秦 蕾 梁 燕默 寧 張 洋 趙貴葉

辣椒種質(zhì)資源TMV抗性的鑒定與評(píng)價(jià)

秦 蕾 梁 燕*默 寧 張 洋 趙貴葉

（西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院，陜西楊凌 712100）

對(duì)來(lái)源于國(guó)家蔬菜種質(zhì)資源中期庫(kù)的51份辣椒種質(zhì)資源進(jìn)行煙草花葉病毒（TMV）的田間抗性調(diào)查。結(jié)果顯示，各種質(zhì)病情指數(shù)在17.04～75.56之間，有14份種質(zhì)田間表現(xiàn)出了TMV抗性。各種質(zhì)抗性分布基本符合正態(tài)分布，略向感病區(qū)域偏離。將篩選出的14份抗病材料和7份感病材料進(jìn)行TMV苗期人工接種抗性鑒定，21份種質(zhì)的病情指數(shù)在6.28～65.48之間，獲得抗病材料15份。相關(guān)分析結(jié)果表明，TMV田間成株自然發(fā)病病情指數(shù)與苗期人工接種鑒定病情指數(shù)的相關(guān)系數(shù)r=0.789，呈極顯著相關(guān)。結(jié)合田間抗性調(diào)查和人工接種抗性鑒定結(jié)果，利用12對(duì)與L基因連鎖的分子標(biāo)記對(duì)13份TMV抗病種質(zhì)進(jìn)行分子鑒定，6份材料中共檢測(cè)到6個(gè)抗性分子標(biāo)記?？筎MV辣椒種質(zhì)的主要農(nóng)藝性狀表現(xiàn)出一定的多樣性。

辣椒；種質(zhì)資源；TMV抗性；鑒定

辣椒（Capsicum annuum L.）為茄科辣椒屬一年生或多年生植物，在全國(guó)20多個(gè)省、市、自治區(qū)都有栽培。病毒病一直是威脅辣椒生產(chǎn)的重要因秦蕾，女，博士研究生，主要從事辣椒TMV抗性基因挖掘與功能研究，E-mail：qinlei@nwsuaf.edu.cn

常引起辣椒葉片壞死、枯斑、褪綠，植株矮化，落花、落果，對(duì)辣椒生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失。目前，世界各地鑒定出侵染辣椒的病毒有30余種，其中煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）是威脅辣椒生產(chǎn)的主要病毒。

TMV在世界范圍內(nèi)普遍發(fā)生，尤其易感染煙草、番茄、辣椒等茄科作物。TMV主要通過(guò)植物種子和汁液摩擦傳毒，通過(guò)植物的維管組織，迅速侵染植株幼嫩組織，在葉片上產(chǎn)生淺綠或深綠色的病斑，影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育（程秉銓和彭湘儒，1994；Cheng et al.，2000；李明福 等，2012）。辣椒TMV抗性主要由L基因控制，L基因也是辣椒對(duì)煙草花葉病毒屬最有效的抗病基因之一（Lefebvre et al.，1995）。Tomita等（2011）通過(guò)圖位克隆獲得L3基因，并利用同源克隆的方法獲得了L的其他 6 個(gè)等位基因：L1、L1a、L1c、L2、L2b、L4，但是高效L基因主要存在于辣椒野生種當(dāng)中。選育抗病品種是防治辣椒TMV最有效的措施之一。本試驗(yàn)對(duì)51份辣椒種質(zhì)進(jìn)行田間TMV抗性調(diào)查及苗期抗性評(píng)價(jià)，并利用L基因的相關(guān)分子標(biāo)記對(duì)辣椒種質(zhì)進(jìn)行TMV抗性基因鑒定，以期為辣椒抗性遺傳改良及抗病品種選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試?yán)苯贩N質(zhì)來(lái)自國(guó)家蔬菜種質(zhì)資源中期庫(kù)，選取51份經(jīng)初步純化的種質(zhì)作為供試材料，材料名稱和來(lái)源地詳見(jiàn)表1。TMV鑒定毒源TMV-U1株系由西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院番茄種質(zhì)資源課題組提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 辣椒田間TMV抗性鑒定及農(nóng)藝性狀調(diào)查試驗(yàn)于2015～2016年在西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院蔬菜基地進(jìn)行。1月播種，4月上旬定植。每份材料種植30株，隨機(jī)區(qū)組排列，株距35 cm，行距50 cm。定植30 d后，采集感病材料疑似發(fā)病葉片，液氮速凍，提取葉片總RNA，利用TMVCP特異引物（F：TCTTGTCATCAGCGTGGGC；R：AACAGTGCTGTGACTAGCGGGT）對(duì)田間疑似發(fā)病葉片進(jìn)行PCR鑒定，確定辣椒田間病害為TMV。農(nóng)藝性狀調(diào)查項(xiàng)目根據(jù)《辣椒種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》進(jìn)行（李錫香和張寶璽，2006），試驗(yàn)數(shù)據(jù)取兩年數(shù)據(jù)的平均值。

表1 參試?yán)苯贩N質(zhì)名稱及來(lái)源

1.2.2 TMV苗期人工接種抗性鑒定 從田間TMV調(diào)查結(jié)果進(jìn)一步篩選21份辣椒種質(zhì)進(jìn)行苗期人工接種抗性鑒定，以七井燈開(kāi)椒為感病對(duì)照。2016年7月15日將辣椒種子在55 ℃下溫湯浸種催芽，播種于10 cm×10 cm 的育苗缽中，放置于人工氣候箱培養(yǎng)。育苗期間控制白天溫度25 ℃，夜間溫度 23 ℃。

辣椒幼苗4葉期進(jìn)行人工摩擦接種，每個(gè)材料3次重復(fù)，每重復(fù)15株。TMV-U1株系接種20 d后采摘TMV發(fā)病葉片，加入10倍于鮮葉質(zhì)量的0.01 mol·L-1磷酸緩沖液（PBS，pH=7.0）中，搗碎后用雙層紗布過(guò)濾，濾液立即用于接種。接種后，將幼苗置于20～28 ℃光照培養(yǎng)箱中誘發(fā)病害。接種5 d后調(diào)查局部癥狀，20 d后調(diào)查系統(tǒng)癥狀，記錄病株數(shù)及病級(jí)。計(jì)算病情指數(shù)，進(jìn)行抗性分類。TMV抗性調(diào)查的病情指數(shù)計(jì)算及抗性級(jí)別的劃分均依據(jù)《辣椒種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》（李錫香和張寶璽，2006）。

病情指數(shù)（DI）=Σ（病級(jí)數(shù)值×該病級(jí)株數(shù)）/（病級(jí)最高值×調(diào)查總株數(shù)）×100

1.2.3 TMV抗性的分子標(biāo)記鑒定 利用已報(bào)道的12對(duì)與L基因連鎖的分子標(biāo)記（表2）對(duì)TMV抗病種質(zhì)進(jìn)行分子鑒定。采用CTAB法提取植物基因組DNA，采用1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA的質(zhì)量和濃度，并將濃度稀釋至100 ng·μL-1，于-20 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆茫⊿un et al.，2012）。PCR 反應(yīng)體系為 20 μL：PCR-mix（2×Es Taq MasterMix）10 μL，模板 DNA 1.0 μL，引物（10 μmol·L-1）0.8 μL，ddH2O 補(bǔ) 齊 至 20μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 min，52 ℃退火40 s，72 ℃延伸2 min，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

表2 試驗(yàn)所用引物

1.2.4 相關(guān)性分析 利用SPSS軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析及構(gòu)建回歸方程。利用ORIGIN軟件進(jìn)行次數(shù)分布圖的繪制。

圖1 辣椒植株的TMV鑒定結(jié)果

2 結(jié)果與分析

2.1 辣椒種質(zhì)TMV抗性的田間鑒定結(jié)果

經(jīng)TMV-CP特異性引物擴(kuò)增，田間發(fā)病植株感染了TMV（圖1）。田間成株自然發(fā)病抗病性調(diào)查結(jié)果顯示（表3），供試51份材料病情指數(shù)為17.04～75.56。其中抗病材料3份，占5.88%，這3份材料的葉片僅有輕微的花葉或無(wú)癥狀；中抗材料11份，占21.57%，表現(xiàn)為植株少部分葉片呈現(xiàn)花葉，部分植株心葉微皺；感病材料31份，占60.78%，植株多數(shù)葉片花葉，心葉皺縮；高感材料6份，占11.76%，葉片表現(xiàn)為嚴(yán)重花葉和心葉畸形、皺縮，植株矮化；根據(jù)材料抗性分級(jí)，51份辣椒種質(zhì)抗性分級(jí)符合正態(tài)分布，峰值向感病材料偏離（圖 2）。

表3 辣椒種質(zhì)TMV抗性田間鑒定結(jié)果

表4 辣椒種質(zhì)TMV抗性人工接種鑒定結(jié)果

圖2 辣椒種質(zhì)對(duì)TMV抗性級(jí)別的次數(shù)分布

2.2 辣椒種質(zhì)TMV抗性的人工接種鑒定

根據(jù)田間TMV抗性調(diào)查結(jié)果（表3），共篩選出抗病辣椒種質(zhì)14份，另選5份感病材料、2份高感材料，進(jìn)行苗期人工接種抗性鑒定。結(jié)果顯示（表4），參試材料的病情指數(shù)分布在6.28～65.48之間。其中高抗材料2份、抗病材料7份、中抗材料6份、感病材料6份。對(duì)TMV田間鑒定病情指數(shù)與苗期人工接種鑒定病情指數(shù)進(jìn)行抗病性相關(guān)分析，結(jié)果表明，二者的相關(guān)系數(shù)r=0.789，達(dá)到極顯著水平，說(shuō)明苗期抗性鑒定可以反映該種質(zhì)的田間成株抗性水平。以各種質(zhì)苗期鑒定病情指數(shù)為X，以田間成株自然發(fā)病病情指數(shù)為y，回歸方程為y=19.176+0.575X。依據(jù)該回歸方程可以預(yù)測(cè)各種質(zhì)田間自然發(fā)病的病情指數(shù)（表4）。

2.3 辣椒種質(zhì)TMV抗性的分子標(biāo)記鑒定

利用12對(duì)已報(bào)道的辣椒TMV抗性基因相關(guān)的分子標(biāo)記對(duì)16份材料進(jìn)行鑒定，包括田間及人工接種鑒定篩選出的13份抗病種質(zhì)CA05、CA06、CA08、CA12、CA14、CA20、CA21、CA34、CA43、CA75、CA79、CA80、CA165和3份感病種質(zhì)CA18、CA42、CA56。結(jié)果表明（圖3），CA06具有3、6、12號(hào)抗病分子標(biāo)記；CA14具有12號(hào)抗病分子標(biāo)記；CA34具有4號(hào)抗病分子標(biāo)記；CA79具有1、3、4號(hào)抗病分子標(biāo)記；CA80具有3、4、9號(hào)抗病分子標(biāo)記；CA165具有4號(hào)抗病分子標(biāo)記。其余7份種質(zhì)在以上12對(duì)分子標(biāo)記中未表現(xiàn)抗性；參試的16份種質(zhì)均不含有2、5、7、8、10、11號(hào)分子標(biāo)記（圖3）。

2.4 抗TMV辣椒種質(zhì)的主要農(nóng)藝性狀

基于田間抗性調(diào)查和苗期人工接種鑒定結(jié)果，從51份供試?yán)苯凡牧现泻Y選獲得抗病材料13份，其中3份來(lái)自四川、2份來(lái)自云南，陜西、江蘇、湖北、河南、湖南、安徽、山東、廣東各1份，主要集中在我國(guó)中、西部地區(qū)?？筎MV辣椒種質(zhì)的主要農(nóng)藝性狀表現(xiàn)出一定的多樣性（表5），始花節(jié)位為第8～18節(jié)；果形包括線形2份、羊角形4份、錐形1份、牛角形3份、指形3份；單果質(zhì)量最小為2.60 g，最大為30.80 g；株型主要為半直立，2份直立，無(wú)開(kāi)展株型；7份材料分枝性中等，2份分枝性強(qiáng)，4份分枝性弱，抗病種質(zhì)較感病材料株型緊湊。

圖3 辣椒種質(zhì)TMV抗性分子標(biāo)記篩選結(jié)果

表5 抗TMV辣椒種質(zhì)資源的主要農(nóng)藝性狀

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)通過(guò)田間抗性調(diào)查和苗期人工接種抗性鑒定，在51份辣椒種質(zhì)中篩選出TMV抗病種質(zhì)13份，這些抗病資源可以為今后的TMV抗性品種選育提供種質(zhì)基礎(chǔ)。黃啟中等（2004）對(duì)280份辣椒種質(zhì)進(jìn)行了TMV和黃瓜花葉病毒（CMV）的田間調(diào)查和人工抗病性鑒定，獲得3份抗原材料；王述彬等（2001）從154份辣椒種質(zhì)資源中鑒定出5份抗TMV材料、11份抗CMV材料。吳躍勇和崔德祥（2007）對(duì)貴州地區(qū)的辣椒種質(zhì)進(jìn)行了TMV抗性鑒定，鑒定出的抗病材料僅占測(cè)試材料的7.6%；王飛等（2010）在74份泰國(guó)辣椒種質(zhì)中篩選出7份TMV抗性材料；姚明華等（2012）在引進(jìn)的42份非洲辣椒材料中篩選出9份TMV抗性材料。以往研究篩選到的抗原材料相對(duì)較少，所包含的抗病基因也不明確。本試驗(yàn)對(duì)51份辣椒種質(zhì)進(jìn)行田間抗性鑒定，結(jié)果表明，TMV的抗性分級(jí)向感病偏移，人工接種鑒定到的抗病材料也大多表現(xiàn)為抗病及中抗，無(wú)免疫材料。目前，辣椒TMV抗性基因L已被克隆，本試驗(yàn)利用已報(bào)道的12對(duì)與L基因連鎖的分子標(biāo)記對(duì)13份抗病種質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果有6份種質(zhì)含有抗病分子標(biāo)記，但是，這12對(duì)分子標(biāo)記均無(wú)法有效區(qū)分抗病材料與感病材料，這種現(xiàn)象可能是由于12對(duì)分子標(biāo)記來(lái)源于L基因的不同等位基因，導(dǎo)致不同抗病材料的分子標(biāo)記結(jié)果不同，而未篩選出標(biāo)記的抗病材料可能含有其他TMV抗性相關(guān)基因，其抗病機(jī)制有待進(jìn)一步研 究（Kim et al.，2008；Tomita et al.，2008；Yang et al.，2009；?zkaynak et al.，2014）。

辣椒TMV抗性與農(nóng)藝性狀的相關(guān)性分析結(jié)果顯示，辣椒TMV抗性與其他農(nóng)藝性狀之間并不存在顯著的相關(guān)性（數(shù)據(jù)未列出）。本試驗(yàn)中，13份抗病辣椒材料株型主要為半直立，2份直立，無(wú)開(kāi)展株型；7份材料分枝性中等，2份分枝性強(qiáng)，抗病材料較感病材料株型緊湊。此外，抗病材料始花節(jié)位大多高于11，高于感病材料，即花期較晚的材料中，抗病性強(qiáng)的比率較高。耿廣東等（2009a，2009b）研究表明，植株性狀（側(cè)芽個(gè)數(shù)、株高、葉片縱橫比、莖粗）、果實(shí)性狀（果皮厚度、單果質(zhì)量）與辣椒白粉病抗性相關(guān)。鄒學(xué)校等（2004）利用灰色關(guān)聯(lián)方法分析了40份湖南地方辣椒品種和12個(gè)雜交組合，結(jié)果表明辣椒TMV抗性與始花節(jié)位、株高、開(kāi)展度、分枝數(shù)等植株性狀的關(guān)系較近。本試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)辣椒對(duì)TMV的抗性強(qiáng)于甜椒，但是抗性是否與辣椒素含量相關(guān)還有待進(jìn)一步研究。除了進(jìn)行苗期人工接種鑒定外，開(kāi)發(fā)有效的分子標(biāo)記對(duì)于辣椒TMV抗性材料的篩選具有重要意義。目前辣椒TMV抗性相關(guān)分子標(biāo)記主要來(lái)自L基因，未來(lái)的工作需要挖掘鑒定其他TMV抗性基因，開(kāi)發(fā)來(lái)源更廣泛的分子標(biāo)記用于辣椒TMV種質(zhì)的篩選。

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Abstract：Fifty-one pepper（Capsicum annuum L.）local varieties were selected as experimental material for identifying their resistance to TMV in fields. The result showed that 14 collections were resistant to TMV and the disease index of each collection was 17.04-75.56. The resistance distribution of various varieties was normal with a little deviation from the disease infectious area. Resistance identification in TMV seedling stage by artificial inoculation was carried out on these 14 disease resistant material and 7 susceptible material. The disease indexes of 21 varieties were 6.28-65.48，and 15 of them were disease resistant. The results of correlation analysis indicated that the correlation coefficient between TMV field plant natural disease occurrance index and artificial inoculation identification disease index was r=0.789，a significant positive correlation. Twelve molecular markers from TMV resistant gene L were used to identify the 13 selected pepper germplasm resources. Six resistant molecular markers were detected from 6 TMV resistant germplasm resources. The major agronomic traits of TMV resistant pepper germplasm resources showed certain diversity.

Key words：Pepper；Germplasm resources；TMV resistance；Identification

Identif i cation and Evaluation of Resistance to TMV in Pepper（Capsicum annuum L.）Germplasm Resources

QIN Lei，LIANG Yan*，MO Ning，ZHANG Yang，ZHAO Gui-ye
（College of Horticulture，Northwest A&F University，Yangling 712100，Shaanxi，China）

*通訊作者（Corresponding author）：梁燕，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事番茄遺傳育種及蔬菜種質(zhì)資源研究，E-mail：liangyan@nwsuaf.edu.cn

2017-03-13；接受日期：2017-08-14

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2013BAD01B04-14）