張 有，夏 蓮，尤進茂*，任 銳

（1.曲阜師范大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，山東省生命有機分析重點實驗室，山東曲阜273165）（2.臨沂大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，山東省腫瘤標志物檢測重點實驗室，山東臨沂276000）

結(jié)合分支雜交鏈式反應(yīng)與增強拉曼的DNA傳感器

張 有1，夏 蓮1，尤進茂1*，任 銳2*

（1.曲阜師范大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，山東省生命有機分析重點實驗室，山東曲阜273165）（2.臨沂大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，山東省腫瘤標志物檢測重點實驗室，山東臨沂276000）

該研究建立了一種高靈敏度、高特異性的DNA檢測方法，結(jié)合了分支雜交鏈式反應(yīng)（B-HCR）與表面增強拉曼散射（SERS）兩種技術(shù)，為實現(xiàn)這種結(jié)合，設(shè)計讓靶DNA充當樹枝狀DNA大分子和SERS增強基底的銜接單元；基于經(jīng)典的雜交鏈式反應(yīng)而設(shè)計分支雜交鏈式反應(yīng)（B-HCR），還充當了樹枝狀DNA大分子和SERS的接頭。結(jié)合了B-HCR與SERS兩種方式的優(yōu)點，B-HCR使得在自組裝中的每一輪生長都組裝上更多的分支，從而實現(xiàn)拉曼活性基團的聚集；并結(jié)合SERS技術(shù)，增強放大信號，從而提高了靈敏度；而DNA雜交反應(yīng)的序列特異性保證了整個方法對于給定靶DNA的特異性。所報道的方法具備較高的靈敏度，還證明了足夠的特異性來區(qū)分具有相似序列的DNA。

DNA;分支雜交鏈式反應(yīng);表面增強拉曼散射；6’-羧基-x-羅丹明（ROX）

Abstract：In this study,an assay for the detection of DNA of low abundance was established.The assay was constructed by combining of Branching Hybridization Chain Reaction(B-HCR)and Surface-Enhanced Raman Scattering(SERS).The target DNA was designed to serve as a linker between the B-HCR and SERS.The advantages of the B-HCR and SERS were combined.B-HCR provides more branching in each round of growth of the assembly,thus leading to the mass aggregation of the Raman-active tags;thus both amplification (through B-HCR)and enhancement(through SERS)were applied on the signal,bringing about desirable sensitivity;also,specificity was provided,through the sequence-specificity of DNA hybridization in the capturing of the target DNA on the SERS matrix,and the triggering of the B-HCR.Desirable sensitivity was achieved,and required specificity against DNA inputs with similar sequences was testified.

Key words:DNA;hybridization chain reaction;surface-enhanced raman scattering;6-carboxy-x-rhodamine

0 引言

低含量DNA的檢測，在生物化學(xué)研究、醫(yī)學(xué)研究、病原體檢測以及診斷中具有重大意義。這就要求開發(fā)簡單、快速、高靈敏度和高選擇性的DNA分析方法。生物化學(xué)傳感器中的DNA傳感器可以分為靶標識別、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及放大信號產(chǎn)生等幾部分，其中靶標識別部分承擔(dān)分析方法的特異性，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和放大部分通常對微量靶標產(chǎn)生的微小信號進行放大處理，承擔(dān)分析方法的靈敏度；而產(chǎn)生的信號將作為分析方法的讀數(shù)輸出。近年來，設(shè)計簡單、易于操作的雜交鏈式反應(yīng)（HCR）是新興的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和放大方法，因此得到了廣泛關(guān)注和使用。

HCR的設(shè)計特征是引發(fā)自組裝，經(jīng)典HCR中，組裝元件是兩種發(fā)夾DNA，只有在引入引發(fā)鏈的情況下，才進行自組裝反應(yīng)形成聚集產(chǎn)物。分支型HCR是Pierce等[1]首先報道的，是一種動態(tài)DNA裝配方式[2]，其中的DNA可以被引發(fā)而形成樹枝狀納米結(jié)構(gòu)。然而，其需要為每一代樹突生長提供新的DNA，因此該方法不是自發(fā)的，與后來的非線性HCR過程尚有一定差距[3]。Chandran等[4]也報道了HCR的非線性DNA生長方式，其理論上來說，其是通過使用雙環(huán)結(jié)構(gòu)的發(fā)夾DNA來觸發(fā)，從而形成指數(shù)生長的樹狀納米結(jié)構(gòu)。然而，設(shè)計的組裝過程涉及相對長的DNA發(fā)夾莖的自發(fā)打開，在有限的速率內(nèi)，這可能產(chǎn)生線性生長過程而不是樹突生長。其并沒有提供如組裝的納米結(jié)構(gòu)的形態(tài)或指數(shù)生長動力學(xué)的實體證據(jù)。到目前為止，構(gòu)建可行的非線性HCR系統(tǒng)的目標仍然是難以捉摸的。

雜交鏈式反應(yīng)（HCR）的概念不僅僅限于線性DNA的聚合。它可以擴展到更復(fù)雜的多DNA的裝配，其在觸發(fā)過程下可以組裝成其他分支甚至樹枝狀的納米結(jié)構(gòu)，實現(xiàn)呈指數(shù)生長的非線性雜交DNA系統(tǒng)。然而，盡管增加了序列設(shè)計的復(fù)雜性，控制系統(tǒng)的自發(fā)啟動仍然是一個巨大的挑戰(zhàn)[5]。

此研究提出一個符合動力學(xué)控制的樹枝狀DNA生長的非線性HCR系統(tǒng)。這一系統(tǒng)顯示出對于指數(shù)生長動力學(xué)的良好控制。表面增強拉曼散射（SERS）是作為一種新型的信號產(chǎn)生方法，近年來在生物分析化學(xué)中得到廣泛關(guān)注與應(yīng)用。所設(shè)計的方案中組裝成的樹枝大分子DNA結(jié)合表面增強拉曼散射技術(shù)，其中帶有羅丹明信號的樹枝狀大分子DNA結(jié)合金薄膜基底，將產(chǎn)生很高的SERS響應(yīng)，最終實現(xiàn)對靶DNA的靈敏度檢測以及高選擇性區(qū)分。

1 設(shè)計原理

B-HCR和SERS結(jié)合的檢測方法設(shè)計是由靶DNA作為紐帶，將B-HCR放大和SERS增強機制兩部分結(jié)合為一體，因而此檢測體系能夠同時享有兩部分的信號放大/增強效應(yīng)，從而期望獲得較高的靈敏度(圖1）。

兩部分銜接的具體方式為：構(gòu)建具備捕獲鏈的SERS增強基底，通過雜交的方式將靶DNA捕獲在其表面；其后，以靶DNA的暴露部分作為引發(fā)鏈，引發(fā)B-HCR的雜交組裝。B-HCR的組裝單元都是由拉曼活性基團標記的。其結(jié)果是，在SERS的基底上形成B-HCR組裝產(chǎn)物，其中聚集了大量拉曼活性基團。SERS基底對上述拉曼活性基團聚集體的特征拉曼散射進行增強，從而產(chǎn)生放大/增強的信號，提供雙重的高靈敏度貢獻。

圖1 B-HCR與SERS檢測方法的流程示意圖Fig.1 Scheme of the assay that combined BHCR and SERS

B-HCR部分依據(jù)文獻[6]設(shè)計，各個組裝單元均為與靶DNA鏈序列匹配的DNA鏈或DNA鏈復(fù)合體。所有進入最終B-HCR組裝體的組裝單元，均用拉曼活性基團ROX（6’-羧基羅丹明）標記。

SERS增強基底則采用金薄膜與金納米粒子雜交組裝的方式構(gòu)建，其上留有捕獲鏈作為結(jié)合靶DNA的接口。為構(gòu)建SERS增強基底，準備兩種部分互補的巰基修飾的DNA，分別記為DNAA1和DNA-A2。在玻璃支持的金薄膜上結(jié)合DNA鏈A1，同時制備20 nm左右的金納米顆粒，分為兩類，每一類分別結(jié)合DNA鏈A1和A2。三者（結(jié)合A1的金薄膜、結(jié)合A1的金納米顆粒和結(jié)合A2的金納米顆粒）通過DNA雜交相互結(jié)合，形成富含金納米顆粒的聚集物，以起到增強拉曼散射信號的作用；同時留有的捕獲鏈可以捕獲靶DNA。

2 實驗部分

2.1 主要儀器與試劑

儀器:

聚丙烯酰胺凝膠電泳儀（DYCZ-28C型）（北京六一儀器廠）；透射電子顯微鏡 （JEM-2100E型）（日本電子光學(xué)公司）；拉曼激光顯微鏡（inVia）（英國Renishaw公司）；紫外分光光度計（Cary 50 UV–Vis–NIR）（Varian）。

試劑:

氯金酸（上海化學(xué)試劑公司）；檸檬酸鈉（天津博迪化工股份有限公司）。

所使用的DNA序列如表1所示。

表1 BHCR-SERS檢測體系所用的DNA序列Tab.1 DNA sequences used in BHCR-SERS assay

另外：實驗所用的核酸均從上海生工合成，實驗中所用的所有玻璃器具都經(jīng)過食人魚洗液浸泡洗滌，并用超純水沖洗并烘干使用。

2.2 實驗步驟

2.2.1 表面增強拉曼散射（SERS）增強基底的構(gòu)建

①根據(jù)文獻[7]，采用檸檬酸鈉還原氯金酸的方法制備納米金顆粒（AuNPs）。

②根據(jù)文獻[8]，進行納米金顆粒連接 SHDNA： 準備 200 μL 的 SH-DNASH-DNA （1×10-6mol/L）， 向其中加入 10 μL 的 TCEP（10mmol/L），保持37℃下震蕩反應(yīng)1h，活化DNA上的巰基，向其中加入納米金顆粒1mL和50μLpH為5.6的醋酸鹽緩沖液，保持37℃下避光震蕩反應(yīng)18h。

③制備金薄膜基底：A1（AuNPs-SH-DNA）與A2(AuNPs-SH-DNA)雜交）。

④探針準備（A探針：A鏈與A封閉鏈雜交；B探針：B鏈與B封閉鏈雜交）。

2.2.2 分支雜交鏈式反應(yīng)（BHCR）組裝產(chǎn)物的制備

分別向離心管中加入濃度為1.0×10-6mol/L的 A探針 25 μL與濃度為 1.0×10-6mol/L的B探針 50 μL，充分混勻， 加入 10 μL濃度為1.0×10-8mol/L的靶 DNA，加入 15 μL濃度為1.0×10-8mol/L的混合輔助鏈AB，然后保持37℃避光振蕩反應(yīng)2 h，反應(yīng)結(jié)束后把樣品進行10000 r/min離心處理20 min，離心后的樣品用濃度為0.01 mol/L的PBS緩沖溶液洗滌三次，最后PBS緩沖液稀釋至30 μL備用。

2.2.3 放大信號的測量

取生物條碼化的金薄膜3~4 μL，均勻滴加到預(yù)處理過的金片表面，在室溫下孵育至少18 h形成穩(wěn)定的鍵合結(jié)構(gòu)。自發(fā)反應(yīng)4 h后，取2.5 μL樹枝狀合成產(chǎn)物滴加到金薄膜結(jié)構(gòu)的SERS基底上。室溫下靜置自然干燥約40 min，然后在拉曼顯微鏡上選取區(qū)域進行拉曼信號檢測。

3 結(jié)果與討論

3.1 納米金顆粒的TEM表征

圖2顯示的是AuNPs的透射電鏡 （TEM）表征結(jié)果，由圖可知，所制備的AuNPs分布均勻，大小約為20 nm。

圖2 納米金顆粒的電鏡圖Fig.2 TEM image of the prepared gold nanoparticles

3.2 納米金顆粒等紫外表征

使用紫外分光光度計分別對AuNPs、AuNPs-SH-DNA、SH-DNA進行紫外掃描,如圖3所示，SH-DNA的紫外吸收特征峰為260 nm左右處，AuNPs的特征峰為520 nm左右處，AuNPs-SHDNA的紫外可見吸收光譜在260 nm處有明顯特征吸收峰，且在520 nm處有明顯吸收峰，說明SH-DNA成功的連接在AuNPs上。

圖3 金納米顆粒及結(jié)合DNA后的紫外-可見吸收光譜圖a:金納米顆粒；b:巰基修飾的DNA；c：金納米顆粒與巰基修飾DNA的結(jié)合體Fig.3 UV-Vis spectra of the gold nanoparticles(AuNPs)and the complex of AuNP-DNA a:AuNPs；b:HS-modified DNA；c：complex of AuNPs and HS-modified DNA

3.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）表征

用聚丙烯酰胺凝膠電泳成像（PAGE）進行實驗表征。如圖4所示:泳道m(xù)，marker；

圖4 BHCR-SERS檢測方法的聚丙烯酰胺凝膠電泳驗證Fig.4 Polyacrylamide gel electrophoresis(PAGE)characterization of the process of BHCR-SERS assay

泳道A，DNA 產(chǎn)物(純化后)；

泳道B，靶DNA；

泳道 C，A探針:2 μmol/L的 A底物與 2 μmol/L的A封閉鏈37℃雜交孵育2 h；

泳道 D，B探針:2 μmol/L的 B底物與 2 μmol/L的B封閉鏈37℃雜交孵育2 h；

泳道E，DNA產(chǎn)物（純化前）。

對比泳道B （靶DNA）、C和D （兩種BHCR組裝部件），與首次組裝產(chǎn)物（泳道E），證實了分支雜交鏈式反應(yīng)組裝的發(fā)生，證據(jù)為產(chǎn)物中明顯出現(xiàn)了遷移率極低（位于電泳起點附近）的條帶，在作為原料的B、C和D泳道中均未出現(xiàn)，證實了總分子量極高的組裝物的產(chǎn)生。對泳道E的產(chǎn)物進行純化的結(jié)果為泳道A，顯示過量的探針以及副產(chǎn)物已全部純化去除，已成功合成了樹枝狀DNA組裝物。

3.4 實驗條件優(yōu)化：反應(yīng)體系時間的優(yōu)化

準備 A 探針各 25 μL（10-6mol/L）和 B 探針50 μL （10-6mol/L）， 向其中加入 25 μL 靶 DNA（10-8 mol/L）,將體系保持在37℃下孵育1 h至5 h。如圖5，SERS信號達到最大平衡處約為孵育3 h的時候。該時間即為反應(yīng)的最佳時間。

圖5 反應(yīng)時間對BHCR-SERS檢測方法的響應(yīng)的影響Fig.5 Effect of reaction time on the responses of BHCRSERS assay

3.5 拉曼信號放大實驗

使用靶DNA鏈引發(fā)整個自組裝體系，反應(yīng)時間為3 h，其中靶 DNA濃度分別為a）1.0×10-12mol/L,b)5.0×10-12mol/L,c)1.0×10-11mol/L,d)5.0×10-11mol/L,e)1.0×10-10mol/L,f)5.0×10-10mol/L,g)1.0×10-9mol/L,h)5.0×10-9mol/L,i)1.0×10-8mol/L。如圖6、圖7，根據(jù)在1499 cm-1位置（減去空白響應(yīng)后）的SERS響應(yīng)與靶DNA的濃度之間繪制標準曲線。在1.0×10-12mol/L到10-8mol/L的范圍內(nèi)，回歸方程為ΔI=1.60 lgc+19.61，根據(jù)3σ規(guī)則，檢測限（LOD）確定為 5.6×10-13mol/L。

3.6 選擇性實驗

研究了靶DNA以及幾種錯配的DNA（長度和序列相近），使用完整反應(yīng)體系，從而探討了選擇性實驗。如圖8可知：靶DNA引發(fā)的樹枝狀DNA合成有很強的SERS響應(yīng)，而其他幾種錯配的DNA無法引發(fā)自組裝反應(yīng)生成樹枝狀DNA，SERS響應(yīng)很低，因此實驗對于相似序列有較強的選擇能力。

圖6 BHCR-SERS檢測方法的原始響應(yīng)曲線Fig.6 The SERS response curves of the BHCR-SERS assay

圖7 BHCR-SERS檢測方法的工作曲線Fig.7 The Calibration Curve of the BHCR-SERS assay

圖8 BHCR-SERS檢測方法檢測DNA的選擇性a)空白響應(yīng)；b)-d)錯配DNA b-d（序列見表1）Fig.8 Selectivity of the BHCR-SERS assay against the controlsa)blank；b)-d)mismatched DNA b-d （Sequences shown in Table 1）

4 結(jié)論

總而言之，該研究建立了一種高靈敏度、高特異性的DNA檢測方法，結(jié)合了分支雜交鏈式反應(yīng)（B-HCR）與表面增強拉曼散射（SERS）兩種技術(shù)，為實現(xiàn)這種結(jié)合，設(shè)計讓靶DNA充當樹枝狀DNA大分子和SERS增強基底的銜接單元；該項研究中，基于經(jīng)典的雜交鏈式反應(yīng)而設(shè)計分支雜交鏈式反應(yīng)（B-HCR），還充當了樹枝狀DNA大分子和SERS的接頭。結(jié)合了B-HCR與SERS兩種方式的優(yōu)點，靶DNA用于引發(fā)兩探針自組裝成樹枝大分子DNA，使得兩探針自組裝成樹枝狀DNA大分子，使納米結(jié)構(gòu)的鏈支化組裝生長和指數(shù)地增加信號強度。還充當了分支雜交鏈式反應(yīng)和表面增強拉曼散射增強的接頭。B-HCR使得在自組裝中的每一輪生長都組裝上更多的分支，從而實現(xiàn)拉曼活性基團的聚集；并結(jié)合SERS技術(shù)，增強放大信號，從而提高了靈敏度；而DNA雜交反應(yīng)的序列特異性保證了整個方法對于給定靶DNA的特異性。該方法具備較高的靈敏度，檢測限達到5.6×10-13mol/L，還證明了足夠的特異性來區(qū)分具有相似序列的DNA。

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DNA sensor that combined branching hybridization chain reaction and enhanced raman scattering

Zhang You1,Xia Lian1,You Jin-mao1*,Ren Rui2*
(1.Key Laboratory of Life-Organic Analysis of Shandong Province,Qufu Normal University,Qufu 273165,China)(2.Shandong Province Key Laboratory of Detection Technology for Tumor Makers,School of Chemistry and Chemical Engineering,Linyi University,Linyi 276000,China)

*通信聯(lián)系人，E-mail:(尤進茂)jmyou6304@163.com;(任銳)greeneese@163.com，15653976530