劉魯娟， 李翔宇， 陳 歡， 侯宏衛(wèi)*， 胡清源*

(國家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心，河南鄭州 450001)

乙醛在參比卷煙2R1F中含量為1 110～2 101 微克/支煙[1]，是卷煙煙氣中最主要的致癌物之一，且在大鼠體內(nèi)乙醛是內(nèi)分泌系統(tǒng)和神經(jīng)元對尼古丁反應(yīng)的增強劑，表現(xiàn)為協(xié)同效應(yīng)[2]，世界衛(wèi)生組織(WHO)煙草控制框架公約(FCTC)將其列為煙氣優(yōu)先管制污染物[3]。同時，人體可以通過代謝乙醇以及脂質(zhì)的過氧化產(chǎn)生內(nèi)源性的乙醛[4 - 5]。大量研究表明乙醛具有遺傳毒性[6]，國際癌癥研究機構(gòu)(IARC)將其列為2B類致癌物(IARC,2012)[7]。

乙醛可以與脫氧鳥苷反應(yīng)形成N2-亞乙基-2′-脫氧鳥苷(Ethylidene-dG)和一對非對映異構(gòu)體(6S,8S)和(6R,8R)-1,N2-丙醇-2′-脫氧鳥苷(Propano-dG)[8 - 10](圖1)。其中，Ethylidene-dG在單核苷酸狀態(tài)下不穩(wěn)定，需要還原為N2-乙基-2′-脫氧鳥苷(Et-dG)才能被檢出。因此，準(zhǔn)確測定DNA中的乙醛-DNA加合物，對于評估DNA受到的損傷程度及可能的致癌風(fēng)險具有重要意義。

圖1 乙醛-DNA加合物的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of acetaldehyde-DNA adducts

Fang等[11]利用32P-后標(biāo)記技術(shù)首次檢測出體外乙醛暴露小牛胸腺DNA產(chǎn)生的乙醛-DNA加合物為N2-乙基-2′-脫氧鳥苷，該方法的靈敏度較高，但不能提供加合物的結(jié)構(gòu)信息，且標(biāo)記效率不確定，重現(xiàn)性差[12]。李木蘭[13]利用紫外光譜移動法檢測出乙醛暴露小牛胸腺DNA后256 nm處的吸收峰向長波方向移動，可初步判斷乙醛能夠加合到DNA中的親核位點，但該方法靈敏度和專一性較低。Singh等[9]利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)檢測出飲酒之后人體白細(xì)胞中的N2-乙基-2′-脫氧鳥苷；Li等[14]采用LC-MS/MS方法檢測出人體白細(xì)胞中N2-乙基-2′-脫氧鳥苷的含量在吸煙者戒煙前后存在顯著差異(戒煙之后下降了28%，P=0.02)。該方法選擇性好、靈敏度高且使用同位素作為內(nèi)標(biāo)可以對加合物進行準(zhǔn)確定量和結(jié)構(gòu)分析等優(yōu)勢，成為了檢測DNA加合物的理想技術(shù)[15 - 16]。本研究基于LC-MS/MS技術(shù)，建立了一種同時檢測DNA中Ethylidenet-dG和Propano-dG的方法，該方法具有靈敏度高、分析時間短、特異性強等特點。以體外小牛胸腺DNA為模型，優(yōu)化了L-精氨酸的用量并探討了乙醛-DNA加合物的含量與乙醛染毒劑量和染毒時間之間的關(guān)系，檢測外源性乙醛暴露所產(chǎn)生的DNA加合物，為乙醛暴露的風(fēng)險評價提供依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

AB SCIEX三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國，加州應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)；Agilent 1200高效液相色譜(美國，安捷倫公司)；NanoDrop 2000超微量分光光度計(美國，賽默飛科技公司)；恒溫培養(yǎng)箱(美國，賽默飛科技公司)；Strata-X聚合物小柱(33 μm,30 mg/1mL，廣東菲羅門科學(xué)儀器有限公司)；Milli-Q水純化系統(tǒng)(德國，默克集團)；Analyst 1.5.1數(shù)據(jù)采集與處理軟件。

脫氧核糖核酸酶Ⅰ、堿性磷酸酶(美國紐英倫生物技術(shù)公司)，磷酸二酯酶Ⅰ、乙醛溶液(99.0%)和小牛胸腺DNA(美國西格瑪公司)，甲醇(韓國德山試劑公司)，NaBH3CN、L-精氨酸(上海阿拉丁試劑公司)，標(biāo)準(zhǔn)品Et-dG、Propano-dG和內(nèi)標(biāo)物[15N5]Et-dG、[15N5]Propano-dG(上海有機所合成，純度分別為99.7%、99.97%、99.6%和99.8%)，試劑均為色譜純。實驗用水為超純水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取2 mg Et-dG、Propano-dG、[15N5]Et-dG和[15N5]Propano-dG，用甲醇配制成0.2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，存于棕色試劑瓶中，于冰箱中-20 ℃貯存。

1.3 乙醛暴露小牛胸腺DNA

取400 μg小牛胸腺DNA，加入1 mL不同濃度(0.001、0.01、0.05、0.1、0.5和1.0 mmol/L)的乙醛溶液，乙醛溶液用0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH=7.4)配制，對照組加入同等體積的PBS。上述溶液中各加入8.0 mg的L-精氨酸，放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中24 h；用2倍體積的冰乙醇沉淀DNA并終止反應(yīng)，12 000×g離心5 min，去掉上清，用70%的乙醇水清洗DNA樣品，得到的DNA團塊晾干并加入200 μL超純水復(fù)溶，用NanoDrop 2000超微量分光光度計在波長260 nm處檢測DNA的含量(對于雙鏈DNA一個吸收單位OD相當(dāng)于50 μg/mL)。不同時間梯度暴露選用1.0 mmol/L乙醛溶液分別暴露0、2、4、10、12、20和24 h。

1.4 樣品前處理

將DNA溶于600 μL的10 mmol/L Tris-HCl/2.5 mmol/L MgCl2溶液/5 mmol/L CaCl2緩沖溶液(pH=7.0)中，加入20 μL濃度為100 ng/mL的[15N5]Et-dG和[15N5]Propano-dG混合內(nèi)標(biāo)。向上述溶液中加入30 mg的NaBH3CN和60單位(U)脫氧核糖核酸酶Ⅰ(DNaseⅠ)，在37 ℃水浴中孵育2 h，隨后加入0.008 U磷酸二酯酶Ⅰ(PI)和30 U堿性磷酸酶(CIP)，在37 ℃水浴中繼續(xù)孵育2 h，將DNA水解為單核苷酸狀態(tài)。水解液上樣至用1 mL甲醇活化、1 mL水平衡后的 Strata-X聚合物固相萃取(SPE)小柱，然后使用1 mL水和1 mL 10%的甲醇水溶液淋洗，最后用1 mL 50%的甲醇水溶液洗脫，收集洗脫液，過0.22 μm有機相尼龍濾膜，濾液進行LC-MS/MS分析。

1.5 色譜質(zhì)譜條件

色譜條件：Thermo AcclaimTMPolar AdvantageⅡC18色譜柱(150×4.6 mm，3.0 μm)，柱溫30 ℃；流動相A：甲醇，流動相B：超純水；等度洗脫條件：0～15 min：35%A，流速為0.40 mL/min，進樣量為5 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(ESI)，多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)，正離子模式掃描；噴霧電壓：5 500 V，離子源溫度：550 ℃，氣簾氣：20 psi，霧化氣(Gas1)：70 psi，干燥氣(Gas2)：75 psi，碰撞氣：9 psi，入口電壓：10 V，出口電壓：10 V。整個分析過程由Analyst 1.5.1軟件控制。

2 結(jié)果與討論

2.1 L-精氨酸用量的選擇

研究表明，氨基酸類物質(zhì)的存在可以加速乙醛與脫氧鳥苷的反應(yīng)，進而產(chǎn)生Propano-dG加合物[17 - 18]。在體外條件下，實驗選用1.0 mmol/L乙醛暴露小牛胸腺DNA，控制同樣的反應(yīng)條件，實驗組加入精氨酸(對照組不加)，結(jié)果表明體外1.0 mmol/L乙醛暴露條件下加合物Propano-dG在精氨酸的催化作用下才能生成(圖2)，原因可能是堿性氨基酸首先與乙醛反應(yīng)生成希夫堿，然后與另一分子的乙醛發(fā)生邁克爾加成產(chǎn)生2-丁烯基亞胺，最后與脫氧鳥苷上的堿基發(fā)生邁克爾加成-關(guān)環(huán)反應(yīng)，水解脫去氨基即為Propano-dG加合物。實驗優(yōu)化了L-精氨酸的用量，體外1.0 mmol/L乙醛暴露條件下設(shè)置精氨酸用量2、4、6、8和10 mg，分別檢測Et-dG和Propano-dG的含量，結(jié)果顯示隨著精氨酸用量的增加，加合物Et-dG和Propano-dG的含量也隨之增加，而當(dāng)精氨酸用量大于8 mg時，Et-dG的含量有所下降，故L-精氨酸的用量選擇8 mg(圖3)。

圖2 加合物Propano-dG的色譜圖Fig.2 Chromatograms of Propano-dG adducts(a) exposed to 1.0 mmol/L acetaldehyde at 37 ℃ for 24 h;(b) exposed to 1.0 mmol/L acetaldehyde and 8 mg arginine at 37 ℃ for 24 h;(c) chromatogram of stable isotope internal standard.

圖3 不同精氨酸用量對乙醛-DNA加合物Et-dG(a)和Propano-dG(b)含量的影響Fig.3 Effect of different levels of arginine on the content of acetaldehyde-DNA adducts Et-dG(a) and Propano-dG(b)

2.2 色譜柱的選擇

由加合物Propano-dG的結(jié)構(gòu)可知，其存在兩個非對映異構(gòu)體，在色譜圖上表現(xiàn)為兩個色譜峰。為了獲得較好的分離度，對兩種不同的C18色譜柱：Thermo AcclaimTMPolar AdvantageⅡC18(150×4.6 mm，3.0 μm)和Extend-C18(100×4.6 mm,1.8 μm)進行了考察。結(jié)果可見，Extend-C18柱中Et-dG與Propano-dG的一個同分異構(gòu)體出現(xiàn)了共洗脫現(xiàn)象，因此選擇Thermo AcclaimTMPolar AdvantageⅡC18色譜柱(150×4.6 mm，3.0 μm)作為分析柱。

2.3 質(zhì)譜條件的選擇

用蠕動泵以10 μL/min的流速連續(xù)注射，分別將500 ng/mL的Et-dG、Propano-dG、[15N5]Et-dG和[15N5]Propano-dG標(biāo)準(zhǔn)溶液注入ESI離子源中，首先在正離子模式下進行一級質(zhì)譜掃描，得到相應(yīng)的準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+，然后對該準(zhǔn)分子離子峰進行子離子掃描得到碎片離子。選取豐度較高、干擾較小的為定量離子對，為了達(dá)到更高的靈敏度，對去簇電壓(CE)和碰撞能量(DP)等參數(shù)進行了優(yōu)化。分析物及內(nèi)標(biāo)的MRM參數(shù)見表1。

表1 多反應(yīng)監(jiān)測模式下分析物及其內(nèi)標(biāo)的參數(shù)

*The ion for quantification.

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍

準(zhǔn)確移取Et-dG和Propano-dG的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，其濃度梯度為0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 ng/mL，內(nèi)標(biāo)[15N5]Et-dG和[15N5]Propano-dG濃度為2 ng/mL，用HPLC-MS/MS法進行測定，每個樣品進樣3次，以信噪比(S/N)為3確定檢出限。以目標(biāo)物的色譜峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比(y)對其濃度之比(x)進行線性回歸分析，結(jié)果顯示兩種目標(biāo)物都具有良好的線性關(guān)系。目標(biāo)物的標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限(LOD)及定量限(LOQ，S/N=10)見表2。

表2 Et-dG和Propano-dG的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線及LOD和LOQ

2.5 精密度和穩(wěn)定性

用三個質(zhì)控(Quality Control,QC)樣本，低(0.2 ng/mL)、中(2.0 ng/mL)、高濃度(2.0 ng/mL)在同一天內(nèi)平行測定6次得到日內(nèi)精密度，然后再連續(xù)三天分別檢測得到日間精密度，日內(nèi)精密度和日間精密度均小于6%。穩(wěn)定性試驗考察的內(nèi)容包括短期穩(wěn)定性、凍融穩(wěn)定性及長期穩(wěn)定性。該方案中所考察的短期穩(wěn)定性考察3組高、中、低QC樣品在48 h(n=6)內(nèi)的穩(wěn)定性，凍融穩(wěn)定性包括3組高、中、低質(zhì)控樣品分別在3次凍融循環(huán)后的穩(wěn)定性。長期穩(wěn)定性考察3組高、中、低質(zhì)控QC樣品在30 d內(nèi)的穩(wěn)定性(-80 ℃，n=6)。結(jié)果顯示RSD均小于等于10%，結(jié)果見表3。

表3 Et-dG和Propano-dG的精密度和穩(wěn)定性

2.6 回收率試驗

采用空白樣品基質(zhì)加標(biāo)準(zhǔn)品的方法測定方法的回收率，用小牛胸腺DNA作為樣本，在酶水解步驟，選取三個添加水平(0.2、1.0、2.0 ng/mL)加入標(biāo)準(zhǔn)品，每個實驗平行做三次，兩種目標(biāo)物的回收率在96.0%～101.6%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.4%～6.6%之間，證明該方法滿足方法學(xué)要求。

2.7 乙醛-DNA加合物與乙醛暴露的效應(yīng)關(guān)系

對乙醛水溶液暴露DNA中Et-dG和Propano-dG進行檢測分析，根據(jù)目標(biāo)物與其穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)物的保留時間基本保持一致的原理，并結(jié)合所選擇分析離子對對目標(biāo)物進行定性分析。根據(jù)目標(biāo)物及其內(nèi)標(biāo)物陰影面積的比值進行定量分析，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算獲得各個樣品中DNA加合物的濃度，根據(jù)公式：

(1)

計算獲得樣品中DNA加合物相對于核苷酸的含量，結(jié)果乘以108換算成DNA加合物個數(shù)(108個核苷酸)。

將不同乙醛暴露劑量和不同乙醛暴露時間下Et-dG和Propano-dG的含量使用SPSS數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件(19.0版本)進行統(tǒng)計分析。結(jié)果顯示在L-精氨酸的催化作用下，Et-dG和Propano-dG的量隨著乙醛染毒劑量和染毒時間的增加而增加，呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)和時間-效應(yīng)關(guān)系(P<0.003，圖4)，且基本呈線性增長關(guān)系。在DNA分子水平進行的乙醛暴露實驗進一步驗證了在氨基酸類物質(zhì)存在的條件下乙醛與DNA的反應(yīng)活性，乙醛和脫氧鳥苷加合物的定量檢測可用于含乙醛類污染物暴露所致的DNA損傷性研究。

圖4 不同乙醛暴露劑量下(37 ℃，24 h)小牛胸腺DNA中Et-dG(a)和Propano-dG(b)含量；不同染毒時間下(37 ℃，1.0 mmol/L)小牛胸腺DNA中Et-dG(c)和Propano-dG(d)的含量Fig.4 Effect of acetaldehyde exposure dose on Et-dG(a) and Propano-dG(b) formation in calf thymus DNA(Reaction condition:37 ℃,24 h);Effect of acetaldehyde exposure time on Et-dG(c) and Propano-dG(d)(Reaction condition:37 ℃,1.0 mmol/L)

3 結(jié)論

本工作建立了一種靈敏度高、分析時間短、選擇性好且可以同時檢測DNA中的Et-dG和Propano-dG的LC-MS/MS方法。利用此方法檢測了不同濃度和不同時間乙醛暴露條件下小牛胸腺DNA中Et-dG和Propano-dG的量，結(jié)果顯示Et-dG和Propano-dG的量與乙醛暴露劑量成劑量-效應(yīng)關(guān)系和暴露時間成時間-效應(yīng)關(guān)系。本研究從DNA分子水平上驗證了乙醛在氨基酸類物質(zhì)存在條件下的反應(yīng)活性，乙醛中活潑的醛基不需要機體的代謝即可直接進攻親核物質(zhì)DNA，適用于含乙醛類污染物對DNA分子暴露后Et-dG和Propano-dG加合物的生物監(jiān)測。