高 敏，張 璞，汪子力，袁 若

（西南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，發(fā)光與實(shí)時(shí)分析重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶400715）

基于CdS量子點(diǎn)構(gòu)建的“signal-off”型電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感器用于心肌肌鈣蛋白I的高靈敏檢測(cè)

高 敏，張 璞，汪子力，袁 若*

（西南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，發(fā)光與實(shí)時(shí)分析重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶400715）

該實(shí)驗(yàn)制備了CdS量子點(diǎn)，以過(guò)硫酸根作為共反應(yīng)試劑，能有效增強(qiáng)CdS量子點(diǎn)的ECL發(fā)光信號(hào)，合成的Hemin二抗偶合物對(duì)其ECL信號(hào)具有猝滅效果。將電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的高靈敏度與CdS量子點(diǎn)納米材料的表面效應(yīng)、量子效應(yīng)特性相結(jié)合，所構(gòu)建的夾心型免疫傳感器在檢測(cè)急性心肌梗死標(biāo)志物心肌肌鈣蛋白I（cTnI）的方面具有檢出限低、靈敏度高的優(yōu)勢(shì)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，cTnI的檢測(cè)范圍為0.25 pg/mL~0.11 ng/mL，檢出限為0.083 pg/mL（S/N=3）?；谠摿孔狱c(diǎn)構(gòu)建的免疫傳感器能很好地用于急性心肌梗死標(biāo)志物cTnI的早期檢測(cè)，有望實(shí)現(xiàn)對(duì)急性心肌梗死的早期診斷和治療檢測(cè)。

電致化學(xué)發(fā)光；免疫傳感器；心肌肌鈣蛋白-I；CdS量子點(diǎn)

Abstract:In this study,CdS quantum dots were prepared successfully and the S2O82-was used as co-reagents to enhance the ECL signal of CdS quantum dots.The synthesized complex of Hemin and antibody had a quenching effect on the signal of CdS quantum dots.Combining the advantages of high sensitivity of the ECL immunosensor with the surface effect and quantum effect of CdS quantum dots,the sandwich mode immunosensor was constructed to detect acute myocardial infarction marker cardiac troponin I(cTnI),which has the advantages of low detection limit and high sensitivity.The results showed that the detection range of cTnI was 0.25 pg/mL to 0.11 ng/mL,and the detection limit was 0.083 pg/mL(S/N=3).Based on the high luminescence emission of quantum dot,the proposed immunosensor can be used for detecting acute myocardial infarction markers cTnI,which is expected to applied in early diagnosis and treatment of acute myocardial infarction.

Key words:electrochemiluminescence(ECL);immunosensor;cardiac troponin I；CdS quantum dots

0 引言

心血管疾病是當(dāng)今世界威脅人類健康的頭號(hào)殺手，而其中的急性心肌梗死具有發(fā)病快，致殘率高，死亡率高等特點(diǎn)[1]，已逐漸成為中老年人常見(jiàn)疾病之一[2]，故而針對(duì)急性心肌梗死的研究逐漸成為熱點(diǎn)。而心肌肌鈣蛋白是國(guó)際上公認(rèn)的診斷急性心肌梗死的靈敏性和特異性最好的標(biāo)志物[3-5]。它是心肌細(xì)胞中特有的結(jié)構(gòu)蛋白，由三種不同基因的亞基因組成：心肌肌鈣蛋白T（cTnT）、心肌肌鈣蛋白 I（cTnI）、心肌肌鈣蛋白 C（cTnC）。標(biāo)志物cTnT和cTnI在診斷急性心肌梗死的疾病中應(yīng)用的最為廣泛。其中，cTnT的濃度在急性心肌梗死患者的血清中的上升幅度明顯，利于觀察，但是，其在大多數(shù)抗原的刺激下，會(huì)出現(xiàn)一定的免疫反應(yīng)，引起濃度的變化，特異性較差，而cTnI對(duì)于診斷心肌梗死則表現(xiàn)出良好的特異性[6]，但是由于其含量低，實(shí)現(xiàn)cTnI的高靈敏檢測(cè)成為了一種挑戰(zhàn)。

目前，檢測(cè)cTnI的生物分析方法主要有酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定[7]、光磁生物傳感器[8]、電化學(xué)免疫檢測(cè)法[9]等。但是，由于這些方法有步驟復(fù)雜、耗費(fèi)時(shí)間、破壞環(huán)境等缺點(diǎn)，所以依舊要求提高檢測(cè)技術(shù)水平。電致化學(xué)發(fā)光（Electrochemiluminescence，ECL） 是一種由電化學(xué)方法觸發(fā)的化學(xué)發(fā)光現(xiàn)象。與化學(xué)發(fā)光類似，ECL無(wú)需使用任何額外光源，而將化學(xué)發(fā)光與分析技術(shù)的超靈敏性和電化學(xué)計(jì)數(shù)的高可控性巧妙的結(jié)合賦予了其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，如具有操作簡(jiǎn)便，成本低，可控性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，因此被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)的檢測(cè)[10-12]。在眾多的ECL發(fā)光試劑中，CdS量子點(diǎn)（CdS）具有優(yōu)異的光穩(wěn)定性，良好的成膜性，抗干擾能力強(qiáng)，可以通過(guò)調(diào)節(jié)尺寸實(shí)現(xiàn)對(duì)其發(fā)射光譜的可控調(diào)節(jié)，具有寬的激發(fā)譜和窄的發(fā)射譜，熒光壽命長(zhǎng)，且易于固定在電極表面而被廣泛應(yīng)用，制備簡(jiǎn)易，因而有望發(fā)展為一種操作簡(jiǎn)單，易行成本低的免疫傳感器[13-15]。這對(duì)研究量子點(diǎn)的制備方法、基本性質(zhì)和實(shí)際應(yīng)用具有重大意義。為了提高免疫傳感器的可控性，降低背景值，具有低背景信號(hào)、高可控性的ECL猝滅法一直備受青睞。在眾多的猝滅試劑中，Hemin因其猝滅效果好，生物兼容性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛的應(yīng)用于ECL“signal off”型傳感器的構(gòu)建。因此，該實(shí)驗(yàn)利用CdS良好的成膜性，將其固定在電極表面，通過(guò)Hemin中的羧基和二抗蛋白大分子的氨基之間的酰胺化反應(yīng)制備二抗偶合物（Hemin-Ab2），形成了“一抗-抗原-二抗偶合物”的夾心結(jié)構(gòu)，構(gòu)建了一種新型的免疫傳感器。該免疫傳感器不僅可以應(yīng)用于急性心肌梗死的早期檢測(cè)，也可在治療時(shí)期進(jìn)行相關(guān)監(jiān)測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑

實(shí)驗(yàn)儀器：CHI660D型電化學(xué)工作站 （上海辰華儀器有限公司）；MPI-E型ECL分析系統(tǒng)多功能化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀（西安瑞邁分析儀器有限公司）；WH-986靜音攪拌器（海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司）；UV-2450紫外分光光度計(jì)（日本島津儀器有限公司）；三電極體系：玻碳電極（GCE，Φ=4 mm）及其修飾電極為工作電極，飽和甘汞電極或Ag/AgCl電極為參比電極，鉑絲為對(duì)電極（上海辰華儀器有限公司）。

實(shí)驗(yàn)試劑：人心肌肌鈣蛋白I（cTnI）及cTnI鼠單克隆抗體 （anti-cTnI）（上海華裔公司），Hemin、牛血清白蛋白（BSA）、EDC/NHS（Sigma 公司）， Cd（NO3）2·4H2O、 Na2S、 K2S2O8、 K2HPO4、NaH2PO4、 KCl、 （成都市科龍化工試劑廠），Er2O3（子美國(guó)際貿(mào)易有限公司），不同pH和不同濃度的磷酸鹽緩沖液 （PBS）通過(guò)混合 0.10 mol/L K2HPO4，0.10 mol/L NaH2PO4，0.10 mol/L KCl 制備且用0.10 mol/L H3PO4和NaOH調(diào)節(jié)pH，然后用二次蒸餾水稀釋至所需濃度，所有溶液使用前均保存在4℃下，其他試劑均為分析純?cè)噭?，?shí)驗(yàn)用水均為二次蒸餾水。

1.2 CdS量子點(diǎn)的制備

先將 0.1683 g Cd（NO3）2·4H2O 溶于 30 mL 水中，然后現(xiàn)配0.085 mmol/L Na2S溶液30 mL，將Cd（NO3）2·4H2O、Na2S 兩種溶液同時(shí)加入 250 mL圓底燒瓶中攪拌加熱至70℃，回流3 h，反應(yīng)混合物經(jīng)離心分離后，用無(wú)水乙醇洗滌一次，二次蒸餾水洗滌兩次，以除去吸附在其表面的雜質(zhì)離子，將制備的CdS分散于二次蒸餾水中，于4℃下保存待用。

1.3 二抗偶合物的制備

在Hemin溶液中加入EDC/NHS活化20 min，然后加入二抗，反應(yīng)2 h后，將所得反應(yīng)混合物離心分離，并依次用無(wú)水乙醇，二次蒸餾水洗滌，將制備的Hemin-Ab2分散于二次蒸餾水中，于4℃下保存待用。

1.4 免疫傳感器的構(gòu)建

免疫傳感器的構(gòu)建過(guò)程如圖1所示。首先，將玻碳電極（GCE）依次用 0.30、0.05 μm 的 Al2O3拋光，再依次用二次蒸餾水，無(wú)水乙醇超聲清洗。清洗后的電極置于室溫下自然晾干備用。隨后，將10 μL CdS孵育在電極表面，在避光條件下自然晾干，得到CdS修飾的玻碳電極（CdS/GCE）。稍后，在電極表面滴加anti-cTnI 16 μL，低溫孵育12 h后（anti-cTnI/CdS/GCE），用 1%的 BSA 封閉納米粒子上多余的結(jié)合位點(diǎn)得到（BSA/anti-cTnI/CdS/GCE）。隨后往電極表面滴加16 μL目標(biāo)物cTnI，在避光條件下反應(yīng) 2 h（cTnI/BSA/anti-cTnI/CdS/GCE），最后滴加二抗偶合物（Hemin-Ab2）16 μL反應(yīng)30 min，構(gòu)建成傳感器（Hemin-Ab2/cTnI/BSA/anti-cTnI/CdS/GCE）。

圖1 ECL傳感器的構(gòu)建過(guò)程圖Fig.1 Schematic diagram of the preparation process of ECL sensor

1.5 檢測(cè)方法

該工作測(cè)量電極采用三電極體系：修飾電極為工作電極，鉑絲電極作為對(duì)電極，Ag/AgCl電極為參比電極。在磷酸緩沖溶液（PBS，pH=7.0，含有0.10 mol/L S2O82-）中，進(jìn)行電化學(xué)掃描來(lái)考察傳感器的電化學(xué)發(fā)光特性。電位掃描范圍為-1.6~0.2 V，電位掃描速度為0.1 V/s，光電倍增管高壓設(shè)置為800 V。

2 結(jié)果與討論

2.1 電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感器修飾過(guò)程的循環(huán)伏安表征

該工作以5.0 mmol/L鐵氰化鉀溶液作為氧化還原標(biāo)記物，采用循環(huán)伏安法（CV）來(lái)表征ECL免疫傳感器每一步構(gòu)建過(guò)程。如圖2所示，裸電極GCE（曲線a）呈現(xiàn)出一對(duì)可逆的氧化還原峰。當(dāng)CdS孵育到GCE表面上后峰電流變小 （曲線b），這是由于CdS是半導(dǎo)體，傳遞電子能力很弱；當(dāng)電極進(jìn)一步孵育anti-cTnI后，由于抗體蛋白大分子阻礙電子的傳遞使得氧化還原峰有所下降 （曲線c），依次用BSA封閉特異性結(jié)合位點(diǎn)（曲線d）、孵育cTnI抗原（曲線e）和滴加Hemin-Ab2（曲線f）后，由于BSA和抗原抗體免疫復(fù)合物對(duì)電子傳遞的阻礙作用，CV曲線的峰電流也依次降低。

圖2 免疫傳感器修飾過(guò)程的循環(huán)伏安表征Fig.2 The CVs of(a)bare GCE;(b)CdS/GCE;(c)anti-cTnI/CdS/GCE;(d)BSA/anti-cTnI/CdS/GCE;(e)cTnI/BSA/anticTnI/CdS/GCE;(f)Hemin-Ab2/cTnI/BSA/anti-cTnI/CdS/GCE in 5.0 mmol/L K3[Fe(CN)6]at scan rate of 100 mV/s

2.2 免疫傳感器對(duì)cTnI的ECL響應(yīng)

Hemin的固載量與cTnI的濃度線性相關(guān)，因此在0.10 mol/L的S2O82-共反應(yīng)試劑的緩沖溶液中可通過(guò)改變cTnI的濃度使傳感器上孵育不同濃度的Hemin。又因?yàn)镠emin對(duì)過(guò)硫酸根的ECL信號(hào)具有較好的猝滅作用，從而使ECL信號(hào)下降。如圖3所示，ECL信號(hào)強(qiáng)度隨著cTnI濃度的增加而減小，ECL強(qiáng)度與cTnI的濃度在0.25 pg/mL~0.11 ng/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,檢出限為0.083 pg/mL（S/N=3），其線性回歸方程為I=-103.173 c+12626.412，線性回歸率為r2=0.996，式中I為發(fā)光強(qiáng)度，c為cTnI的濃度。

圖3 免疫傳感器在含有0.10 mol/L共反應(yīng)試劑的PBS（pH=7.0）中對(duì)cTnI不同濃度的ECL響應(yīng)，cTnI濃度從上往下依次為：(a)0.25 pg/mL；(b)30.25 pg/mL；(c)45.25 pg/mL；(d)60.25 pg/mL；(e)90.25 pg/mL；(f)105.25 pg/mLFig.3 ECL response of the sensor in presence of various concentrations of cTnI in PBS(pH=7.0)containing 0.10 mol/LThe concentration of cTnI:(a)0.25 pg/mL;(b)30.25 pg/mL;(c)45.25 pg/mL;(d)60.25 pg/mL;(e)90.25 pg/mL;(f)105.25 pg/mL

2.3 傳感器穩(wěn)定性的測(cè)定

在最優(yōu)條件下即CdS濃度為1.2 mmoL/L，將已制備好的傳感器連續(xù)掃描10圈（如圖4），得到的ECL信號(hào)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.33%，表明傳感器的穩(wěn)定性良好，可以保證測(cè)量的精確度，有望用于實(shí)際樣品的檢測(cè)。

圖4 免疫傳感器的穩(wěn)定性Fig.4 The stability of the biosensor with ECL intensitytime curve in the optimal conditions under consecutivecyclic potential scans for 10 circles

2.4 傳感器重現(xiàn)性的測(cè)定

在同一批電極中，取三根電極構(gòu)建相同的傳感器并測(cè)量其ECL信號(hào)，對(duì)比信號(hào)值得到批內(nèi)重現(xiàn)性。再取同一根電極，連續(xù)三天構(gòu)建相同的傳感器，并測(cè)其ECL信號(hào)，對(duì)比信號(hào)值得到批間重現(xiàn)性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果得到批內(nèi)、批間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均小于5%，說(shuō)明構(gòu)建的傳感器重現(xiàn)性良好。

3 結(jié)論

綜上所述，基于CdS量子點(diǎn)構(gòu)建的“signaloff”型電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感器實(shí)現(xiàn)了心肌肌鈣蛋白I的高靈敏檢測(cè)。結(jié)合量子點(diǎn)的相關(guān)性質(zhì)，通過(guò)電致化學(xué)發(fā)光表征，得到穩(wěn)定高效的CdS量子點(diǎn)制備方法。探究Hemin對(duì)S2O82-的ECL的猝滅作用，進(jìn)一步制備Hemin-Ab2。此傳感器修飾方法簡(jiǎn)單、快捷，并且具有良好的重現(xiàn)性、穩(wěn)定性，不僅有望于應(yīng)用在急性心肌梗死的早期檢測(cè)，也可在治療時(shí)期進(jìn)行相關(guān)監(jiān)測(cè)。

[1]Hu S,Kong L,Gao R,et al.Ourline of the report on cardiovascular disease in China[J].Biomed Environ Science,2012,25:251-256.

[2]Mukamal K,Nesto R,Cohen M,et al.Impact of diabetes on long-term survival after acute myocardial infarction:Comparability of risk with priormyocardial infarction[J].Diabetes Care,2001,24:1422-1427.

[3]Fuehs S,Gruberg S,Kornowski R,et al.Prognostic value of cardiac troponin I re-elevation following percutaneous coronary intervention in high-risk patients with acute coronary syndromes[J].Am.J.Cardiol.,2001,88:129-133.

[4]Wu A H,Feng Y,Moore R,et al.Characterization of cardiac troponin subunit release into serum after acute myocardial infarction and comparison of assays for troponin T and I[J].Clin.Chem.,1998,44:1198-1208.

[5]Mair J,Morandell D,Genser N,et al.Equivalent early sensitivities of myoglobin,creatine-kinase mb mass,creatine-kinase isoform ratios,and cardiac troponin-I and troponin-T for acute myocardial-infarction[J].Clin.Chem.,1995,41:1266-1272.

[6]Adams J,Bodor G,Davila-Roman V,et al.Myocardial injury/infarction:cardiac troponin I:a marker with high specificity for cardiac injury[J].Circulation,1993,88:101-106.

[7]Cho I,Paek E,Kim Y,et al.Chemiluminometric enzymelinked immunosorbent assays (ELISA)-on-a-chip biosensor based on cross-flow chromatography[J].Anal.Chim.Acta.,2009,632:247-255.

[8]Bejhed R,Donolato M,Hansen M,et al.Turn-on optomagnetic bacterial DNA sequence detection using volume-amplified magnetic nanobeads[J].Biosens Bioelectron,2015,66:405-411.

[9]Guo H,He N,Ge S,et al.MCM-41 mesoporous material modified carbon paste electrode for the determination of cardiac troponin I by anodic stripping voltammetry[J].Talanta,2005,68:61-66.

[10]McCreery R.National Institute for Nanotechnology,Department of Chemistry,University of Alberta,Edmonton,Alberta T6G 2M9,Canada[J].Chem.Rev.,2008,108:2646-2687.

[11]Irkham,Watanabe T,Fiorani A,et al.Co-reactant-on-Demand ECL:Electrogenerated Chemiluminescence by the in Situ Production of S2O82–at Boron-Doped Diamond Electrodes[J].Am.Chem.Soc.,2016,138:15636-15641.

[12]Richter M.Department of Chemistry,Southwest Missouri State University,Springfield,Missouri 65804-0089[J].Chem.Rev.,2004,104:3003-3036.

[13]Chan W,Nie S.Quantum dot bioconjugates for ultrasensitive nonisotopic detection[J].Science,1998,281:2016-2018.

[14]Jamieson T,Bakhshi R,Petrova D,et al.Biological applications of quantum dots[J].Biomaterials,2007,28:4717-4732.

[15]Gao X,Yang L,Petros J A,et al.In vivo molecular and cellular imaging with quantum dots[J].Current Opinion in Biotechnology,2005,16:63-72.

A “Signal-off” electrochemiluminescence immunosensor based on CdS quantum dots for highly sensitive detection of cardiac troponin I

Gao Min,Zhang Pu,Wang Zi-li,Yuan Ruo*
(College of Chemistry and Chemical Engineering,Southwest University,Chongqing 400715,China)

*通信聯(lián)系人