張忠武 孫信成 詹遠華 柏秀芳 田 軍 楊連勇 康 杰

EMS對豇豆M2群體表型性狀的變異分析

張忠武 孫信成 詹遠華 柏秀芳 田 軍 楊連勇 康 杰

（常德市農(nóng)林科學研究院蔬菜研究所，湖南常德 415000）

為了明確甲基磺酸乙酯（EMS）對豇豆的誘變效果及變異規(guī)律，以豇豆品種銀豇王為試材，對EMS誘導的M2表型性狀遺傳變異進行了遺傳力分析和聚類分析。結(jié)果表明：M2群體性狀表現(xiàn)為始花期提前，始花節(jié)位降低，分枝數(shù)、有效花梗數(shù)和結(jié)莢數(shù)減少，莢條變長；從變異系數(shù)看，分枝數(shù)＞結(jié)莢數(shù)＞有效花梗數(shù)＞始花節(jié)位＞最大莢長＞平均莢長＞始花期；從廣義遺傳力看，分枝數(shù)的廣義遺傳力最高，達到88.7%，其次為有效花梗數(shù)和最大莢長；通過聚類分析，表型變異株占18.3%，其中長莢型材料比較常見，多莢型材料較少。

EMS；誘變；豇豆；表型性狀；變異

植物誘變育種技術(shù)是指人為地利用物理誘變因子、化學誘變因子誘發(fā)植物產(chǎn)生遺傳變異，然后根據(jù)實際的育種目標，經(jīng)過多代人工定向選擇、鑒定、選育植物新品種，同時獲得有價值的植物突變新類型的一種育種方法，它是將常規(guī)育種方法與現(xiàn)代理化技術(shù)結(jié)合而成的現(xiàn)代育種技術(shù)（楊震 等，2016）。具有提高作物突變頻率、擴大突變范圍、改變農(nóng)作物品種單一的不良性狀、克服原有品種缺陷等諸多優(yōu)點，突變性狀通常穩(wěn)定較快，因而縮短了育種周期，較快地提高作物品質(zhì)。植物誘變技術(shù)包括輻射誘變、化學誘變、組織培養(yǎng)、病毒和反向遺傳學操作等（于沐和周秋峰，2017）。甲基磺酸乙酯（EMS）是一種常用的化學誘變劑，能夠誘發(fā)產(chǎn)生高密度的系列等位基因點突變（張敏 等，2011）。EMS所誘發(fā)的突變主要是鳥嘌呤G的N-7位置上被烷基化，使之成為帶1個正電荷的季銨基團，第1位氨基上氫解離，使G不再與C配對而與T配對，從而造成G：C→A：T轉(zhuǎn)換（劉根忠 等，2017）。EMS誘發(fā)突變技術(shù)已廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物誘變育種中（崔清志 等，2013；劉翔，2014），F(xiàn)eiz等（2009）利用EMS誘變技術(shù)創(chuàng)造了2 500株普通軟質(zhì)小麥突變體庫，并推算每隔12 kb有1個突變發(fā)生，是目前報道突變頻率最高的突變體庫。在豆類作物中，前人通過EMS處理，先后育成了大豆（李占軍 等，2005）、四棱豆（全妙華 等，2011）等新品種，也在花生中選出了高產(chǎn)株系（楊富軍 等，2014）。

豇豆（Vigna unguiculata）屬于豆科蝶形花亞科豇豆屬，為一年生草本植物，在世界范圍內(nèi)種植廣泛，主產(chǎn)國有尼日利亞、尼日爾、埃塞俄比亞、突尼斯、中國、印度、菲律賓等。隨著新優(yōu)品種的不斷推廣，配合育苗移栽、地膜覆蓋、溫室大棚等技術(shù)的廣泛應(yīng)用，豇豆的品質(zhì)、產(chǎn)量均有了較大提高。但是，我國豇豆品種資源比較單一，品種間雜交和選育會導致豇豆遺傳多樣性下降和遺傳資源枯竭，給以后的育種工作帶來瓶頸效應(yīng)（楊偉和王四清，2011）。前人在豇豆誘變育種方面取得了一定進展，李艷艷等（2015）通過秋水仙素誘導獲得了豇豆四倍體，但EMS誘變技術(shù)在豇豆育種上的報道并不多見。為了探討EMS誘導對豇豆的變異發(fā)生規(guī)律，本試驗以銀豇王為試材，對EMS誘導的M2表型性狀遺傳變異進行了遺傳力分析和聚類分析，以期為豇豆誘變育種提供有益參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗于2016年3～10月在湖南省常德市農(nóng)林科學研究院蔬菜研究所的科研基地進行。參試豇豆品種為銀豇王，由湖南省常德天成種業(yè)有限責任公司育成，常德市農(nóng)林科學研究院蔬菜研究所于2014年生產(chǎn)，冰柜保存。品種特性：植株蔓生，莢條銀白色，長度55 cm左右，種皮紅褐色，中熟，春季播種至開花45 d左右，夏秋季播種至開花35 d左右，適于長江流域及以南地區(qū)栽培。

1.2 試驗方法

1.2.1 誘變處理 2016年春季用EMS處理豇豆種子：先用清水浸種4 h（常溫18 ℃左右），再用0.9%EMS浸泡8 h，期間每隔30 min攪動1次，使誘變劑與種子均勻接觸，處理后用0.1 mol·L-1Na2S2O3中和20 min，再用流動的自來水漂洗2 h，瀝干水分后播種。

1.2.2 豇豆種植 用規(guī)格為54 cm×28 cm×5.5 cm的72孔塑料穴盤播種，每穴2粒，10 d后移栽到塑料大棚，觀察M1的田間表現(xiàn)。夏季選擇正常結(jié)莢株，將所產(chǎn)種子混合成M2混合群體。M2群體于2016年7月27日播種，漂浮育苗，8月1日移栽于網(wǎng)室大棚。高壟栽培，行距0.75 m（包溝），穴距30 cm，每穴2株，以原始親本材料銀豇王作對照（CK），3 次重復(fù)，總面積 180 m2，總株數(shù) 1 600 株。1.2.3 性狀調(diào)查 田間隨機取樣，M2調(diào)查82株，對照調(diào)查18株。見花后調(diào)查始花期、始花節(jié)位，成熟期調(diào)查分枝數(shù)、有效花梗數(shù)、結(jié)莢數(shù)、最大莢長、平均莢長（王佩芝和李錫香，2006）。

始花期（d）：第1朵花的開放日距播種日的日歷天數(shù)；始花節(jié)位（節(jié)）：從子葉節(jié)數(shù)起，主蔓上第1花序所在的節(jié)位；分枝數(shù)（個）：成熟期主莖上的一級分枝，不論結(jié)莢與否，分枝以長達2節(jié)以上為準；有效花梗數(shù)（個）：成功結(jié)莢的花梗總數(shù)；結(jié)莢數(shù)（個·株-1）：成熟期植株上的所有莢條數(shù)；最大莢長（cm）：豆莢生理成熟期取最長莢條，用鋼卷尺測量莢條首尾兩端的直線距離，彎莢則順彎測量；平均莢長（cm）：達到商品成熟度以上的所有莢條的平均長度。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 19軟件進行統(tǒng)計分析（鄧維斌 等，2012）。聚類分析采用系統(tǒng)聚類組間聯(lián)接法，區(qū)間距離為歐式距離，標準化方式為Z得分，轉(zhuǎn)換度量方式為絕對值。

1.2.5 性狀變異的確定 變異判定方法根據(jù)SPSS 19軟件生成的均值和標準差進行計算。

變異系數(shù)=標準差/均值×100%

均值差=處理均值-對照均值

均值增幅=均值差/對照均值×100%

廣義遺傳力=遺傳方差/表型方差×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 M1的性狀表現(xiàn)

在M1中隨機調(diào)查20株，EMS處理的豇豆始花期和單株結(jié)莢數(shù)均呈負向變異，平均提早2 d開花，結(jié)莢數(shù)減少1.48個·株-1；莢長呈正向變異，比對照長2.63 cm；而有效花梗數(shù)沒有明顯變化（表 1）。

表1 豇豆M1的表型性狀比較

2.2 M2的表型性狀統(tǒng)計

M27個表型性狀的數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果見表2，從均值來看，始花期、始花節(jié)位、分枝數(shù)、有效花梗數(shù)、結(jié)莢數(shù)呈負向變異，最大莢長和平均莢長呈正向變異。也就是說，M2主要表現(xiàn)為始花期提早，有效花梗數(shù)和結(jié)莢數(shù)減少，與M1表現(xiàn)一致；而且始花節(jié)位降低，分枝數(shù)減少，但莢條變長。

從變異系數(shù)看（表2），M2分枝數(shù)的變異系數(shù)最大，達到98.95%，其次為結(jié)莢數(shù)和有效花梗數(shù)，分別為43.59%和40.35%，而始花期、最大莢長、平均莢長的變異系數(shù)較小，僅在7.80%～8.45%之間。變異系數(shù)越大，表明在后代中發(fā)生基因分離和重組后產(chǎn)生的類型越豐富，發(fā)生的變異范圍越大，同時也表明選擇的潛力大，通過多代選擇容易達到預(yù)期育種或創(chuàng)造新種質(zhì)的目標（吳秀紅，2011）。

從廣義遺傳力看（表2），分枝數(shù)的廣義遺傳力最高，達到88.7%，其次為有效花梗數(shù)和最大莢長，而平均莢長和始花節(jié)位的廣義遺傳力較低。廣義遺傳力較高表明其受環(huán)境影響較小，反之受環(huán)境影響較大。因此，對廣義遺傳力較高的性狀如分枝數(shù)、有效花梗數(shù)等，可在早代進行選擇。反之，廣義遺傳力較小的其他性狀，因受環(huán)境影響較大，早代選擇的效果較差，則適于在晚代選擇。

2.3 M2群體的聚類分析

對M2的82個單株（1～120號）及原始親本材料18個單株（226～250號）的表型性狀通過標準化處理后，再進行系統(tǒng)聚類，得到單株的聚類樹狀圖。由圖1可知，在歐式距離為25時，可將100個單株聚類為2個類群，第Ⅰ類有99株，第Ⅱ類只有1株。而第Ⅰ類在距離為13左右處又分為A、B、C 3個類群，其中原始親本材料有12株歸為A類，5株為B類，1株為C類，A、B兩類合計占94.4%，由此可將A、B兩類劃分為EMS處理前的性狀類群，其他劃為表型變異性狀類群。在EMS處理的M282個單株中，A、B兩類共計67株，占81.7%，劃為表型無變異類群；其他15株則劃分為表型變異類群，即表型變異株率為18.3%。

在15個表型變異株中，屬于多莢型的有1株（67號），其花序數(shù)很多，結(jié)莢量也很大，綜合性狀較好，始花期36 d，始花節(jié)位為第8節(jié)，分枝數(shù)3個，有效花梗數(shù)20個，結(jié)莢數(shù)39個·株-1，最大莢長63 cm，平均莢長54 cm；屬于長莢型的有14株。在長莢型中，平均莢長占優(yōu)勢的有4株（7、59、63、91號），最大莢長占優(yōu)勢的有10株（38、101、96、97、78、75、62、92、20、26號）。可見，在M2中莢條變長是其主要特點，但是也能發(fā)現(xiàn)多莢型單株，只是比率較小，遺傳距離較遠，屬于值得關(guān)注的類型。

表2 豇豆M2主要表型性狀的統(tǒng)計結(jié)果

3 結(jié)論與討論

采用EMS誘導豇豆品種銀豇王，M2的表型性狀發(fā)生一定程度的變異，其中始花期、始花節(jié)位、分枝數(shù)、有效花梗數(shù)、結(jié)莢數(shù)呈負向變異，最大莢長和平均莢長呈正向變異，也就是說M2主要表現(xiàn)為始花期提早，始花節(jié)位降低，分枝數(shù)、有效花梗數(shù)和結(jié)莢數(shù)減少，莢條變長。從變異度和遺傳力看，分枝數(shù)的變異系數(shù)最大，廣義遺傳力也最高，其次為有效花梗數(shù)，此兩項有較大選擇潛力，可作為早期篩選中重點關(guān)注的性狀。根據(jù)M2的聚類分析，表型變異類群占比18.3%。表型變異類群中，長莢型材料比較常見，而多莢型材料相對較少，且是遺傳距離最遠的類型，值得關(guān)注。

研究表明，經(jīng)EMS誘導后，番茄在M1發(fā)生育性下降，M2中不僅葉、花、果實、株型發(fā)生變異，而且有DNA的變化（楊建華 等，2014）；豇豆M1不僅種子發(fā)芽力下降（張忠武 等，2016），分枝數(shù)和結(jié)莢數(shù)也有變化（張忠武 等，2017）。本試驗發(fā)現(xiàn)，銀豇王經(jīng)過EMS處理后，M2分枝數(shù)的變異系數(shù)最大，其他性狀也有一定程度變異，與吳秀紅（2012）在大豆上的研究結(jié)論一致。

雖然化學誘變產(chǎn)生有益突變的頻率還不夠高，且EMS誘變劑的點突變是相對細微的變化，但與遺傳工程相結(jié)合，應(yīng)用前景仍然廣闊。本試驗通過對EMS誘導的豇豆M2的表型變異分析，描述了表型性狀的變異特征，其中莢條變長為主要特征，莢條增多也有發(fā)生，對豇豆化學誘變育種具有一定的指導意義。本試驗對EMS處理后的豇豆M2表型性狀進行了統(tǒng)計分析，但在DNA上是否表現(xiàn)為多態(tài)性，尚需檢驗。另外，在M2中表現(xiàn)為變異型的單株，是否在后代中具有一定的遺傳穩(wěn)定性，還有待于進一步研究。

圖1 豇豆M2群體的聚類分析結(jié)果

崔清志，劉曉虹，陳惠明．2013．EMS誘變技術(shù)研究進展．湖南農(nóng)業(yè)科學，（5）：7-9．

鄧維斌，唐興艷，胡大權(quán)，周玉敏．2012．SPSS 19（中文版）統(tǒng)計分析實用教程．北京：電子工業(yè)出版社．

李艷艷，周鴻章，戶秋穩(wěn)，楊陽，張蜀寧．2015．豇豆四倍體的誘導及鑒定．中國蔬菜，（1）：28-31．

李占軍，魏玉昌，杜連恩．2005．大豆新品種化誘5號的選育及栽培技術(shù)．河北農(nóng)業(yè)科學，9（2）：63-64．

劉根忠，王云飛，孟祥飛，張余洋，葉志彪．2017．EMS誘變的‘里格爾87-5’番茄M2群體突變體表型及其抗壞血酸研究．園藝學報，44（1）：120-130．

劉翔．2014．EMS誘變技術(shù)在植物育種中的研究進展．激光生物學報，23（3）：197-201．

全妙華，陳東明，蔣向輝．2011．四棱豆新品種湘棱豆3號的選育．中國蔬菜，（16）：112-114．

王佩芝，李錫香．2006．豇豆種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標準．北京：中國農(nóng)業(yè)出版社．

吳秀紅．2011．春大豆EMS誘變M1、M2代主要農(nóng)藝性狀的遺傳變異及相關(guān)性．大豆科學，30（5）：760-763．

吳秀紅．2012．EMS對不同大豆品種M2代農(nóng)藝性狀的影響．農(nóng)學學報，2（5）：29-31．

楊富軍，王紹倫，高華援，劉海龍，周玉萍，李春潔，朱統(tǒng)國，孫曉蘋，李曉偉．2014．不同基因型花生EMS誘變條件分析及突變系篩選．安徽農(nóng)業(yè)科學，（33）：11778-11781．

楊建華，崔霞，常培培，李翠，李云洲，梁燕．2014．EMS誘變番茄自交系TTD302A的突變表型鑒定和分析．中國蔬菜，（4）：21-28．

楊偉，王四清．2011．襄陽市豇豆生產(chǎn)現(xiàn)狀及發(fā)展思路．湖北農(nóng)業(yè)科學，50（22）：4541-4543．

楊震，彭選明，彭偉正．2016．作物誘變育種研究進展．激光生物學報，25（4）：302-308．

于沐，周秋峰．2017．小麥誘發(fā)突變技術(shù)育種研究進展．生物技術(shù)通報，33（3）：45-51．

張敏，楊艷，康兆茹，李凌．2011．EMS誘變南高叢越橘及抗旱突變體的篩選．西南師范大學學報：自然科學版，36（3）：132-137．

張忠武，楊友偉，孫信成．2016．EMS處理對豇豆種子萌發(fā)的生理生化效應(yīng)及EMS處理半致死劑量的研究．江漢大學學報：自然科學版，44（4）：305-310．

張忠武，孫信成，楊友偉，田軍，楊連勇，詹遠華，柏秀芳，劉峰．2017．EMS處理對豇豆生長發(fā)育的影響．熱帶作物學報，38（2）：1-7．

Feiz L，Martin J M，Giroux M J．2009．Creation and functional analysis of new puroindoline alleles in Triticum aestivum．Theoretical and Applied Genetics，118（2）：247-257．

Abstract：To clarify the mutagenic effect and variation rule of EMS on cowpea，this study took‘Yinjiangwang’ as tested material，and carried out genetic and cluster analysis on phenotypic traits in cowpea M2population induced by EMS. The results indicated that cowpea M2population showed the following changes：early flowering in advance，lower first flower position，decrease numbers of branch，effective pedicel and pod，elongate tender pod. The coefficient variation of agronomic characters was in sequence of branch number＞pod number＞effective pedicel numbers＞first flowering node＞maximum pod length＞average pod length＞flowering stage. And the broad value of heritability in branch number had reached the highest as 88.7%，followed by effective pedicel numbers and maximum pod length. Clustering analysis showed that the phenotype mutant strain accounted for 18.3%，among which the long-pod material was very common，while the multi-pod material was less.

Key words：EMS；Mutation；Cowpea；Phenotypic trait；Variation

Variation Analysis of Phenotypic Traits in Cowpea M2Population by EMS

ZHANG Zhong-wu，SUN Xin-cheng，ZHAN Yuan-hua，BAI Xiu-fang，TIAN Jun，YANG Lian-yong，KANG Jie
（Vegetable Institute，Changde Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Changde 415000，Hunan，China）

張忠武，男，高級農(nóng)藝師，專業(yè)方向：蔬菜育種與栽培，E-mail：tczyzzw@163.com

2017-03-15；接受日期：2017-08-22

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目（CARS-25-G-32）