前按照4.0 mL/L比例補充PTM1。

0.5%甘露聚糖溶液（pH5.0）：用pH 5.0磷酸二氫鉀—磷酸氫二鈉緩沖液配制0.5%甘露聚糖底物液。DNS溶液的配置參照農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)DNS試劑的配制。

YPD培養(yǎng)基：酵母提取物10 g/L、蛋白胨20 g/L、葡萄糖10 g/L。

YPDS培養(yǎng)基：酵母提取物10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖10 g/L、瓊脂20 g/L。

BSM培養(yǎng)基：葡萄糖 20 g/L、85%H3PO426.7 mL/L、KOH 4.13 g/L、（NH4）2SO44 g/L、CaCl20.38 g/L、K2SO418.2 g/L、MgSO4·2H2O 14.9 g/L、CaSO4·2H2O 0.93 g/L、PTM1 4.0 mL/L。

1.2.2 種子液的制備 實驗室保存的畢赤酵母菌M27-8，轉(zhuǎn)接入含 200 μg/mL Zeocin的 YPDS平板培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)3 d，涂板。將平板培養(yǎng)基活化好的菌種，挑選單菌落接種到50 mL YPD液態(tài)培養(yǎng)基中，28℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)20～24 h，OD600達到6.0～8.0，鏡檢，視野中酵母菌飽滿、均勻、單個或兩個成串的培養(yǎng)液作為發(fā)酵種子液。

1.2.3 培養(yǎng)基成分優(yōu)化

1.2.3.1 不同氮源對產(chǎn)β-甘露聚糖酶的影響。分別采用2%、4%、6% 濃度的BSM、棉籽粉、中溫豆粉、玉米漿作為氮源，添加20 g/L的葡萄糖為碳源，以YPD培養(yǎng)基為對照。接種量2%、裝液量50 mL/250 mL，轉(zhuǎn)速200 r/min，用八層無菌紗布封口培養(yǎng)，28℃培養(yǎng)，72 h取樣，測定β-甘露聚糖酶酶活。

1.2.3.2 不同玉米漿干粉含量對產(chǎn)β-甘露聚糖酶的影響。按照上述最佳條件，采用3%、4%、5%、6%、7%、8%、10%不同玉米漿含量的培養(yǎng)基進行發(fā)酵試驗，5 moL/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH 5.0，其他條件同上。

1.2.3.3不同葡萄糖含量對產(chǎn)β-甘露聚糖酶的影響。按照上述最佳條件，采用1%、2%、3%、4%、5%不同葡萄糖含量的培養(yǎng)基進行發(fā)酵試驗，5 moL/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH 5.0，其他條件同上。

1.2.4 培養(yǎng)條件優(yōu)化

1.2.4.1 不同發(fā)酵液pH對產(chǎn)β-甘露聚糖酶的影響。按照上述最佳條件，用5 moL/L的氫氧化鈉和10%磷酸調(diào)節(jié)初始pH，調(diào)節(jié)pH為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，以不調(diào)節(jié) pH 為對照，每 12 h調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH，其他條件同上。

1.2.4.2 不同接種量對產(chǎn)β-甘露聚糖酶的影響。按照上述最佳條件，采用1%、2%、5%、7.5%、10%接種量進行發(fā)酵試驗，其他條件同上。

1.2.4.3 不同溫度對產(chǎn)β-甘露聚糖酶的影響。按照上述最佳條件，設(shè)置兩組分別在28℃和30℃下培養(yǎng)24 h，最后每組分別在24、28、32℃繼續(xù)培養(yǎng)至72 h，其他條件同上。

1.2.4.4 不同轉(zhuǎn)速對產(chǎn)β-甘露聚糖酶的影響。按照上述最佳條件，采用 150、175、200、225、250 r/min，其他條件同上。

1.2.5 胞外粗酶液的制備 取發(fā)酵物2～4 mL至離心管中，9000 r/min離心5 min，上清液為粗酶液。

1.2.6 β-甘露聚糖酶酶活測定 取直徑15 mm的15 mL的潔凈刻度試管分別標(biāo)記空白組、對照組、測試組，分別加入1.5 mL pH 5.0的0.5%甘露聚糖溶液作為底物，45℃水浴預(yù)熱5 min；測試組加入稀釋適當(dāng)倍數(shù)的預(yù)熱酶液0.5 mL，在45℃水浴10 min，每隔2 min輕輕搖晃均勻；10 min后立即加入2 mL DNS溶液終止反應(yīng)；然后僅在對照組中加入0.5 mL酶液，立即至于沸水中煮沸15 min,顯色反應(yīng)后，冷卻至室溫后用蒸餾水定容至15 mL，顛倒混勻；以空白管調(diào)零，在分光光度計540 nm波長處測吸光度。

酶活力單位（U）：在45℃、pH 5.0的條件下，每分鐘水解底物產(chǎn)生1 μmol甘露糖所需的酶量為一個酶活單位。

1.2.7 甘露糖標(biāo)準(zhǔn)曲線 用pH 5.0磷酸二氫鉀—磷酸氫二鈉緩沖液配制 0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg/mL不同濃度梯度，以甘露糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)線性擬合得到線性回歸方程：Y=0.15502X-0.039，R2=0.99845。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同氮源對產(chǎn)β-甘露聚糖酶的影響 在培養(yǎng)基中分別添加玉米漿干粉、棉籽餅粉、中溫豆餅粉、BSM、YPD發(fā)酵72 h測定酶活。結(jié)果見圖1。

圖1 不同氮源對產(chǎn)β-甘露聚糖酶的影響

由圖1可知，發(fā)酵最佳產(chǎn)β-甘露聚糖酶培養(yǎng)基是添加氮源YPD，酶活達到138.9 U/mL；其次是玉米漿干粉，6%含量的玉米漿干粉培養(yǎng)基發(fā)酵酶活達到111 U/mL，為YPD培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)酶的80%。棉籽餅粉和中溫豆餅粉濃度也影響菌株產(chǎn)酶，當(dāng)培養(yǎng)基中添加BSM時，幾乎檢測不到酶活；試驗結(jié)果和Jia等（2012）報道的采用玉米漿干粉作為替代氮源時最佳結(jié)果相符。因玉米漿干粉相對蛋白胨和酵母膏作為氮源時廉價，故在上大型發(fā)酵罐時可以將其作為YPD培養(yǎng)基的取代物，節(jié)約生產(chǎn)成本。

2.2 不同玉米漿干粉含量對產(chǎn)β-甘露聚糖酶的影響 通過發(fā)酵72 h，測定發(fā)酵液中的酶活，結(jié)果見圖2。隨著玉米漿干粉含量增加，β-甘露聚糖酶產(chǎn)量先增后減；且玉米漿含量在6%～8%時，產(chǎn)酶相對平穩(wěn)。這可能是玉米漿成分復(fù)雜，顯酸性，含量過高時會抑制微生物產(chǎn)酶。最佳的玉米漿干粉含量在6%左右。

圖2 不同玉米漿干粉含量對產(chǎn)β-甘露聚糖酶的影響

2.3 不同葡萄糖含量對產(chǎn)β-甘露聚糖酶的影響通過發(fā)酵72 h，測定發(fā)酵液中的酶活，結(jié)果見圖3。隨著葡萄糖含量增加，β-甘露聚糖酶酶活逐漸升高，且在3%后不再增加。這可能是葡萄糖含量過高，會產(chǎn)生葡萄糖抑制效應(yīng)，從而抑制微生物的生長（Olaniyi等，2015）。最佳的葡萄糖含量為3%。

圖3 不同葡萄糖含量對產(chǎn)β-甘露聚糖酶的影響

2.4 不同發(fā)酵液pH對產(chǎn)β-甘露聚糖酶的影響通過調(diào)節(jié)0～72 h發(fā)酵液中的pH，每12 h調(diào)pH一次，以不調(diào)pH作為對照，測定發(fā)酵液中β-甘露聚糖酶酶活，結(jié)果見圖4。隨著發(fā)酵時間的延長，β-甘露聚糖酶酶活基本保持增長的趨勢。通過發(fā)酵過程中控制不同發(fā)酵pH，只有發(fā)酵pH 4.0較自然發(fā)酵效果差，其余效果都較對照好，其中pH為5.0、5.5、6.0效果最優(yōu)，且三者之間酶活差別不大，說明發(fā)酵液pH值為5.0～6.0為產(chǎn)酶的適宜濃度，是不調(diào)pH產(chǎn)酶的2.5倍左右。

圖4 不同發(fā)酵液pH對產(chǎn)β-甘露聚糖酶的影響

2.5 不同接種量對產(chǎn)β-甘露聚糖酶的影響 通過發(fā)酵96 h，測定發(fā)酵液中的酶活，結(jié)果見圖5。隨著發(fā)酵時間的增加，產(chǎn)酶基本保持較快增長的趨勢；接種量不同，產(chǎn)酶差異不明顯。在發(fā)酵過程中，只有接種量為1%時，前60 h和其他接種量有較大差異，說明接種量最少要控制在2%，才不會因為菌體濃度而影響產(chǎn)酶。

圖5 不同接種量對產(chǎn)β-甘露聚糖酶的影響

2.6 不同溫度對產(chǎn)β-甘露聚糖酶的影響 通過發(fā)酵72 h，測定發(fā)酵液中的酶活，結(jié)果見圖6。前期兩組分別在28℃和30℃培養(yǎng)24 h測定酶活，即圖中28℃培養(yǎng)起始值和30℃培養(yǎng)起始值，30℃培養(yǎng)起始值曲線較28℃培養(yǎng)起始值曲線高，這可能是30℃培養(yǎng)更適合微生物前期生長，較利于產(chǎn)酶，故前期采用30℃培養(yǎng)較適宜。兩組在28℃和30℃培養(yǎng)24 h后，后期分別至于24、28℃和30℃培養(yǎng)72 h測定酶活，發(fā)現(xiàn)后期培養(yǎng)溫度越高越不利于產(chǎn)酶，且前期24 h在30℃培養(yǎng)后轉(zhuǎn)入32℃培養(yǎng)至72 h時，酶活相較于其他條件下降得更快，可能是由于后期發(fā)酵溫度過高，不利于微生物生長，導(dǎo)致蛋白質(zhì)降解，對外源蛋白質(zhì)的表達不利（Ye等，2008）。故后期采用不超過28℃培養(yǎng)較適宜。

圖6 不同溫度對產(chǎn)β-甘露聚糖酶的影響

2.7 不同轉(zhuǎn)速對產(chǎn)β-甘露聚糖酶的影響 通過發(fā)酵72 h，測定發(fā)酵液中的酶活，結(jié)果見圖7。隨著時間的推移，酶活逐漸增加，且在發(fā)酵60 h之后，酶活保持穩(wěn)定；隨著轉(zhuǎn)速增加，產(chǎn)酶前期48 h內(nèi)保持增加趨勢，后期逐漸平穩(wěn)。發(fā)酵過程中轉(zhuǎn)速越大，有利于促進溶氧，促進物質(zhì)間的傳遞轉(zhuǎn)化，有利于產(chǎn)酶。225 r/min和250 r/min在60 h后差異較小，且發(fā)酵周期縮短能夠減少生產(chǎn)成本，如果采用225 r/min，發(fā)酵60 h和72 h產(chǎn)酶并無明顯差異。故采用60 h發(fā)酵，轉(zhuǎn)速225 r/min較適宜。

圖7 不同轉(zhuǎn)速對產(chǎn)β-甘露聚糖酶的影響

3 結(jié)論

本文采用畢赤酵母組成型工程菌株M27-8進行高密度發(fā)酵，優(yōu)化培養(yǎng)基配比及培養(yǎng)條件，得出最佳產(chǎn)酶條件。優(yōu)化后基本培養(yǎng)基組成為6%的玉米漿干粉作為氮源，3%的葡萄糖作為碳源，較采用優(yōu)化前的YPD培養(yǎng)基價格低廉，適宜規(guī)?；a(chǎn)；優(yōu)化后基本培養(yǎng)參數(shù)采用發(fā)酵pH為5.5，培養(yǎng)時間60 h，接種量2%，發(fā)酵溫度不超過28℃，轉(zhuǎn)速225 r/min，能夠達到最佳的產(chǎn)酶條件，最大酶活達到452.7 U/mL，是優(yōu)化前酶活138 U/mL的3.3倍。

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The optimal conditions for the production of β-manganese were obtained by using Pichia pastors engineering strain M27-8.The content nitrogen sources，glucose content，pH，fermentation time，inoculum size，temperature and speed were optimized.The results showed that the optimum conditions for enzyme production were as follows：6%corn steep liquor，3%glucose，pH 5.5，fermentation 60 h，2%inoculation amount，28 ℃，225 r/min，the maximum activity reached 452.7 U/mL，which was 3.3 times of that of the optimized enzyme activity of 138 U/mL.In conclusion，substitution of YPD medium with cheaper corn pulp medium could save costs and lay the foundations for industrial production.

β-mannanase；Pichia pastoris；fermentation conditions；optimization

S816.3

A

1004-3314（2017）19-0013-04

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20171903

廣州市科技計劃項目（201710010154）

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