莊曉彤，陸美子，于秀玲，徐麗

（沈陽市第四人民醫(yī)院眼科 ，沈陽 110031）

東北地區(qū)GLIS3基因多態(tài)性與2型糖尿病合并視網(wǎng)膜病變的關(guān)聯(lián)性研究

莊曉彤，陸美子，于秀玲，徐麗

（沈陽市第四人民醫(yī)院眼科 ，沈陽 110031）

目的探討GLIS3基因多態(tài)性與中國東北地區(qū)2型糖尿病合并視網(wǎng)膜病變的相關(guān)性。方法采用病例對照研究方法，選取糖尿病合并視網(wǎng)膜病變患者（DR組）、糖尿病未合并視網(wǎng)膜病變患者（DNR組）、健康人群（NC組）各120例為研究對象。應(yīng)用PCRRFLP方法測定GLIS3基因rs7041847與rs7034200多態(tài)的基因分型。用非條件logistic回歸計算比值比及95%置信區(qū)間。結(jié)果DR、DNR組分別與NC組比較，GLIS3基因rs7041847 多態(tài)AG、AG/GG基因型、G等位基因患者發(fā)病風險顯著增加（P ＜ 0.05），rs7034200多態(tài)CC、AC/CC基因型、C等位基因患者發(fā)病風險顯著增加（P ＜ 0.05）。結(jié)論在中國東北地區(qū)，GLIS3基因rs7041847、rs7034200是2型糖尿病的危險因素，并未發(fā)現(xiàn)GLIS3基因與視網(wǎng)膜病變的易感性相關(guān)。

2型糖尿?。灰暰W(wǎng)膜病變；GLIS3基因

Abstract ObjectiveTo investigate the correlation between the polymorphisms in GLIS3 and diabetic retinopathy in patients with type 2 diabetes in Northeast China.MethodsBased on the case-control study，polymorphisms in GLIS3 were examined by PCR-RFLP in 120 cases of diabetic retinopathy in patients with type 2 diabetes （DR），120 cases of patients with type 2 diabetes without diabetic retinopathy （DNR），and 120 healthy individuals （NC）. The odds ratio （OR） and 95% confidence interval （CI） were calculated using unconditional logistic analysis.ResultsThe results demonstrated that GLIS3 rs7041847 AG，AG/GG genotype，or G allele was associated with an increased risk of DR and DNR （P ＜ 0.05）. Moreover，GLIS3 rs7034200 CC，AC/CC genotype，or C allele was associated with an increased risk of DR and DNR （P ＜ 0.05）.ConclusionIn the patients in Northeast China，the polymorphisms in GLIS3 rs7041847 and rs7034200 were correlated with type 2 diabetes mellitus，while GLIS3 may not be associated with the susceptibility to diabetic retinopathy.

Keywordstype 2 diabetes mellitus； retinopathy； GLIS3 gene

2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）是復(fù)雜的代謝紊亂綜合征，已成為危害公共健康的流行病問題，據(jù)估計其發(fā)病率占中國成年人群的11.6%。其中，肥胖、家族遺傳、運動缺乏及不良生活習慣為T2DM的主要危險因素［1-2］。糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）為糖尿病常見的微血管并發(fā)癥，能導(dǎo)致患者失明［3-4］。環(huán)境因素與遺傳因素均在糖尿病及DR的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用［5-6］。GLIS3基因位于人類染色體9p24.2，為鋅指蛋白家族成員之一，主要在胰腺、甲狀腺及腎臟中表達。有研究［7］表明GLIS3異常表達會增加T2DM的發(fā)病風險。另有研究［8］對美國及東亞地區(qū)T2DM人群進行全基因組關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)GLIS3基因多態(tài)與糖尿病相關(guān)，中國東北地區(qū)此基因與DR的相關(guān)性尚未見報道。因此，本研究利用病例對照研究探討GLIS3基因多態(tài)是否與東北地區(qū)T2DM及DR患者存在關(guān)聯(lián)。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選取2011年1月至2015年3月沈陽市第四人民醫(yī)院眼科門診及病房根據(jù)糖尿病診斷和分型標準由糖尿病專家診斷為T2DM的患者。所有患者均接受眼科專家根據(jù)DR入組標準進行的眼科檢查。根據(jù)檢查結(jié)果將患者分為糖尿病合并DR組（DR組，120例，其中男52例，女68例），糖尿病未合并DR組（DNR 組，120例，其中男56例，女64例）。選擇健康成年體檢者為對照組（NC組，120例，其中男63例，女57例）。本研究得到本院倫理委員會批準，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取：抽取研究對象外周靜脈血（約3 mL），用酚氯仿法提取全血樣本的基因組DNA，紫外分光光度計測定DNA濃度后，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 多重PCR引物：根據(jù)GLIS3基因內(nèi)含子多態(tài)位點附近區(qū)域序列，同時考慮接續(xù)的限制性內(nèi)切酶PstⅠ的識別特性進行引物設(shè)計，由上海生工合成。rs7041847上游引物序列：5’-GGCCCCTCCTTCCCTT GACtA-3’，下游引物序列：5’-CATCTCTGAAAGACA GATTGTGACAG-3’。rs7034200上游引物序列：5’-T CCAGTTTTCACATTAATTACGCC-3’，下游引物 序列：5’-GCATTTTATCCCTTTTTTTGTTAaCtAG-3’。

1.2.3 多重PCR-RFLP及產(chǎn)物檢測：多重PCR是在1個20 μL的PCR反應(yīng)體系中，包括1×Taq酶（日本TaKaRa公司），10 μmol/L濃度引物2 μL，50 ng的模板DNA。反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性1 min，94 ℃ ，30 s，50 ℃ ，30 s，72 ℃，30 s，重復(fù)35個循環(huán)；最后72 ℃ 1 min。反應(yīng)結(jié)束后，將10 μL PCR產(chǎn)物加入含PstⅠ限制性內(nèi)切酶的反應(yīng)體系中孵育過夜。酶切產(chǎn)物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，紫外燈下觀察電泳結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用統(tǒng)計分析軟件SPSS 13.0 進行數(shù)據(jù)處理。利用t檢驗分析DR、DNR組和NC組臨床資料，采用χ2檢驗確定對照組基因型頻率是否符合Hardy-Weinberg平衡，比較基因型的組間分布頻率。采用非條件logistic回歸分析不同基因型與DR、DNR組和NC組之間的相關(guān)性。P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DR、DNR組和NC組的一般特征比較

DR、DNR患者及NC組間年齡分布、性別構(gòu)成差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞ 0.05）。與NC組比較，DR及DNR組的收縮壓及舒張壓、體質(zhì)量指數(shù)、吸煙史及飲酒史均有統(tǒng)計學(xué)差異 （P ＜ 0.05）。DR及DNR組比較，收縮及舒張壓、體質(zhì)量指數(shù)、吸煙史及飲酒史等差異無統(tǒng)計學(xué)無意義（P ＞ 0.05）。DR組的糖尿病病程較DNR組長，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜ 0.05），見表1。DR、DNR組及NC組基因型與等位基因分布顯示，rs7041847位點DR、DNR組與NC組基因頻率比較有統(tǒng)計學(xué)差異（P ＜ 0.05），DR與DNR組基因頻率比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P ＞ 0.05）。rs7034200位點 DR、DNR組與NC組基因頻率比較有統(tǒng)計學(xué)差異（P ＜ 0.05），DR與DNR組基因頻率比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P ＞ 0.05）。GLIS3基因rs7041847與rs7034200 NC組的基因型頻率符合Hanly-Weinberg平衡，具有群體代表性。見表2。

2.2 GLIS3基因多態(tài)性與糖尿病合并/未合并DR發(fā)病風險的相關(guān)性

如表2所示，對GLIS3基因rs7041847進行l(wèi)ogistic回歸分析，以AA基因型或A等位基因作為對照進行危險度評價。DR組與NC組相比，rs7041847 AG、AG/GG基因型、 G等位基因患者發(fā)病風險顯著增加（均P ＜ 0.001）。同時，DNR組與NC組相比也有類似結(jié)果（均P ＜ 0.001）。

表1 3組患者臨床特征情況比較Tab.1 Comparison of clinical characteristics in the three groups

表2 GLIS3基因多態(tài)位點基因型分布頻率與糖尿病合并DR發(fā)病風險的相關(guān)性Tab.2 Genotype frequencies of the GLIS3 polymorphisms among the three groups and their association with diabetic retinopathy in patients with a risk of type 2 diabetes

對GLIS3基因rs7034200進行l(wèi)ogistic回歸分析，以AA基因型或A等位基因作為對照進行危險度評價。DR組與NC組相比，rs7034200 CC、AC/CC基因型、C等位基因患者發(fā)病風險顯著增加（均P ＜ 0.05）。DNR組與NC組相比也有類似結(jié)果（均P ＜ 0.05），見表2。

3 討論

糖尿病患者的高血糖狀態(tài)是微血管并發(fā)癥的高危因素，DR為糖尿病最常見的并發(fā)癥之一［9］。近期研究［10］預(yù)測DR人群在2030年將增加至1.91億。DR是一個復(fù)雜過程且存在種族差異及地域差異，危險因素包括不良血糖控制、糖尿病、吸煙、炎癥反應(yīng)、肥胖與高血壓。STRATTON等［11］發(fā)現(xiàn)不良血糖控制及糖尿病是DR的獨立危險因素。然而，關(guān)于DR的具體病理生理機制尚不十分清楚。

遺傳基因不同也影響著糖尿病及DR的發(fā)生發(fā)展，有許多學(xué)者從基因水平探索糖尿病及DR的發(fā)生機制，篩選相關(guān)基因，并從表觀遺傳學(xué)、基因組學(xué)、基因多態(tài)以及信號通路等角度分析DR的遺傳易感性［12-14］。GLIS3作為糖尿病的易感基因，最初在胰腺（主要在β細胞）中表達，其突變會引起新生兒糖尿病［15-16］。全基因組關(guān)聯(lián)分析［17］揭示GLIS3多態(tài)與1型糖尿病和T2DM在不同人種中均存在顯著關(guān)聯(lián)。

本研究發(fā)現(xiàn)在GLIS3位點rs7041847中，與AA基因型或A等位基因相比，AG、AG/GG基因型、G等位基因患者發(fā)病風險顯著增加；在位點rs7034200中，與AA基因型或A等位基因相比，CC、AC/CC基因型、C等位基因患者發(fā)病風險顯著增加。DR組與DNR組進行2個多態(tài)位點基因型對比分析差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明GLIS3基因的2個多態(tài)位點可能不參與DR的發(fā)生發(fā)展，因此未對DR與DNR組進行后續(xù)logistic分析。本結(jié)果表明GLIS3基因多態(tài)與東北地區(qū)T2DM相關(guān)，且rs7041847的G等位基因、rs7034200的C等位基因為遺傳高危因子。

病例對照研究也有一些不足，基于醫(yī)院的病例設(shè)計可能存在病例的內(nèi)在選擇偏倚。因此，基于醫(yī)院的病例對照研究結(jié)果應(yīng)在將來被基于人群的前瞻性研究進一步驗證。此外，由于這些位點的等位基因頻率相對較低，這些多態(tài)位點的潛在臨床應(yīng)用也許不能實現(xiàn)。因此希望能夠開展設(shè)計更合理、更多大樣本、更多種族類型的相關(guān)研究，為明確糖尿病合并DR的發(fā)生發(fā)展提供思路。

［1］ XU Y，WANG L，HE J，et al. Prevalence and control of diabetes in Chinese adults ［J］. JAMA，2013，310（9）：948-959.

［2］ LIU X，LI Y，LI L，et al. Prevalence，awareness，treatment，control of type 2 diabetes mellitus and risk factors in Chinese rural population：the rural diabetes study ［J］. Sci Rep，2016，6：31426. DOI：10.1038/srep31426.

［3］ MOHAMED Q，GILLIES MC，WONG TY. Management of diabetic retinopathy：a systematic review ［J］. JAMA，2007，298（8）：902-916.

［4］ REDDY MA，ZHANG E，NATARAJAN R. Epigenetic mechanisms in diabetic complications and metabolic memory［J］. Diabetologia，2015，58（3）：443-455. DOI：10.1007/s00125-014-3462-y.

［5］ PETROVIC D. Candidate genes for proliferative diabetic retinopathy［J］.Biomed Res Int，2013，2013：540416. DOI：10.1155/2013/540416.

［6］ MARTIN EM，STYBLO M，F(xiàn)RY RC. Genetic and epigenetic mechanisms underlying arsenic-associated diabetes mellitus：a perspective of the current evidence ［J］. Epigenomics，2017，9（5）：701-710.

［7］ DUPUIS J，LANGENBERG C，PROKOPENKO I，et al. New genetic loci implicated in fasting glucose homeostasis and their impact on type 2 diabetes risk［J］. Nat Genet，2010，42（2）：105-116. DOI：10.1038/ng.520.

［8］ MULLER YL，PIAGGI P，CHEN P，et al. Assessing variation across 8 established east Asian loci for type 2 diabetes mellitus in American Indians：suggestive evidence for new sex-specific diabetes signals in GLIS3 and ZFAND3 ［J］. Diabetes Metab Res Rev，2017，33：e2869.DOI：10.1002/dmrr.2869.

［9］ KLEIN BE. Overview of epidemiologic studies of diabetic retinopathy［J］. Ophthalmic Epidemiol，2007，14（4）：179-183.

［10］ ZHENG Y，HE M，CONGDON N. The worldwide epidemic of diabetic retinopathy［J］. Indian J Ophthalmol，2012，60（5）：428-431.DOI：10.4103/0301-4738.100542.

［11］ STRATTON IM，KOHNER EM，ALDINGTON SJ，et al. UKPDS 50：risk factors for incidence and progression of retinopathy in Type II diabetes over 6 years from diagnosis ［J］. Diabetologia，2001，44（2）：156-163.

［12］ HONG YJ，KANG ES，JI MJ，et al. Association between Bsm1 polymorphism in vitamin D receptor gene and diabetic retinopathy of type 2 diabetes in Korean population ［J］. Endocrinol Metab （Seoul），2015，30（4）：469-474. DOI：10.3803/EnM.2015.30.4.469.

［13］ WANG W，HE M，HUANG W. Association of monocyte chemoattractant protein-1 gene 2518A/G polymorphism with diabetic retinopathy in type 2 diabetes mellitus：a meta-analysis ［J］. Diabetes Res Clin Pract，2016，120：40-46.

［14］ FAN WY，LIU NP. Meta-analysis of association between K469E polymorphism of the ICAM-1 gene and retinopathy in type 2 diabetes［J］. Int J Ophthalmol，2015，8（3）：603-607. DOI：10.3980/j.issn.2222-3959.2015.03.30.

［15］ BARKER A，SHARP SJ，TIMPSON NJ，et al. Association of genetic Loci with glucose levels in childhood and adolescence：a meta-analysis of over 6，000 children ［J］. Diabetes，2011，60（6）：1805-1812.DOI：10.2337/db10-1575.

［16］ YANG Y，CHANG BH，CHAN L. Sustained expression of the transcription factor GLIS3 is required for normal beta cell function in adults ［J］. EMBO Mol Med，2013，5（1）：92-104. DOI：10.1002/emmm.201201398.

［17］ WEN X，YANG Y. Emerging roles of GLIS3 in neonatal diabetes，type 1 and type 2 diabetes［J］. J Mol Endocrinol，2017，58（2）：R73-R85.

（編輯 武玉欣）

Polymorphisms in GLIS3 Associated with Diabetic Retinopathy in Patients with Type 2 Diabetes in Northeast China

ZHUANG Xiaotong，LU Meizi，YU Xiuling，XU Li

（Department of Ophthalmology，The Fourth People’s Hospital of Shenyang，Shenyang 110031，China）

R774.1

A

0258-4646（2017）10-0909-04

http://kns.cnki.net/kcms/detail/21.1227.R.20170927.1452.022.html

10.12007/j.issn.0258‐4646.2017.10.011

沈陽市科學(xué)技術(shù)計劃（F16-206-9-25）

莊曉彤（1978-），女，副主任醫(yī)師，博士.

徐麗，E-mail：xu-li1149@163.com

2017-02-12

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2017-09-27 14:52