華 杰,張玉琪,朱 嬌,王 清,雷鍵政

(湖南理工學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院,湖南 岳陽(yáng) 414006 )

從福壽螺卵中提取蝦青素的研究

華 杰,張玉琪,朱 嬌,王 清,雷鍵政

(湖南理工學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院,湖南 岳陽(yáng) 414006 )

研究福壽螺卵中蝦青素的溶劑浸取方法,運(yùn)用正交實(shí)驗(yàn)法對(duì)福壽螺卵中蝦青素的浸取條件進(jìn)行了優(yōu)化,在最優(yōu)浸取條件下,蝦青素的收率達(dá)0.058%; 采用制備型液相色譜儀分離提純蝦青素,對(duì)螺卵蝦青素進(jìn)行了定性分析,推斷該來(lái)源的蝦青素為左旋型(3S,3’S); 探索了兩種大孔樹(shù)脂吸附蝦青素的規(guī)律,實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AB-8樹(shù)脂的吸附平衡時(shí)間為3h,吸附率可達(dá)94.2%,適用于螺卵蝦青素的大規(guī)模工業(yè)分離提純.

福壽螺卵; 蝦青素; 大孔樹(shù)脂; 制備色譜

Abstract: The extraction of astaxanthin from apple snail eggs by solvent leaching was studied,and an orthogonal array design was used to optimize the leaching process.Under the optimum conditions,the recovery of astaxanthin was 0.058%.The obtained crude astaxanthin was further purified by preparative high performance liquid chromatography,and this astaxanthin was confirmed as the left - handed type (3S,3's)by instrumental analysis.Two kinds of macroporous resin were evaluated for the extraction of astaxanthin from snail eggs,and the results show that the adsorption equilibrium time for AB-8 resin is 3 hours,and the adsorption rate could reach 94.2%,indicating the possibility of this resin in the separation and purification of astaxanthin from snail eggs on large-scale industrial application.

Key words: eggs of snails,astaxanthin,macroporous resin,preparative chromatography

0 引言

蝦青素(Astaxanthin,化學(xué)名稱(chēng)為 3,3’-二羥基-β,β’-胡蘿卜素-4,4’-二酮)是一種強(qiáng)抗氧化劑,在抗氧化、著色、促進(jìn)動(dòng)物繁殖、增強(qiáng)人體免疫能力、保護(hù)心腦血管及中樞神經(jīng)等方面具有優(yōu)良的生物學(xué)功能,可以作為自由基清除劑和免疫調(diào)節(jié)劑,在醫(yī)療、食品、保健、化妝品、特種飼料添加劑等方面有著廣泛的應(yīng)用[1].蝦青素可以通過(guò)合成、發(fā)酵和從動(dòng)植物中提取等三種方式獲得.蝦青素有三種光學(xué)異構(gòu)體,即左旋型(3S,3’S)、右旋型(3R,3’R)和內(nèi)消旋型(3S,3’R).人工合成蝦青素主要為三種結(jié)構(gòu)的混合物(3S,3’S占25%、3R,3’R占25%,3S,3’R占50%左右)[2],其抗氧化活性較弱,而紅法夫酵母中的蝦青素是以3 R ,3’R為主,具有部分活性[3].藻源蝦青素是以3S,3’S為主,具有極強(qiáng)的抗氧化活性.近年來(lái)許多研究表明,3S,3’S蝦青素具有重要的生物學(xué)功能,如抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)以及增強(qiáng)機(jī)體免疫力等[4～7]; 藻源蝦青素的安全性已經(jīng)得到了廣泛認(rèn)可,1999年8月美國(guó)FDA批準(zhǔn)蝦青素作為食品營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑及水產(chǎn)品飼料添加劑;日本政府已批準(zhǔn)蝦青素用于食品和飼料添加劑; 加拿大食品監(jiān)察局(FIA)已批準(zhǔn)蝦青素用于水產(chǎn)品飼料添加劑; 2010年11月我國(guó)衛(wèi)生部(第17號(hào)公告)認(rèn)定雨生紅球藻為新資源食品.因此,加強(qiáng)天然蝦青素的研究工作,將有助于促進(jìn)相關(guān)產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展.天然蝦青素除富含在雨生紅球藻以外,還廣泛存在于蝦、蟹、鮭魚(yú)等物種之中[8].福壽螺是一種淡水養(yǎng)殖貝類(lèi),Wu等人[9]研究發(fā)現(xiàn)可以從福壽螺卵及卵巢中提取蝦青素,該專(zhuān)利技術(shù)采取了溶劑超聲波提取、酶解、硅膠柱提純等步驟,提取工藝復(fù)雜、成本較高,而且產(chǎn)品純度不高,產(chǎn)品質(zhì)量有待進(jìn)一步提高.本研究將針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題,探索新的提取方法,同時(shí)提高蝦青素的純度,以便應(yīng)用于對(duì)質(zhì)量要求更高的醫(yī)藥、化妝品行業(yè).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1200高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)、傅立葉紅外光譜儀AVATAR 370(美國(guó)Thermo Nicollet公司)、RE-2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)、DLSB-51/30低溫冷卻液循環(huán)泵(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)、SHB-B95A循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)科工貿(mào)有限公司)、KQ-300DA數(shù)控聲波清洗劑(昆山市超聲儀器有限公司)、TY-1901紫外光譜儀(北京譜析通用儀器有限公司).

二氯甲烷、無(wú)水乙醇、無(wú)水甲醇、石油醚、丙酮、四氯化碳、氯仿、CR薄層層析硅膠均為分析純?cè)噭? AB-8大孔樹(shù)脂、D101大孔樹(shù)脂為工業(yè)品,左旋(3S,3’S)蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司,福壽螺螺卵從養(yǎng)殖場(chǎng)采購(gòu).

1.2 蝦青素定量測(cè)定方法

用分析天平準(zhǔn)確稱(chēng)取6.4mg蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品,將二氯甲烷作為溶劑,用5.0 ml容量瓶定容,得到濃度為1.28 mg·ml-1蝦青素母液; 將配置好的蝦青素母液再稀釋,分別配制濃度為0.00064mg·ml-1,0.00128 mg·ml-1,0.0512mg·ml-1,0.128mg·ml-1,0.1792 mg·ml-1的蝦青素溶液.將稀釋后的蝦青素溶液進(jìn)行HPLC分析,記錄峰面積.以蝦青素含量為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn).在蝦青素的提取過(guò)程中,取樣分析不同萃取條件下所得到的蝦青素浸取液,在相同的色譜條件下,測(cè)定相應(yīng)的峰面積,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)查得產(chǎn)品濃度,根據(jù)浸取液的濃度和體積計(jì)算蝦青素的收率.

色譜分析條件: 色譜柱C18柱(4.6×250mm); 流動(dòng)相: 純甲醇; 流速: 0.5ml·min-1; 柱溫: 25℃; 檢測(cè)波長(zhǎng): 480nm; 進(jìn)樣量: 20μl.

1.3 福壽螺中蝦青素的提取

取一定量的福壽螺卵置于研缽中,用研磨棒將螺卵磨碎,加入無(wú)水乙醇進(jìn)行脫水處理,抽濾后將脫水螺卵轉(zhuǎn)移至燒瓶中,加入萃取劑,浸泡一段時(shí)間后抽濾,得到紅色浸取液,采取減壓蒸餾進(jìn)行濃縮,濃縮液備用.采用正交實(shí)驗(yàn)法考察不同萃取劑的用量、溫度、時(shí)間等因素對(duì)浸取效果的影響,探索最佳浸取條件.根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)法的原理,制定四因素三水平的正交表; 四因素分別為: A萃取劑種類(lèi)、B萃取溫度、C萃取時(shí)間、D萃取劑與螺卵的質(zhì)量比; 各因素的三水平值的范圍見(jiàn)表1.

表1 蝦青素提取條件正交表

1.4 蝦青素的分離純化及定性分析

稱(chēng)取100 g福壽螺卵,用研缽磨碎,加入150ml無(wú)水乙醇,浸泡10min,抽濾,用10 ml無(wú)水乙醇洗滌濾餅,得含水量較低的濾餅,向?yàn)V餅中加入60 ml二氯甲烷,浸泡10min,抽濾,再次用30 ml二氯甲烷浸泡濾餅,過(guò)濾,合并濾液.將濾液在氮?dú)獗Ｗo(hù)下減壓蒸餾,濃縮至5 ml.將濃縮后的溶液用微孔濾膜過(guò)濾,然后通過(guò)半制備型液相色譜進(jìn)行分離,分別收集各個(gè)色譜峰的流出組份,對(duì)各組份進(jìn)行HPLC分析,確定蝦青素的流出峰.在氮?dú)獗Ｗo(hù)下將含蝦青素組份的溶液濃縮,得到蝦青素粗品; 蝦青素粗品再次通過(guò)制備液相色譜進(jìn)行二次分離,得到蝦青素純品,采用儀器分析方法進(jìn)行定性分析.

色譜分離條件: 色譜柱為10×250mm,C18; 流速: 1.0ml·min-1; 檢測(cè)波長(zhǎng): 480nm; 進(jìn)樣量: 1ml; 流動(dòng)相: 純甲醇.

1.5 大孔樹(shù)脂吸附蝦青素的研究

選用AB-8型和D101型大孔樹(shù)脂吸附提純.按廠家提供的預(yù)處理方法,分別采取無(wú)水乙醇浸泡、5 %HCl、2 %NaOH處理,純水洗滌至中性,備用.分別稱(chēng)取2.0g的AB-8和D101樹(shù)脂,倒入2份50ml經(jīng)過(guò)初步脫水處理的福壽螺卵乙醇浸取液內(nèi),并在室溫下將溶液置于300 rpm振蕩器里進(jìn)行震蕩吸附,每隔1h從溶液中取樣進(jìn)行高效液相色譜分析,研究蝦青素含量變化,考察蝦青素的吸附效果.

2 結(jié)果與討論

2.1 蝦青素標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

分別對(duì)0.00064mg·ml-1,0.00128 mg·ml-1,0.0512mg·ml-1,0.128mg·ml-1,0.1792 mg·ml-1的蝦青素溶液進(jìn)行HPLC分析,記錄蝦青素的峰面積,然后以蝦青素濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖.采用Origin7進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程:y=a+bx; 其中a=-7994.47,b=674066.68,R2=0.9987.

2.2 蝦青素浸取條件的優(yōu)化

采用正交實(shí)驗(yàn)法來(lái)考察不同因素對(duì)螺卵中蝦青素的提取效果的影響規(guī)律.參照從雨生紅球藻中提取蝦青素的研究文獻(xiàn)[10～13],選取了幾種常見(jiàn)溶劑(二氯甲烷、無(wú)水乙醇、乙酸乙酯)做浸取劑,同時(shí)采用單因素實(shí)驗(yàn)法確定了浸取時(shí)間、溫度和物料比例等因素的取值范圍.正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果見(jiàn)表2.

表2 螺卵蝦青素提取條件的極差結(jié)果分析

通過(guò)上表極差分析可知,各因素對(duì)蝦青素提取量的影響: 萃取劑種類(lèi)＞萃取時(shí)間＞萃取溫度＞萃取劑與螺卵質(zhì)量比.從福壽螺卵中提取蝦青素的最佳條件是浸取劑為二氯甲烷,提取溫度30℃、提取40min、料液比為l: 2.在最優(yōu)浸取條件下,蝦青素的收率為0.058%.

2.3 產(chǎn)品定性分析

采用半制備型液相色譜儀對(duì)螺卵的溶劑浸取液進(jìn)行制備性分離,每次進(jìn)樣量為1.0 ml,分多次進(jìn)樣,收集含蝦青素的流出峰,合并后通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮,粗產(chǎn)品再次采用HPLC進(jìn)行制備性提純,樣品用于分子結(jié)構(gòu)的鑒定.制備色譜的典型出峰情況如圖1所示,過(guò)載平臺(tái)區(qū)為目標(biāo)收集組份.

圖1 螺卵蝦青素浸取液的制備液相色譜圖

將經(jīng)過(guò)純化的蝦青素樣品用分析型HPLC進(jìn)行分析,測(cè)定產(chǎn)品的純度,典型的色譜圖如圖2所示.從圖2中可以看出,產(chǎn)品中雜質(zhì)含量少.通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照可知,兩者的保留時(shí)間完全吻合.

進(jìn)一步采用紅外光譜分析儀對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行了鑒定,IR分析結(jié)果如圖3所示. 分析圖中的主要特征峰包括: 在3440cm-1處的吸收峰屬于蝦青素六元環(huán)上羥基的伸縮振動(dòng)吸收峰; 2924cm-1、2856cm-1和1457cm-1的吸收峰是亞甲基的特征吸收峰;1597cm-1處的強(qiáng)吸收峰是蝦青素六元環(huán)上羰基的伸縮振動(dòng)吸收峰; 1080cm-1處的吸收峰是蝦青素六元環(huán)上仲醇的吸收峰.通過(guò)與蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品的紅外光譜圖進(jìn)行比對(duì)可知,兩者基本吻合,表明從螺卵中提取的產(chǎn)品為左旋型(3S,3’S)蝦青素.

圖2 螺卵蝦青素純品的HPLC分析

圖3螺卵蝦青素純品的IR分析圖(KBr壓片)

2.4 大孔樹(shù)脂吸附條件的選擇

針對(duì)文[9]中存在的蝦青素提取路線(xiàn)復(fù)雜、成本很高的問(wèn)題,參照文[14,15]采用大孔樹(shù)脂從螺卵中提取蝦青素.考察了兩種大孔樹(shù)脂對(duì)蝦青素的靜態(tài)吸附情況,以D101樹(shù)脂為例,將預(yù)處理好的2.0 g樹(shù)脂加入到螺卵蝦青素浸取液中,并在300rpm的轉(zhuǎn)速下進(jìn)行震蕩吸附,吸附一定時(shí)間后,從浸取液里取樣進(jìn)行高效液相色譜分析,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算浸取液中剩余蝦青素的濃度,從而推算樹(shù)脂吸附蝦青素的量,結(jié)果如圖4所示.

類(lèi)似地,將預(yù)處理好的2.0g AB-8樹(shù)脂加入到上述蝦青素浸取液中,并于300 rpm的轉(zhuǎn)速下進(jìn)行震蕩吸附,每隔一個(gè)小時(shí)進(jìn)行高效液相色譜分析,以震蕩時(shí)間為橫坐標(biāo),蝦青素含量為縱坐標(biāo),得到AB-8樹(shù)脂對(duì)蝦青素的吸附規(guī)律,如圖5所示.

圖4 D101樹(shù)脂吸附蝦青素的規(guī)律

圖5 AB-8樹(shù)脂吸附蝦青素的規(guī)律

從上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出,采用AB-8大孔樹(shù)脂吸附蝦青素,達(dá)到吸附平衡的時(shí)間為3h,吸附率可達(dá)94.2%; 而D101樹(shù)脂所需時(shí)間為5h,吸附率為68.6%.可見(jiàn)AB-8大孔樹(shù)脂對(duì)蝦青素吸附效果較D101樹(shù)脂好,推薦在進(jìn)行柱層析分離螺卵蝦青素浸取液時(shí),選用AB-8樹(shù)脂作為層析介質(zhì).

3 結(jié)論

采用正交實(shí)驗(yàn)對(duì)螺卵蝦青素的浸取條件進(jìn)行了優(yōu)化,研究發(fā)現(xiàn)萃取劑的選擇對(duì)于浸取效率的影響最大,在最佳條件下,以二氯甲烷為浸取劑,浸取溫度30℃、浸取為40 min、料液比為l: 2時(shí),螺卵中的蝦青素的收率可達(dá)0.058%.這表明螺卵中的蝦青素含量雖然沒(méi)有雨生紅球藻中的豐富,但比一般蝦蟹中所含的蝦青素含量高,是一種經(jīng)濟(jì)可行的蝦青素資源.

對(duì)螺卵蝦青素的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了定性分析,通過(guò)與蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行HPLC保留時(shí)間的對(duì)比分析,以及紅外光譜儀的鑒定,判斷該來(lái)源的產(chǎn)品為(3S,3’S)左旋蝦青素,在醫(yī)藥、食品、化妝品等高端市場(chǎng)有良好的應(yīng)用前景.

為了降低蝦青素的提取成本,同時(shí)提高產(chǎn)品品質(zhì),研究了采用大孔樹(shù)脂層析法來(lái)提純螺卵蝦青素的方法.實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AB-8樹(shù)脂具有吸附平衡時(shí)間短、吸附率高的特點(diǎn),可以應(yīng)用于蝦青素的大規(guī)模分離提純.

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Extraction of Astaxanthin from Snail Eggs

HUA Jie,ZHANG Yuqi,ZHU Jiao,WANG Qing,LEI Jianzheng
(College of Chemistry and Chemical Engineering,Hunan Institute of Science and Technology,Yueyang 414006,China)

TQ028

A

1672-5298(2017)03-0058-05

2017-07-15

湖南師范大學(xué)化學(xué)生物學(xué)及中藥分析教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金(KLCBTCMR2015-08)

華 杰(1963? ),男,湖南岳陽(yáng)人,博士,湖南理工學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院教授.主要研究方向: 色譜分離技術(shù),精細(xì)化工