柳海賓，張燕，杜欣軍，李萍，王碩

（天津科技大學(xué)食品營養(yǎng)與安全重點實驗室，天津 300457）

生鮮乳中金黃色葡萄球菌檢測及性狀分析

柳海賓，張燕，杜欣軍，李萍，王碩

（天津科技大學(xué)食品營養(yǎng)與安全重點實驗室，天津 300457）

對天津市周邊9家奶場原料奶中金黃色葡萄球菌污染水平、腸毒素基因的攜帶情況及耐藥性進行調(diào)查研究。采集原料奶樣品共432份，按照GB4789.10-2010對原料奶中金黃色葡萄球菌進行檢驗，并對篩選出來的金黃色葡萄球菌進行腸毒素基因研究、生物膜形成能力分析和耐藥性分析。結(jié)果表明：采集的432份原料奶中，金黃色葡萄球菌陽性樣本有14個，陽性率為3.24%，篩選出來的14株金黃色葡萄球菌攜帶SEA的概率為100%；14株菌中有10株分離株可以形成生物膜，其中2株可以形成中等粘附的生物膜；金黃色葡萄球菌分離株對氯霉素耐藥率（100%）最高，對頭孢西丁鈉（21.43%）、阿米卡星（14.29%）、萬古霉素（14.28%）、苯唑西林（28.57%）耐藥率較高，所有菌株對環(huán)丙沙星敏感。其中有4株分離株為多重耐藥株。結(jié)論：所選取的9家奶廠中，原料奶中金黃色葡萄球菌污染率相對較低，但金黃色葡萄球菌分離株腸毒素A基因檢出率較高，生物膜形成能力較強，耐藥情況比較嚴(yán)重，并且存在多重耐藥和萬古霉素耐藥菌株，本研究為奶源性金黃色葡萄球菌的污染溯源和控制提供了相應(yīng)的數(shù)據(jù)支持。

金黃色葡萄球菌；毒素基因；耐藥；生物膜

Abstract:To investigate the contamination and enterotoxin of Staphylococcus aureus in raw milk from 9 dairy farms around Tianjin city,to un?derstanding the dairy product safety.432 raw milk were collected,according to GB4789.10-2010,the contamination of Staphylococcus aure?us were detectedand the analysis of Staphylococcus aureus enterotoxin gene and biofilm formation ability and the antibiotic resistance were carried out.Results:Staphylococcus aureus was detected in 14 raw milk samples,with a total detection ratio of 3.24%.The detection ratio of en?terotoxin gene A of Staphylococcus aureus was 100%.In this experiment,14 Staphylococcus aureus were isolated,in which 10 strains have the abili?ty of forming biofilm.For the Staphylococcus aureus isolated from milk,the highest drug-resistance of all strain was chloramphenicol(100%),many isolates were resistant to cefoxitin(21.43%),amikacin(14.29%),vancomycin(14.28%),oxacillin(28.57%),all the isolates were suscepti?ble to ciprofloxacin.4 isolates were multi-drug resistance.Conclusion:The Staphylococcus aureus pollution was not very serious in raw milk in Tianjin city.But the isolates of Staphylococcus aureus enterotoxin and biofilm forming ability is not optimistic.In addition,there were multiple drug resistance and vancomycin resistant strains.This study provided the supporting data for control pollution traceability of Staphylococcus aure?us.

Key words:Staphylococcus aureus;enterotoxin gene;drug-resistance;biofilm.

0 引言

金黃色葡萄球菌是常見的食源性致病菌之一，其產(chǎn)生的腸毒素是食物中毒的主要原因，金黃色葡萄球菌毒素中毒主要發(fā)生在乳及乳制品的食用中[1]，當(dāng)食物中金黃色葡萄球菌數(shù)達到2.4×103g－1時，就有產(chǎn)生腸毒素的風(fēng)險[2]。金黃色葡萄球菌腸毒素中SEA為最主要的類型，極易污染食品[3]。

金黃色葡萄球菌是引起奶牛乳房炎的主要致病菌。目前奶牛乳房炎的治療主要依賴于抗生素，而抗生素的濫用會導(dǎo)致耐藥菌株的出現(xiàn)[4-5]，有研究者提出這是由于細(xì)菌形成生物膜，使菌體對抗生素的抵抗作用增強[6]。而且生物膜的形成可以增強細(xì)菌對周圍環(huán)境的耐受性[7-8]。

本研究共采集原料奶432份，對其中金黃色葡萄球菌污染狀況進行調(diào)查，為乳制品企業(yè)確定安全生產(chǎn)關(guān)鍵控制點治奠定基礎(chǔ)。

1 實 驗

1.1 材料

7.5%NaCl肉湯，血瓊脂平板，腦心浸出液肉湯（BHI），卵黃增菌液，baird parker(B-P)培養(yǎng)基，凍干兔血漿，甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基，Taq酶，Buffer，dNTP以及細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，甲醇，乙醇，四環(huán)素，阿米卡星，硫酸慶大霉素，紅霉素，頭孢西丁鈉，氯霉素，環(huán)丙沙星，卡鈉霉素，萬古霉素，苯唑西林。

1.2 設(shè)備

1.3 方法

1.3.1 金黃色葡萄球菌的分離鑒定

在天津市周圍9個奶場采集原料奶，共計432份，所采集的原料奶密封于無菌采樣袋內(nèi)，低溫下3 h內(nèi)送至實驗室，按照GB4789.10-2010[9]選取B-P平板上黑色菌落周圍有渾濁帶和透明圈的疑似菌落，進行溶血試驗和血漿凝固酶實驗，經(jīng)過一系列生化鑒定的菌株加入終體積分?jǐn)?shù)為20%的甘油，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 進一步篩選金黃色葡萄球菌

經(jīng)過國標(biāo)法生化實驗篩選出來的菌株，在甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基上接種后37℃培養(yǎng)24 h，分別挑選金黃色的菌落和白色菌落接種LB培養(yǎng)基上活化至OD值為0.6，將篩選出的菌株加入終體積分?jǐn)?shù)為20%的甘油后，于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 PCR驗證

將1.3.2篩選出來的金黃色菌落和白色菌落進一步用PCR方法進行驗證是否存在nuc基因，引物的設(shè)計參考文獻，由蘇州金唯智生物技術(shù)有限公司合成，引物序列如表1所示。

表1 nuc及腸毒素引物

nuc基因PCR擴增程序為：94℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性2 min；56 ℃退火2 min；72 ℃延伸30 s；35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。然后精確移取6 uL擴增產(chǎn)物，用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

目前，國內(nèi)的《人民日報》、搜狐、新浪等媒體上線的VR新聞大部分以360度全景視頻為主，而國外的《紐約時報》在報道VR新聞時甚至采用直升機拍全景，觀眾在觀看視頻時只需一個智能手機或者利用VR眼鏡即可。VR視頻的原型機在拍攝視頻時根本不需要邊框，所以其與傳統(tǒng)視頻的拍攝方式存在著較大的差異。由于拍攝的角度為360度，因此觀眾站在某個角度觀看視頻便成為拍攝者心中的謎。[3]視頻的腳本設(shè)計者在設(shè)計時具有故事性的視頻時變得愈加困難，由于技術(shù)含量較低，推廣人員便放棄了推廣。

1.3.4 金黃色葡萄球菌毒素基因分析

在2 mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基上接種篩選出來的金黃色葡萄球菌，置于搖床上，37℃恒溫過夜，使金黃色葡萄球菌復(fù)蘇，然后將菌液在19 800 g的離心力下離心5 min，收集菌體。金黃色葡萄球菌基因組DNA用試劑盒提取，用PCR檢測上述金黃色葡萄球菌基因組DNA中各腸毒素血清型分布情況，PCR引物見表1。PCR反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，55℃退火2 min，72℃延伸30 s，35個循環(huán)，72℃后延伸10 min，得到的擴增產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結(jié)果。

1.3.5 金黃色葡萄球菌生物膜形成能力及藥敏分析

依據(jù)文獻方法[10]，將過夜活化的菌株按1∶100稀釋，取稀釋后的菌株200 μL于無菌96孔板中，同時做陰性對照（只加入空白LB）和陽性對照（ATCC35984），37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，吸棄培養(yǎng)液，用250 μL的ddH2O溶液洗滌3次，除去未黏附的懸浮菌體及培養(yǎng)基，加入200 μL體積分?jǐn)?shù)99%的甲醇固定15 min，吸棄甲醇，室溫干燥。加入200 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的結(jié)晶紫染色5 min，吸棄結(jié)晶紫，流水沖洗多余染液，室溫干燥。加入220 μL體積分?jǐn)?shù)為33%乙醇溶解，混勻，用酶標(biāo)儀測定595 nm處的OD值。OD值可以反映生物膜與接觸物表面結(jié)合的牢固程度，依據(jù)空白對照組的OD值（ODC）對生物膜的黏附能力進行分類：OD≤ODC為不黏附；ODC＜OD≤2ODC為弱黏附；2ODC＜OD≤4 ODC為中等黏附；OD＞4ODC為黏附能力強。依據(jù)CLSI推薦的瓊脂稀釋法進行抗菌藥物的藥敏性試驗。選取臨床常用的10種抗生素進行測試，抗生素質(zhì)量濃度和判斷標(biāo)準(zhǔn)如表2所示。具有3種或3種以上抗生素抗性的菌株定義為多重耐藥性菌株。

2 結(jié) 果

2.1 金黃色葡萄球菌檢出情況

通過GB/T4789.10-2010對采集的432份原料奶進行檢驗，共得到63株疑似金黃色葡萄球菌分離株。16S rRNA測序分析后發(fā)現(xiàn)其中混有變形桿菌，將國標(biāo)法篩選出來的疑似菌落劃線于甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24 h后，平板上的菌落分為兩種典型形態(tài)，一種為金黃色，表面光滑凸起；另一種為乳白色。63株篩選的疑似金黃色葡萄球菌在甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基上有14株形成金黃色菌落，其余形成乳白色菌落或者在甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基上不能生長。

表2 金黃色葡萄球菌藥敏試驗抗生素信息 μg/mL

2.2 PCR驗證

選取甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基上金黃色菌落和白色菌落，提取基因組DNA，用PCR法檢驗是否存在nuc基因，電泳結(jié)果表明，甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基上的金黃色菌落均能擴增出nuc基因，而白色菌落不能擴增出nuc基因。經(jīng)PCR驗證表明，從樣品中篩選出來的金黃色葡萄球菌為14株，分別來自14個原料奶樣品，樣品金黃色葡萄球菌陽性率為3.24%。

圖1 nuc基因PCR驗證結(jié)果

2.3 PCR檢驗?zāi)c毒素基因

根據(jù)金黃色葡萄球菌SEA基因驗證電泳圖，14株金黃色葡萄球菌均存在SEA基因，SEA基因的檢出率為100%，SEB，SEC，SED，SEE基因的檢出率為0。

2.4 金黃色葡萄球菌分離株生物膜形成能力比較

實驗結(jié)果表明，14株金黃色葡萄球菌中有10株分離株可以形成生物膜，其中2株可以形成中等黏附的生物膜，8株生物膜的黏附能力弱，有4株金黃色葡萄球菌分離株不能形成生物膜。

2.5 金黃色葡萄球菌分離株的耐藥性結(jié)果

圖2 金黃色葡萄球菌SEA基因驗證結(jié)果

表3 生物膜形成能力鑒定

參照CLSI（2010），對耐藥結(jié)果進行分析，統(tǒng)計出耐藥、中介、敏感的金黃色葡萄球菌菌株數(shù)，并計算耐藥率，本研究中14株分離株對10種抗生素的耐藥率統(tǒng)計如表4所示，所有的分離株至少對一種抗生素存在耐藥情況，并且有兩株菌對萬古霉素耐藥，對3種或3種以上抗生素耐藥定義為多重耐藥菌株，依據(jù)圖3，多重耐藥菌株占28.57%。

3 討 論

是否產(chǎn)生血漿凝固酶是金黃色葡萄球菌鑒定中的黃金標(biāo)準(zhǔn)，但一些非金黃色葡萄球菌產(chǎn)生活性較大的蛋白酶也可以使凍干兔血漿凝固，導(dǎo)致假陽性的出現(xiàn)。另外變形桿菌和金黃色葡萄球菌在鑒定試驗中有很多相似之處，即使在Baird-parker培養(yǎng)基上反復(fù)分離，挑取單菌落，仍很難區(qū)分，因此本實驗在國標(biāo)法檢測金黃色葡萄球菌的基礎(chǔ)上，增加了甘露醇氯化鈉選擇性培養(yǎng)基，長出的金黃色菌落為疑似金黃色葡萄球菌，用PCR方法驗證這些菌落均存在nuc基因。nuc基因為金黃色葡萄球菌上高度保守區(qū)域，該基因編碼的耐熱核酸酶為金黃色葡萄球菌所特有，胡瑜等[11]曾將nuc基因作為金黃色葡萄球菌PCR鑒定的參照基因。因此，本研究建立了一種簡便的篩選食品中金黃色葡萄球菌的方法，即7.5%NaCl肉湯增菌-三區(qū)劃線于Baird-parker培養(yǎng)基-挑取有渾濁帶和透明圈的黑色菌落劃線于甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基-PCR驗證，簡化了篩選步驟的同時提高了篩選結(jié)果的準(zhǔn)確性。

表4 14株金黃色葡萄球菌體外藥物敏感性

圖3 14株金黃色葡萄球菌藥物敏感性分布

本研究采集的原料奶樣品有3.24%被金黃色葡萄球菌污染，顯著低于文獻報道的結(jié)果（19.33%張靜[12]，任敏11.5%[13]，彭洋7.55%[14]），且各文獻報道的結(jié)果也存在差異，這表明不同地區(qū)生鮮乳中金黃色葡萄球菌的污染存在差異，同時也反映出天津周邊地區(qū)奶場衛(wèi)生狀況優(yōu)良。

對原料奶中金黃色葡萄球菌腸毒素基因攜帶情況進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)100%的金黃色葡萄球菌分離株攜帶腸毒素基因，且均為SEA，即所有的金黃色葡萄球菌分離株腸毒素基因陽性。衛(wèi)沛楠等[15]對金黃色葡萄球菌分離株腸毒素基因調(diào)查發(fā)現(xiàn)，84.95%的分離株攜帶腸毒素基因。楊靜等[16]用PCR方法檢測各類食品中的金黃色葡萄球菌分離株，結(jié)果顯示腸毒素基因的攜帶率為100%。顏文光等[17]研究發(fā)現(xiàn)有34.27%的金黃色葡萄球菌分離株攜帶腸毒素基因。由此可以看出，不同地區(qū)、不同來源的金黃色葡萄球菌分離株間腸毒素基因的攜帶率有差異，且腸毒素基因的多樣性間存在差異。這些差異可能與樣本大小、樣本多樣性及地區(qū)有關(guān)。

金黃色葡萄球菌生物膜是金黃色葡萄球菌一個重要的毒力因子，含有多種毒素，生物膜的形成使得微生物易感染宿主細(xì)胞，并且對機體免疫清除作用的抵抗增強[18]，對外界環(huán)境的耐受性增加[19]。細(xì)菌以生物膜的形式附著在食品加工環(huán)境中，常規(guī)的清洗和消毒方法難以將其清除，并且耐藥性會明顯增強（10～1 000倍[20]）。生物膜形成后，將細(xì)菌包被于胞外基質(zhì)中，形成膜屏障作用，并且生物膜可以誘導(dǎo)耐藥基因的高表達[21]，隨之出現(xiàn)的是微生物耐藥性更加嚴(yán)重[22]。本研究從原料奶中篩選出來的金黃色葡萄球菌中，有71.43%的菌株可以形成生物膜，張偉松[23]，周歡歡[24]，李延榮[25]等分離出的金黃色葡萄球菌中，具有生物膜形成能力的菌株分別占100%，75%，74%，消費者食用了被金黃色葡萄球菌污染的食品，除腸毒素會引發(fā)相關(guān)疾病外，還會引發(fā)與生物膜相關(guān)的疾病[26]，如齲齒，肺炎，支氣管炎等。

細(xì)菌的耐藥問題是食品和衛(wèi)生領(lǐng)域普遍關(guān)注的問題，隨著抗生素在醫(yī)藥領(lǐng)域的廣泛使用，導(dǎo)致多重耐藥菌株的出現(xiàn)，給人類的健康和生活帶來很大的威脅。從本研究藥敏檢測結(jié)果來看，奶源性金黃色葡萄球菌分離株對氯霉素的耐藥率為100%，對萬古霉素的耐藥率達到14.28%，萬古霉素是目前治療金黃色葡萄球菌感染最有效的藥物，這些菌株進一步發(fā)展可能會成為超級耐藥菌株。趙俊利[27]等對內(nèi)蒙古地區(qū)奶牛源金黃色葡萄球菌的耐藥性進行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)多重耐藥菌株占33.9%，沒有發(fā)現(xiàn)萬古霉素耐藥菌株，劉琪[28]等對東北地區(qū)奶牛源金黃色葡萄球菌的耐藥性進行調(diào)查，青霉素、氨芐西林、紅霉素、卡那霉素和環(huán)丙沙星的耐藥率分別為：50%，50%，62.5%，50%和25%，對苯唑西林、四環(huán)素、萬古霉素均敏感。

本研究分析了天津市周圍9家奶廠中金黃色葡萄球菌的污染和耐藥情況，金黃色葡萄球菌污染率較低，但金黃色葡萄球菌分離株中耐藥性較為普遍，并且存在多重耐藥和萬古霉素耐藥菌株，本研究為奶源性金黃色葡萄球菌的污染溯源和控制提供了相應(yīng)的數(shù)據(jù)支持。

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Prevalence and characterization of Staphylococcus aureus isolated from raw milk

LIU Haibin,ZHANG Yan,DU Xinjun,LI Ping,WANG Shuo
(Key Laboratory of Food Nutrition and Safety,Ministry of Education,Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300457)

TS252.2，TS252.7

A

1001-2230(2017)09-0017-05

2017-02-28

國家十二五規(guī)劃項目(2013BAD18B11);天津科技大學(xué)優(yōu)秀博士學(xué)位論文創(chuàng)新基金(2016003)。

柳海賓（1989-），女，博士研究生，研究方向為致病菌的污染調(diào)查及快速檢測。

王碩