武士美，靳汝霖，任為一，丹彤，孫天松，孟和畢力格

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特010018）

德氏乳桿菌保加利亞亞種發(fā)酵乳中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的比較分析

武士美，靳汝霖，任為一，丹彤，孫天松，孟和畢力格

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特010018）

以4株德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus）為實(shí)驗(yàn)菌株，采用固相微萃取與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（SPME-GC-MS）相結(jié)合的方法，檢測(cè)4℃貯藏期間發(fā)酵乳中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，并結(jié)合保留指數(shù)法對(duì)化合物進(jìn)行有效鑒定，提高化合物的鑒定效率。結(jié)果表明，4株德氏乳桿菌保加利亞亞種發(fā)酵乳中的揮發(fā)性成分由酸、醛、酮、醇、酯和碳?xì)浠衔锏?類化合物組成，主要風(fēng)味物質(zhì)中的共有化合物包括乙酸、丁酸、正戊醛、2-戊酮、1-庚醇等物質(zhì)。其中，IMAU40078發(fā)酵乳中還含有乙醛、雙乙酰、乙偶姻、乙酸乙烯酯、乙酸乙酯等特征風(fēng)味化合物，特別是其獨(dú)有的乙酸乙烯酯、乙酸乙酯等化合物，在保持發(fā)酵乳風(fēng)味的基礎(chǔ)上增加了特有的果香味，提升了發(fā)酵乳感官品質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果為酸奶發(fā)酵劑的篩選提供依據(jù)。

SPME-GC-MS；發(fā)酵乳；揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)

Abstract:In this experiment,four strains of Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus were used as experimental strains.The volatile compounds of fermented milk produced by Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus during the storage of 4℃were detected by the combining method of SPME-GC-MS.The analysis method of retention index were used for compound identification.The results showed that volatile compo?nents of fermented milk were composed by six compounds,which were acids,aldehydes,ketones,alcohols,esters and hydrocarbon com?pounds.The main flavor substances such as acetic acid,butyric acid,pentanal,2-pentanone and 1-heptanol were common compounds.Among them,flavor compounds in the IMAU40078 fermented milk were made up of acetic acid,acetaldehyde,diacetyl,benzoin,acetic acid ethenyl ester and ethyl acetate.These compounds improved the quality of milk.Especially the latter two components,increased the particular fruit fragrance on the basis of keeping the fundamental flavor.This experiment results made a contribution to screening the starter cultures of fermented milk.

Key words:SPME-GC-MS;fermented milk;volatile compounds

0 引言

德氏乳桿菌保加利亞亞種作為發(fā)酵劑菌種之一，在酸奶發(fā)酵過(guò)程中生成的多種揮發(fā)性化合物能賦予發(fā)酵乳良好的風(fēng)味[1]。目前已經(jīng)鑒定出90多種對(duì)發(fā)酵乳風(fēng)味形成有重要影響的化合物[2-3]。固相微萃取與氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（SPME-GC-MS）作為一種高效的檢測(cè)方法已廣泛應(yīng)用于發(fā)酵乳風(fēng)味物質(zhì)的分析檢測(cè)[4-5]。2014年，Pan等[6]人利用SPME-GC-MS結(jié)合法檢測(cè)出戊糖乳桿菌發(fā)酵乳中的主要風(fēng)味物質(zhì)有乙醇、2-3-丁二酮和乙酸等；2015年，Bao等[7]人用此技術(shù)檢測(cè)出干酪乳桿菌發(fā)酵乳中的主要風(fēng)味化合物有乙酸、丁酸、2，3-丁二酮和己酸乙酯等。本實(shí)驗(yàn)分析了4株德氏乳桿菌保加利亞亞種發(fā)酵乳貯藏期間揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化，為德氏乳桿菌保加利亞亞種在發(fā)酵乳中的應(yīng)用提供借鑒。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 菌種和培養(yǎng)基

1.1.1 菌種

實(shí)驗(yàn)所用的4株發(fā)酵菌株如表1所示，均由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

表1 菌株編號(hào)及對(duì)應(yīng)的Genbank號(hào)

脫脂乳培養(yǎng)基（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%脫脂乳、0.1%酵母粉）；MRS液體培養(yǎng)基（CM 0359）；全脂復(fù)原乳（全脂乳粉11.5%，蔗糖6.5%）。

1.2 儀器設(shè)備

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（Agilent，7890B GC sys?tem-5977A MSD）；HP-5MS毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm ×0.25 μm）；SPME萃取頭（50/30 μmDVB/CAR/PDMS）；手動(dòng)固相微萃?。⊿PME）進(jìn)樣器。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵乳的制備

將實(shí)驗(yàn)室冷凍保藏的上述菌株分別于脫脂乳培養(yǎng)基中活化（37℃，24 h），并分別于50 mL和500 mL的MRS液體培養(yǎng)基中連續(xù)傳兩代（42℃，24 h）后，收集菌體，并加入PBS保護(hù)劑制得菌懸液。全脂復(fù)原乳預(yù)熱至60℃攪拌30 min，高壓均質(zhì)2次，95℃巴氏殺菌5 min后，迅速置于冰水中冷卻至4℃，按活菌數(shù)為5×107mL-1的接種量將菌懸液接種于均質(zhì)滅菌后的全脂乳中，分裝后于42℃培養(yǎng)，待樣品pH值低于4.6，滴定酸度到達(dá)70～90°T時(shí)，在4℃貯藏（此時(shí)為0 d），并分別于貯藏期0，1，3，7，14 d取樣，利用SPME-GC-MS技術(shù)檢測(cè)分析貯藏期間的風(fēng)味化合物。

1.3.2 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)測(cè)定

色譜條件：采用程序升溫方式，起始溫度為35℃，保持3 min，然后以4℃/min速率升至140℃，保持1 min，再以10℃/min升至250℃，保持3 min；進(jìn)樣口溫度為250℃；載氣為He氣，流速1.0 mL/min；不分流進(jìn)樣。

質(zhì)譜條件：電離方式為EI，70 eV；離子源溫度為230℃；質(zhì)量掃描范圍m/z 33～450 AMU；發(fā)射電流100 μA。

解析附條件：將SPME萃取頭插入氣相瓶上方萃取60 min，然后在250℃解吸附3 min，不分流進(jìn)樣。

1.3.3 定性與定量分析

利用NIST 11標(biāo)準(zhǔn)庫(kù)進(jìn)行質(zhì)譜檢索，并參考已發(fā)表的文獻(xiàn)資料，鑒定化合物。按照各組分峰面積歸一化法計(jì)算各組分相對(duì)峰面積比（即每種風(fēng)味物質(zhì)組分峰面積占離子色譜圖中所有風(fēng)味物質(zhì)總峰面積的百分比），結(jié)合程序升溫法計(jì)算各組分的保留指數(shù)，分析鑒定化合物。

2 結(jié)果與分析

本研究以4株具有良好發(fā)酵特性的德式乳桿菌保加利亞亞種為實(shí)驗(yàn)菌株，采用SPME-GC-MS對(duì)發(fā)酵乳在貯藏期間風(fēng)味物質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行檢測(cè)分析，貯藏0 d時(shí)的總離子流圖如圖1所示，結(jié)果如表2-表7所示。

圖1 貯藏0 d時(shí)揮發(fā)性風(fēng)味組分的總離子流圖

2.1 酸類化合物的比較

酸類化合物是酸奶中的重要呈味物質(zhì)，對(duì)發(fā)酵乳風(fēng)味的形成有重要影響。由表2可以看出IMAU20298，IMAU40078，IMAU40163，IMAU80319發(fā)酵乳中鑒定出的揮發(fā)性酸類化合物組成差異不大，其中，檢測(cè)到的共性物質(zhì)分別為乙酸、丁酸、3-甲基丁酸、己酸和辛酸等。貯藏0，1，3，7和14 d時(shí)，IMAU20298、IMAU 40078、IMAU80319發(fā)酵乳中乙酸的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)在IMAU20298發(fā)酵乳中依次為6.94%，12%，2.82%，11.14%和13.21%；在IMAU40078發(fā)酵乳中依次為3.03%，11.08%，16.26%，14.1%和19.94%；在IMAU80319發(fā)酵乳中依次為4.48%，5.02%，7.4%，4.85%和16.54%。任麗等[8]人研究報(bào)道乙酸在酸類化合物中占的比例最高，這和本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果類似。和上述3種發(fā)酵乳相比，IMAU40163發(fā)酵乳中酸類化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)分布有較大差異，在貯藏0和1 d時(shí)，辛酸的相對(duì)含量最高，達(dá)到6.51%和5.26%；3、14 d時(shí)乙酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，達(dá)到7.78%和12.05%；貯藏7 d時(shí)3-甲基丁酸的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，達(dá)到13.78%。乙酸、辛酸和3-甲基丁酸等揮發(fā)性有機(jī)酸，主要產(chǎn)生酸味，對(duì)發(fā)酵乳的風(fēng)味貢獻(xiàn)較大[8]。Cham?mas等[9]人在“Labin”發(fā)酵乳中檢測(cè)到了乙酸、丁酸和己酸等化合物。除上述的5種酸類化合物外，還檢測(cè)到醋酸酐、庚酸、甲基環(huán)己烷羧酸、2-甲基丁酸、戊酸等，盡管這些化合物的相對(duì)含量較低，但它們也對(duì)發(fā)酵乳的風(fēng)味起著不可忽視的作用。

IMAU20298，IMAU40078，IMAU40163，IMAU80 319發(fā)酵乳中揮發(fā)性酸類化合物的種類較多，已鑒定的有14種。貯藏期間，酸類化合物的種類和相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到峰值的時(shí)間點(diǎn)存在明顯差異，如IMAU20298、IMAU80319發(fā)酵乳中酸類化合物的種類和數(shù)量在貯藏14 d時(shí)達(dá)到峰值，而IMAU40078、IMAU40163發(fā)酵乳中酸類化合物的種類和數(shù)量分別在貯藏7 d和3 d時(shí)達(dá)到峰值。這和Güler等[10]人的研究結(jié)果較一致。

2.2 醛類化合物的比較分析

乙醛的香味閾值很低，Misselhorn等[11]人檢測(cè)到乙醛在水中的閾值僅為0.2 mg/kg，低濃度的乙醛能對(duì)發(fā)酵乳的風(fēng)味產(chǎn)生較大的影響。我國(guó)生產(chǎn)的酸奶主要是以乙醛為主的醛香型酸奶[12]，因此，乙醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)是評(píng)估菌株品質(zhì)的一項(xiàng)重要指標(biāo)。在上述4株菌株的發(fā)酵乳中，IMAU20298發(fā)酵乳中乙醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，貯藏期間其相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為10.71%，8.46%，6.74%，8.73%和5.87%；IMAU40078發(fā)酵乳在貯藏0，1 d和3 d時(shí)能檢測(cè)到乙醛，而在7 d和14 d時(shí)均沒(méi)有檢測(cè)到乙醛；IMAU80319發(fā)酵乳在貯藏期間沒(méi)有檢測(cè)到乙醛。這個(gè)結(jié)果表明菌株生產(chǎn)乙醛具有特異性，類似的結(jié)果在Chaves等人[13]的研究中也有發(fā)現(xiàn)。此外，上述產(chǎn)乙醛的3株菌株的發(fā)酵乳中檢測(cè)到的乙醛達(dá)到峰值的時(shí)間點(diǎn)也存在明顯差異，如IMAU20298發(fā)酵乳在發(fā)酵終點(diǎn)（0 d）時(shí)乙醛的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到峰值（10.71%）；IMAU40078和IMAU40163發(fā)酵乳在貯藏1 d時(shí)達(dá)到峰值（4.61%和7.78%）。從上述發(fā)酵乳中乙醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化情況分析發(fā)現(xiàn)，這些菌株發(fā)酵乳中乙醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)均在貯藏初期達(dá)到峰值，隨后略有下降，可能是因?yàn)橐胰┳鳛榇x中間產(chǎn)物，在酶的催化作用下可轉(zhuǎn)化成其他代謝產(chǎn)物。除乙醛外，相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高的有正戊醛、3-甲基丁醛和庚醛等。3-甲基丁醛具有麥芽香味[14]，庚醛具有迷人的脂肪香[15]，這些化合物可構(gòu)成發(fā)酵乳風(fēng)味。

表2 貯藏期間酸類化合物的鑒定結(jié)果

2.3 酮類化合物的比較分析

酮類化合物一般呈奶油味或果香味，是構(gòu)成發(fā)酵乳風(fēng)味的主體之一。其中，代表性的酮類化合物有雙乙酰和乙偶姻[16-17]，它們的閾值很低，微量的雙乙酰和乙偶姻也會(huì)對(duì)發(fā)酵乳的風(fēng)味產(chǎn)生影響。從表4可知，IMAU40078發(fā)酵乳在貯藏1、3 d時(shí)檢測(cè)到雙乙酰，其相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.5%和0.8%；在貯藏0，1，3，7，14 d時(shí)檢測(cè)到乙偶姻，其相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為3.32%，6.05%，5.82%，5.68%和7.04%。而在IMAU40163發(fā)酵乳中只檢測(cè)到乙偶姻，其在貯藏期間的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為3.04%，0.41%，0.29%，0.77%和1.43%。這可能是因?yàn)殡p乙酰很不穩(wěn)定，在雙乙酰還原酶的作用下易被還原成乙偶姻。類似的研究結(jié)果在楊天佑等[18]人的研究中也有發(fā)現(xiàn)。此外，上述4株發(fā)酵乳中都檢測(cè)到了2-戊酮、2-庚酮、2-壬酮和2-十一烷酮等，這些酮類化合物屬于甲基酮類，由多不飽和脂肪酸β-氧化生成，可賦予發(fā)酵乳良好的風(fēng)味[19]。

2.4 醇類化合物的比較分析

發(fā)酵乳中的醇類化合物主要由乳酸菌發(fā)酵糖類物質(zhì)產(chǎn)生，醇香與乳香的平衡使發(fā)酵乳風(fēng)味更加豐滿。由表5可以看出，IMAU20298，IMAU40078，IMAU40163，IMAU80319發(fā)酵乳中檢測(cè)到9種醇類化合物；其中，IMAU40078發(fā)酵乳中(S)-1，3-丁二醇的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，貯藏期間其相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)依次為1.4%，2.55%，4.7%，3.04%和1.99%。其他檢測(cè)到的低分子醇類化合物有1-庚醇、1-辛醇和2-壬醇等，這些化合物的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的分布差異不大，如IMAU20298發(fā)酵乳中1-庚醇的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化范圍在0.61%至0.77%之間；而IMAU40078發(fā)酵乳中1-庚醇的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化范圍在0.28%至0.47%之間。研究認(rèn)為，這些風(fēng)味是發(fā)酵乳中重要的風(fēng)味影響成分，如1-庚醇、1-辛醇具有果香和花香味，2-壬醇具有清新的果香味，3-甲基丁醇具有麥芽香味[20-21]。

2.5 酯類化合物的比較分析

酯類化合物能讓發(fā)酵乳呈現(xiàn)迷人的香味，可以有效減弱脂肪酸和胺類產(chǎn)生的苦味[22]。在IMAU20298，IMAU40078，IMAU40163，IMAU80319發(fā)酵乳中已鑒定的酯類化合物種類較少；其中，IMAU20298發(fā)酵乳中檢測(cè)到甲酸乙烯酯、醋酸甲酯、δ-壬內(nèi)酯等3種；IMAU40078發(fā)酵乳檢測(cè)到乙酸乙烯酯、乙酸乙酯、丁酸乙酯等3種；IMAU40163發(fā)酵乳中只檢測(cè)到了δ-壬內(nèi)酯；IMAU80319發(fā)酵乳中檢測(cè)到了甲酸乙烯酯、1-甲氧基-2-丙基乙烯酯、乙酰乙酸壬酯等3種。在上述化合物中，只有甲酸乙烯酯、乙酸乙烯酯和乙酸乙酯等化合物的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，其中，IMAU20298發(fā)酵乳在貯藏期間檢測(cè)到甲酸乙烯酯的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 26.24%，19.95%，14%，18.19%和 12.15%；IMAU40078發(fā)酵乳中檢測(cè)到乙酸乙烯酯的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.07%，2.57%，3.39%，4.87%和4.74%；檢測(cè)到乙酸乙酯的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.63%，2.01%，1.54%和0.97%。乙酸乙烯酯和丁酸乙酯能使發(fā)酵乳產(chǎn)生果香味，對(duì)發(fā)酵乳的風(fēng)味有較大的貢獻(xiàn)[23-24]。IMAU20298發(fā)酵乳與IMAU40163發(fā)酵乳在貯藏0 d時(shí)都檢測(cè)到了δ-壬內(nèi)酯，δ-壬內(nèi)酯有堅(jiān)果味與甜味[25]，δ-壬內(nèi)酯的風(fēng)味閾值較低，在較低的質(zhì)量分?jǐn)?shù)下，可賦予發(fā)酵乳較好的風(fēng)味。

表3 貯藏期間醛類化合物的鑒定結(jié)果

表4 貯藏期間酮類化合物的鑒定結(jié)果

表5 貯藏期間醇類化合物的鑒定結(jié)果

（續(xù)表5）

表6 貯藏期間酯類化合物的鑒定結(jié)果

表 7 貯藏期間碳?xì)浠衔锏蔫b定結(jié)果

2.6 碳?xì)浠衔锏谋容^分析

由表 7可以看出，IMAU20298，IMAU40078，IMAU40163，IMAU80319發(fā)酵乳中已鑒定的揮發(fā)性碳?xì)浠衔镉?，3-二甲基-1-丁烯、正庚烷、甘菊環(huán)烴和2，6，11-三甲基十二烷等4種。其中，IMAU40078發(fā)酵乳中正庚烷的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，在貯藏1 d和3d時(shí)其相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.74%和2.73%。其他3種化合物的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低，可能對(duì)發(fā)酵乳風(fēng)味的影響不大。

3 結(jié)論

本研究采用SPME-GC-MS相結(jié)合的方法檢測(cè)IMAU20298，IMAU40078，IMAU40163，IMAU80319發(fā)酵乳中的揮發(fā)性風(fēng)味化合物；共鑒定酸類、醛類、酮類、醇類、酯類和碳?xì)浠衔锏?類化合物。4種發(fā)酵乳比較，IMAU40078發(fā)酵乳中含有乙酸、乙醛、雙乙酰、乙偶姻、乙酸乙烯酯、乙酸乙酯等特征風(fēng)味物質(zhì)，且質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，說(shuō)明IMAU40078發(fā)酵乳風(fēng)味優(yōu)于其他3種菌株發(fā)酵乳。這項(xiàng)研究為德式乳桿菌保加利亞亞種作為發(fā)酵劑在發(fā)酵乳風(fēng)味方向的應(yīng)用提供借鑒。

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Comparision and analysis of Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus on producing volatile compounds in fermented milk

WU Shimei,JIN Rulin,REN Weiyi,DAN Tong,SUN Tiansong,Menghebilige
（Key Laboratory of Dairy Biotechnology and Engineering,Inner Mongolia Agricultural University,Hohhot 010018,China）

Q93-33

A

1001-2230（2017）09-0004-07

2016-12-20

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31471711;31460446）。

武士美（1992-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槿槠肺⑸锱c生物技術(shù)。

孟和畢力格