冉佩瑤，宋金奕，夏 巧，馬 驕，楊成成，傅英姿

(西南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，重慶400715)

牛血清白蛋白及金屬石墨烯復(fù)合材料與高藜蘆胺對(duì)映體的選擇性作用研究

冉佩瑤，宋金奕，夏 巧，馬 驕，楊成成，傅英姿*

(西南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，重慶400715)

利用還原氧化石墨烯、納米鉑和牛血清白蛋白復(fù)合材料(BSA/PtNPs/rGO)修飾玻碳電極，構(gòu)建手性傳感界面，并采用差分脈沖伏安法(DPV)研究該傳感界面與手性藥物合成前體高藜蘆胺對(duì)映體(1-(4-甲氧基苯基)乙胺，MPEA)的相互作用。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在相同條件下，當(dāng)MPEA對(duì)映體濃度小于2.25×10-3mol/L時(shí)，RMPEA在傳感界面的電流響應(yīng)信號(hào)明顯大于S-MPEA；當(dāng)MPEA對(duì)映體濃度大于2.25×10-3mol/L時(shí)，SMPEA的電流響應(yīng)信號(hào)更強(qiáng),即該傳感界面可與MPEA對(duì)映體發(fā)生選擇性作用。且在1.00×10-4mol/L至4.00×10-3mol/L濃度范圍內(nèi)，R-MPEA和S-MPEA的峰電流與其濃度呈線性響應(yīng)。該傳感器制備簡單、響應(yīng)快速、檢測靈敏，在MPEA的選擇性作用方面具有較大發(fā)展?jié)摿Α?/p>

選擇性作用；電分析化學(xué)；金屬石墨烯復(fù)合材料；牛血清白蛋白；1-(4-甲氧基苯基)乙胺

Abstract：A chiral sensing interface was fabricated by reduced graphene oxide,platinum nanoparticles(PtNPs/rGo)and bovine serum albumin(BSA).Differential pulse voltammetry(DPV)was used to investigate the stereoselectivity of sensing interface to homoveratrylamine enantiomers(1-(4-methoxyphenethyl)amine,MPEA).The result displayed that when the concentration was less than 2.25 mmol/L,R-MPEA got the larger signal compared with S-MPEA.When the concentration was exceeded 2.25 mmol/L,S-MPEA got the larger signal compared with R-MPEA.Besides,R-MPEA and S-MPEA presented a linear relationship in the range of 1.00 ×10-4mol/L to 4.00×10-3mol/L.This chiral sensor exist great potentials in selective action owing to its advantages of simple operation,rapid detection and sensitive response.

Key words:chiral recognition;electroanalytical chemistry;complex of metal and graphene;bovine serum albumin;1-(4-methoxyphenethyl)amine

0 引言

生命體是一個(gè)復(fù)雜的手性體系，維持身體運(yùn)作的生物活性分子大多是手性分子，手性藥物進(jìn)入生物體后，會(huì)與體內(nèi)分子進(jìn)行嚴(yán)格的手性匹配，從而使得手性藥物的不同構(gòu)型在生物系統(tǒng)內(nèi)的作用機(jī)制以及產(chǎn)生的藥效和毒理性都有一定差異。當(dāng)手性藥物處于生物體中的手性環(huán)境時(shí)，不同的構(gòu)型會(huì)具有不同的藥效[1-2]。例如，R-反應(yīng)停是一種緩解妊娠反應(yīng)的藥物，而S-反應(yīng)停不僅沒有療效，反而具有致畸作用；D-青霉胺用于治療肝豆?fàn)詈俗兒屯柹习Y，并可作為中間體用于合成藥物，而L-青霉胺則具有較強(qiáng)毒性和潛在的致癌活性[3]。因此，發(fā)展簡單、快速、靈敏和可靠的手性藥物對(duì)映體純度分析和含量檢測技術(shù)成為醫(yī)藥學(xué)和生物學(xué)等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。近年來，手性電化學(xué)傳感器以其操作簡單、靈敏度高和成本低等優(yōu)點(diǎn)獲得了廣泛的關(guān)注[4-10]。

高血壓是心、腦血管疾病的主要誘發(fā)因素之一，現(xiàn)已位于各種疾病引起死亡的第三位，被醫(yī)學(xué)界稱為人類的第一殺手。因此，降壓藥物的篩選及其開發(fā)研究具有重要現(xiàn)實(shí)意義。高藜蘆胺(1-(4-甲氧基苯基)乙胺，MPEA)不僅降壓作用明顯，無快速耐受現(xiàn)象，具有與藜蘆生物堿相似或相近的藥理活性，而且也是維拉帕米、貝凡諾爾等心血管藥物的合成前體[11-12]。目前為止，對(duì)于高藜蘆胺對(duì)映體有效識(shí)別的研究工作并不充分。因此，發(fā)展快速有效的識(shí)別方法對(duì)高藜蘆胺對(duì)映體進(jìn)行識(shí)別具有巨大的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

石墨烯(graphene)是由碳原子以sp2雜化軌道組成的六角型呈蜂巢晶格平面薄膜結(jié)構(gòu)的一種新型二維碳納米材料，以其比表面面積大、導(dǎo)電性能好及穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)，在電化學(xué)傳感器的構(gòu)建上得到大量應(yīng)用[13-15]。為充分利用石墨烯的優(yōu)良性能，對(duì)石墨烯的改性研究日益多樣化，如在石墨烯表面原位還原K2PtCl6，提高石墨烯的電子傳輸能力。

牛血清白蛋白(BSA)是由583個(gè)氨基酸殘基組成的多肽鏈，其中35個(gè)半胱氨酸組成17個(gè)二硫鍵，在肽鏈的34位有一個(gè)自由的巰基，其二級(jí)結(jié)構(gòu)為高度的ɑ-螺旋結(jié)構(gòu)，是一種天然的手性選擇劑。BSA可與多種陽離子、陰離子和其他小分子物質(zhì)結(jié)合，已成功地用于電化學(xué)手性傳感器中。然而，由于蛋白質(zhì)對(duì)氧化還原活性位點(diǎn)具有屏蔽作用，會(huì)阻礙電子傳遞而制約BSA的應(yīng)用范圍。因此，增加BSA與電極之間的電子傳遞速率是構(gòu)建電化學(xué)傳感器的關(guān)鍵。

該文使用還原氧化石墨烯和納米鉑進(jìn)行復(fù)合，而后通過BSA在納米鉑表面自組裝形成復(fù)合手性材料并修飾在玻碳電極表面(BSA/PtNPs/rGO/GCE)，構(gòu)建手性電化學(xué)傳感器。利用掃描電子顯微鏡(SEM)表征了修飾界面的表面形態(tài)，并用電化學(xué)方法研究了該手性界面與MPEA對(duì)映體的相互作用。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑和儀器

高藜蘆胺對(duì)映體(R-1-(4-甲氧基苯基)乙胺，R-MPEA,96%；S-1-(4-甲氧基苯基)乙胺，SMPEA,98%)購于百靈威試劑公司(中國，北京)，氧化石墨烯(GO)購于納米先鋒納米材料科技有限公司(中國，南京)，六水氯鉑酸和硼氫化鈉購自Sigma Chemical Co.(St.Louis,MO,美國)，牛血清白蛋白(BSA,98%)購于百靈威試劑公司(中國北京)。工作緩沖溶液為0.10 mol/L磷酸緩沖溶液(PBS,pH7.4)制備的 5.00 ×10-3mol/L[Fe(CN)6]4-/3-溶液。其余化學(xué)試劑均為分析純，無需進(jìn)一步純化即可直接使用，所有實(shí)驗(yàn)用水均為二次蒸餾水。

所有電化學(xué)測試均在CHI 440A電化學(xué)工作站(中國，上海辰華)上進(jìn)行，標(biāo)準(zhǔn)三電極體系中，鉑絲電極作為對(duì)電極，飽和甘汞電極為參比電極，玻碳電極和修飾過的玻碳電極均為工作電極。掃描電子顯微鏡照片由掃描電子顯微鏡S-4800(SEM,日立，日本)測得。

1.2 金屬石墨烯復(fù)合材料制備

首先，參照文獻(xiàn)制備還原石墨烯和納米鉑復(fù)合材料[16-17]。具體操作如下：稱取10.00 mg氧化石墨烯分散于10.00 mL蒸餾水中，超聲半小時(shí)使其分散均勻。向上述溶液中加入1 mL濃度為2.12 mg/mL六水氯鉑酸溶液。在持續(xù)攪拌條件下，緩慢滴加10.00 mL新制備的NaBH4(0.48 mol/L)溶液于混合溶液中，室溫條件下持續(xù)攪拌24 h。溶液顏色由淺棕色變?yōu)楹谏?，即表明氧化石墨烯已被還原為還原石墨烯。然后將所制得的溶液離心，洗滌并晾干。所得產(chǎn)品標(biāo)記為PtNPs/rGO。

1.3 生物選擇性界面制備

裸玻碳電極(GCE,Φ=4 mm)分別用1.00、0.3和0.05 μm的Al2O3拋光粉打磨拋光，依次在乙醇和二次蒸餾水中超聲清洗，除去Al2O3粉末，在空氣中自然晾干;然后滴涂10.00 μL PtNPs/rGO納米材料到干凈的玻碳電極表面，室溫下晾干。隨后，再滴涂10.00 μL BSA于其上(BSA/PtNPs/rGO/GCE)，晾干備用。

2 結(jié)果分析與討論

2.1 納米材料表征

用SEM對(duì)GO、PtNPs/rGO和BSA/PtNPs/rGO材料進(jìn)行了表征。從圖1A可以看到氧化石墨烯(GO)表面有輕微皺褶;將H4PtCl6和GO混合還原后,可看到還原石墨烯片層上附著有大量的鉑納米顆粒(圖1B);當(dāng)?shù)瓮苛薆SA之后，材料表面有一層薄薄的物質(zhì)包裹其外（圖1C）。同時(shí)使用了X-射線能譜(EDX)對(duì)材料的元素進(jìn)行分析，如圖1D所示，說明金屬鉑被成功地原位還原在石墨烯上。

圖1 (A)GO,(B)PtNPs/rGO,(C)BSA/PtNPs/rGO的SEM形貌;(D)EDX圖像Fig.1 SEM image of nanomaterials:(A)GO,(B)PtNPs/rGO,(C)PtNPs/rGO and BSA,(D)EDX of PtNPs/rGO complex

2.2 不同修飾界面的電化學(xué)響應(yīng)

循環(huán)伏安法(CV)是研究電極表面特性的常用方法，實(shí)驗(yàn)中采用其研究了不同界面在5.00 mmol/L的[Fe(CN)6]4-/3-溶液(pH7.4)中的電化學(xué)行為(掃速0.10 V/s)。從圖2中可以看出裸玻碳電極呈現(xiàn)一對(duì)對(duì)稱的氧化還原峰 (曲線a)，而PtNPs/rGO修飾電極的峰電流比裸玻碳電極高(曲線b)，這是由于PtNPs/rGO納米材料良好的電子傳輸能力所致；修飾上BSA之后，修飾電極的峰電流顯著降低(曲線c)，這是由于BSA阻礙了電子的傳輸。

圖2 不同修飾界面的電化學(xué)響應(yīng)：(a)裸玻碳電極，(b)PtNPs/rGO，(c)BSA/PtNPs/rGOFig.2 The electrochemical response of different interfaces:(a)bare glassy carbon electrode,(b)PtNPs/rGO and(c)BSA/PtNPs/rGO

2.3 生物傳感器界面與高藜蘆胺的選擇性作用

采用差分脈沖伏安法研究了修飾界面與MPEA 對(duì)映體（4.00×10-3mmol/L）的相互作用，測試底液為 5.00×10-3mol/L[Fe(CN)6]4-/3-(pH7.4)溶液。如圖3所示，當(dāng)BSA/PtNPs/rGO/GCE與R或S構(gòu)型MPEA作用后，電流顯著下降，且S構(gòu)型MPEA(曲線a)的電流下降量大于R構(gòu)型MPEA(曲線 b)，兩者峰電流變化差(ΔI=ΔIR-ΔIS)為33 μA。

圖3 傳感界面對(duì)MPEA對(duì)映體的DPV響應(yīng):(a)SMPEA,(b)R-MPEAFig.3 Different pulse voltammetry of the chiral sensing interface to the(a)S-MPEA and(b)R-MPEA

產(chǎn)生這種現(xiàn)象的機(jī)理可能是：當(dāng)BSA/PtNPs/rGO/GCE與R或S構(gòu)型MPEA作用時(shí)，因蛋白質(zhì)BSA的強(qiáng)阻礙電子性，導(dǎo)致電流響應(yīng)信號(hào)降低；其中R構(gòu)型MPEA比S構(gòu)型更能使蛋白質(zhì)多肽鏈伸展，破壞蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)，使BSA以一種更疏松的狀態(tài)存在，有利于電子的傳遞[17],因此R構(gòu)型電流響應(yīng)強(qiáng)于S構(gòu)型，由此產(chǎn)生了與對(duì)映體間的選擇性作用。

圖4 (a)S-MPEA和(b)R-MPEA在不同界面的DPV電流響應(yīng)：(A)裸玻碳電極,(B)PtNPs/rGO/GCE,(C)BSA/PtNPs/rGO/GCEFig.4 DPV current response of(a)S-MPEA and(b)R-MPEA on different interfaces:(A)bare glassy carbon electrode,(B)PtNPs/rGO/GCE,(C)BSA/PtNPs/rGO/GCE

同時(shí)，研究了不同傳感界面的電流響應(yīng)情況。如圖4所示，兩種構(gòu)型的MPEA對(duì)映體在裸玻碳電極(圖A)和PtNPs/rGO修飾電極(圖B)表面的電流響應(yīng)信號(hào)無明顯區(qū)別，說明這兩種電極對(duì)MPEA異構(gòu)體無識(shí)別作用；但MPEA對(duì)映體在PtNPs/rGO/GCE上的電流響應(yīng)顯著增強(qiáng)，說明PtNPs/rGO復(fù)合材料能夠促進(jìn)MPEA對(duì)映體在電極上的電子傳遞。當(dāng)在PtNPs/rGO/GCE上固載了BSA后，兩種構(gòu)型的MPEA在電極表面的電流響應(yīng)信號(hào)如圖4C所示，S-MPEA(曲線a)和R-MPEA(曲線b)的電流響應(yīng)均明顯減小，說明BSA阻礙了MPEA在電極上的電子轉(zhuǎn)移，且對(duì)兩者的電子阻礙作用不同，表現(xiàn)為更利于R-MPEA在電極上的電子轉(zhuǎn)移，因此R-MPEA的電流響應(yīng)信號(hào)明顯大于S-MPEA。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該傳感界面對(duì)MPEA對(duì)映異構(gòu)體有明顯的識(shí)別作用。

2.4R-MPEA、S-MPEA濃度對(duì)選擇性的影響

為研究該手性界面與R-MPEA及S-MPEA作用程度，測定了一系列不同濃度的MPEA對(duì)映體作用后的差分脈沖伏安測試。如圖5所示，曲線 b為 BSA／PtNPs/rGO/GCE與濃度從 1.00×10-4mol/L到4.00×10-3mol/L的RMPEA作用后的峰電流的變化。從圖中可看出，BSA/PtNPs/rGO/GCE與R-MPEA作用后的峰電流的變化均與濃度的增加成反比，線性方程為Ip=101.80-15.04cRMPEA(r=0.9960);當(dāng)BSA/PtNPs/rGO/GCE與濃度從1.00×10-4mol/L 到 4.00×10-3mol/L S-MPEA 作用時(shí)(曲線a)，S-MPEA的電流響應(yīng)大小與濃度的增加成正比，線性方程為：Ip=27.50+18.06cSMPEA(r=0.9961)。這可能是由于S-MPEA與BSA的鍵合作用比R-MPEA弱[17-18]，分子中苯環(huán)可隨意轉(zhuǎn)動(dòng)，當(dāng)濃度增大時(shí)，附著在BSA上的S-MPEA分子中苯環(huán)轉(zhuǎn)動(dòng)至同一平面的概率增大，從而有利于電子的傳遞。

圖5 峰電流與MPEA對(duì)映體的響應(yīng)關(guān)系：1×10-4mol/L～4.0 ×10-3mol/L,(a)S-MPEA,(b)R-MPEAFig.5 Response relationship between peak current and concentration of(a)S-MPEA and(b)R-MPEA:1×10-4mol/L～4.0 ×10-3mol/L

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)通過BSA與PtNPs/rGO復(fù)合材料相互作用，在玻碳電極表面構(gòu)建了一個(gè)簡單可靠的手性傳感界面，用電化學(xué)方法研究該界面與R-或S-MPEA的選擇性研究。由于R-MPEA和SMPEA的空間結(jié)構(gòu)不同，導(dǎo)致它們與BSA呈現(xiàn)不同的作用：低濃度時(shí)，手性表面與R-MPEA作用后峰電流降低比S-MPEA少；當(dāng)MPEA對(duì)映體濃度增大至2.25×10-3mol/L以上時(shí)，該界面對(duì)SMPEA的電流響應(yīng)比同濃度R-MPEA大，說明該傳感界面在不同濃度與R-MPEA和S-MPEA具有不同的作用。低濃度時(shí)，R構(gòu)型MPEA比S構(gòu)型更能使蛋白質(zhì)多肽鏈伸展，破壞蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)，有利于電子的傳遞；高濃度時(shí)，因?yàn)镾-MPEA與BSA的鍵合作用比R-MPEA弱，分子中苯環(huán)可隨意轉(zhuǎn)動(dòng)，當(dāng)濃度增大時(shí)，附著在BSA上的SMPEA分子中苯環(huán)轉(zhuǎn)動(dòng)至同一平面的概率增大，從而有利于電子的傳遞。這為其它探討手性藥物或手性小分子與BSA的作用提供了有價(jià)值的理論數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

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Study on BSA and metal/graphene complex for enantioselective interaction with homoveratrylamine enantiomers

Ran Pei-yao,Song Jin-yi,Xia Qiao,Ma Jiao,Yang Cheng-cheng,Fu Ying-zi*
(School of chemistry and chemical engineering,Southwest University,Chongqing 400715,China)

*通信聯(lián)系人