余鈴，張政佩，孫祥然，鄭迪，郭衛(wèi)春

（武漢大學(xué)人民醫(yī)院骨一科，武漢 430060）

miR-429 通過靶向作用Sox2抑制骨肉瘤干細胞特性

余鈴，張政佩，孫祥然，鄭迪，郭衛(wèi)春

（武漢大學(xué)人民醫(yī)院骨一科，武漢 430060）

目的探討miR-429在骨肉瘤干細胞中的作用。方法利用不同方法篩選出骨肉瘤干細胞，檢測miR-429的含量。利用分子探針技術(shù)將骨肉瘤細胞分為miR-429高表達組和低表達組，檢測各組骨肉瘤細胞干細胞樣特性。利用轉(zhuǎn)染技術(shù)檢測miR-429對骨肉瘤干細胞樣特性的影響。利用熒光素酶報告基因系統(tǒng)，驗證miR-429下游靶基因。結(jié)果骨肉瘤干細胞中miR-429的表達量明顯減少。miR-429高表達細胞的干細胞特性明顯低于miR-429低表達細胞，且轉(zhuǎn)染實驗驗證了上述結(jié)果。熒光素酶報告實驗顯示，miR-429在轉(zhuǎn)錄后水平上負性調(diào)節(jié)Sox2基因。結(jié)論miR-429可以通過下調(diào)Sox2負性調(diào)節(jié)骨肉瘤干細胞特性。

骨肉瘤； 干細胞； miRNA-429； Sox2

Abstract ObjectiveTo investigate the role of miR-429 in osteosarcoma stem cells.MethodsWe employed different approaches to test the expression of miR-429 in osteosarcoma stem cells. miR-429-high and miR-429-low cells were separated using molecular probes and their stem cell-like properties were compared. The effect of miR-429 on osteosarcoma stem cell-like properties was further tested through transfection assays. Furthermore，the miR-429 downstream target gene was confirmed by luciferase assay.ResultsThe expression of miR-429 in osteosarcoma stem cells was much lower than that in control cells. miR-429-high cells displayed fewer stem celllike properties than did miR-429-low cells. These observations were confirmed by transfection assays. Additionally，our luciferase assays showed that miR-429 regulates Sox2 at the post-transcriptional level.ConclusionmiR-429 negatively regulates osteosarcoma stem celllike properties by targeting Sox2.

Keywordsosteosarcoma； stem cell；miR-429； Sox2

骨肉瘤是最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤，好發(fā)于青少年［1］。傳統(tǒng)化療藥物具有全身毒性，且選擇性差，約有10%～25%的患者會發(fā)生轉(zhuǎn)移和耐藥，治療效果差［2］。因此，有效的骨肉瘤靶向治療是臨床上亟待解決的問題。

腫瘤干細胞是指能夠自我更新和多向分化潛能的腫瘤細胞，在腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和耐藥中扮演重要角色［3］。GIBBS等［4］最先發(fā)現(xiàn)了骨肉瘤細胞里的干細胞，其能夠形成具有自我更新能力的腫瘤球。ADHIKARI等［5］利用表面標(biāo)記CD-117/Stro-1分選出骨肉瘤干細胞，且這群細胞具有顯著增高的化療耐藥和遠處轉(zhuǎn)移特性。miRNAs是一類短鏈非編碼RNA，并在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)基因的表達。miRNAs通常作用于目的mRNA的3’非編碼區(qū)，進而引起基因表達的抑制甚至沉默［6］。但是miRNA與骨肉瘤干細胞的關(guān)系仍然不清楚。本研究擬探討miR-429對骨肉瘤干細胞樣特性的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)

MG63細胞及HEK293細胞購自中國科學(xué)院細胞庫。所有細胞均用含有10%胎牛血清和1%雙抗的完全培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。細胞放置在37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱里培養(yǎng)。利用臺盼藍染色確認(rèn)細胞活力。

1.2 腫瘤懸浮成球?qū)嶒?/h3>

將骨肉瘤細胞接種于低黏附的6孔板上，將細胞密度調(diào)至每孔5 000個腫瘤細胞。培養(yǎng)基額外添加B27、10 ng/mL的EGF和bFGF（美 國Sigma-Aldrich公司）。細胞放至37 ℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱里培養(yǎng)。EGF和bFGF每3 d更換1次。2周后直徑＞50 μ m的球體被認(rèn)定為克隆球，在倒置顯微鏡下計數(shù)。

1.3 流式細胞術(shù)

將腫瘤細胞放在含有0.5%正常兔血清（美國Sigma-Aldrich公司）的PBS中重懸并封閉15 min。細胞隨后標(biāo)記Stro-1和CD117的抗體（美國BioLegend公司），并在冰上維持60 min。利用流式細胞儀分析及記錄結(jié)果，記錄雙陽性細胞比率。將miR-429 Hu-Cy5 SmartFlareTMRNA探針（美國Millipore公司）加入骨肉瘤細胞中，過夜處理16 h。利用流式細胞儀將細胞分選為miR-429高表達組和miR-429低表達組，分選出的細胞用于后續(xù)實驗。

1.4 熒光素酶檢測

基于pMIR-REPORT載體構(gòu)建熒光素酶報道子（美國Ambion公司）。將含有miR-429連接端的Sox2-3’-UTR寡核苷酸鏈合成及退火后，導(dǎo)入熒光素酶報告基因載體。無功能的siRNA序列作為陰性對照。利用脂質(zhì)體（美國Invitrogen公司）將Sox2-3’-UTR及對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK293細胞。

1.5 CCK8實驗

收集細胞制成細胞懸液，用PBS調(diào)整細胞密度為1×105/mL。將各組細胞接種于96孔板中，每孔200 μ L，培養(yǎng)24 h。每孔加入10 μ L CCK-8試劑，37 ℃孵育2 h。采用酶標(biāo)儀檢測450 nm處的光密度值，計算細胞增殖率。每組實驗均重復(fù)3次。

1.6 實時PCR

根據(jù)TRIZOL說明書提取總RNA。按照TaKaRa RNA PCR試劑盒上說明進行逆轉(zhuǎn)錄。應(yīng)用7500 Fast Real-Time PCR System測定Ct值，以U6為內(nèi)參照，以2-ΔΔCt表示mRNA的相對表達量。

1.7 Western blotting

細胞總蛋白提取按照試劑盒操作說明進行（美國Sigma-Aldrich公司）。取40 μ g細胞總蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜，封閉后加一抗anti-oct4（1∶1 000；TA324014，美國OriGene公司）或 anti-Sox2（1∶700；TA321559，美國OriGene公司），4 ℃ 過夜，棄去一抗后加二抗，室溫孵育60 min，DAB顯色，采用凝膠成像系統(tǒng)拍照并分析條帶吸光度。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計量資料以x-±s表示，2組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析，P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-429在骨肉瘤干細胞中低表達

miR-429在MG63 CD117/Stro-1雙陽性細胞群和MG63成球細胞中的表達量顯著降低，順鉑篩選出的骨肉瘤干細胞中miR-429表達量也均低于對照組細胞。由此可見，miR-429可能參與調(diào)節(jié)骨肉瘤干細胞的生長。

2.2 miR-429過表達細胞中表現(xiàn)出較低的干細胞特性

圖1 miR-429在骨肉瘤干細胞中的表達Fig.1 Expression of miR-429 in osteosarcoma stem cells

將骨肉瘤細胞MG63分為miR-429高表達組和低表達組，發(fā)現(xiàn)MG63細胞中的miR-429低表達組CD117和Stro-1雙陽性比率均少于miR-429高表達組。miR-429高表達組中Oct4基因和Sox2基因的表達水平低于miR-429低表達組。懸浮成球?qū)嶒灲Y(jié)果顯示，miR-429低表達組的細胞成球能力強于miR-429高表達組。見圖2。

圖2 miR-429過表達細胞中的干細胞特性Fig.2 Stem cell-like properties of miR-429-high and miR-429-low cells

2.3 miR-429抑制骨肉瘤干細胞特性

分別轉(zhuǎn)染 pre-miR-429（miR-429過表達）、anti-miR-429（拮抗miR-429表達）以及陰性對照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD117和Stro-1雙陽性比率、懸浮成球能力在拮抗miR-429表達組增強，而在miR-429過表達組減少。提示miR-429為一種骨肉瘤干細胞的抑制劑。見圖3。

圖3 miR-429抑制骨肉瘤干細胞特性Fig.3 Downregulation of miR-429 expression promotes osteosarcoma stem cell-like properties

2.4 miR-429負性調(diào)控Sox2的表達

利用Target Scan工具搜索miR-429的目的基因，發(fā)現(xiàn)Sox2-3’-UTR可能是miR-429的靶向序列。將Sox2-3’-UTR-miR-429報道載體及其對照轉(zhuǎn)染至HEK293細胞，結(jié)果顯示熒光素酶活性與加入劑量明顯相關(guān)，轉(zhuǎn)染效力隨著時間增加逐漸消失，2周后轉(zhuǎn)染組與對照組無統(tǒng)計學(xué)差異。實時PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-429過表達組Sox2的mRNA水平并無變化，而其蛋白水平在第7天miR-429過表達組明顯減少，而miR-429拮抗組結(jié)果相反。這些結(jié)果表明miR-429在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)Sox2的蛋白表達。見圖4。

圖4 miR-429負性調(diào)控Sox2的表達Fig.4 miR-429 downregulates Sox2 expression

3 討論

越來越多的證據(jù)表明miRNAs在細胞的增殖、分化以及凋亡中扮演者重要的調(diào)控角色［11］。有研究［12］報道，miRNAs參與調(diào)控正常干細胞以及骨肉瘤干細胞的生長。本研究結(jié)果表明，miR-429在骨肉瘤干細胞中的表達量明顯低于對照組，并負性調(diào)控骨肉瘤干細胞特性。

miR-429與腫瘤關(guān)系密切。miR-429在胃癌組織中表達顯著下調(diào)，可能在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用［13］。肺腺癌細胞中SPC-A1通過增加miR-429表達量抑制肺癌細胞增殖，促進細胞周期阻滯［14］。然而，miR-429與骨肉瘤干細胞的關(guān)系并不清楚。本研究選用3種不同的方法篩選骨肉瘤干細胞，證實了miR-429的表達量在骨肉瘤干細胞中明顯減少。功能實驗表明，下調(diào)miR-429能夠促進骨肉瘤干細胞特性的表達，而上調(diào)miR-429所致的結(jié)果相反。

Sox2在維持骨肉瘤干細胞的生長上扮演者至關(guān)重要的角色［15］。通過Target Scan軟件預(yù)測Sox2 3’-UTR與miR-429不完全互補，提示miR-429可能僅在蛋白水平上抑制Sox2的表達。熒光素酶報道實驗及上下調(diào)功能實驗證實了miR-429通過不完全的靶向作用抑制Sox2的表達。

然而，本研究仍存在一定的局限性。首先，未能提供人來源的骨肉瘤干細胞進行實驗，進而驗證miR-429對人骨肉瘤細胞的作用。第二，不確定miR-429在其他骨的惡性腫瘤中扮演的角色。第三，未能說明除了Sox2之外是否還有基因參與miR-429對骨肉瘤干細胞的調(diào)控。

綜上所述，miR-429通過靶向Sox2調(diào)控骨肉瘤干細胞特性，可以為進一步研究miR-429骨肉瘤發(fā)生發(fā)展過程中所起的作用提供參考，并為研究骨肉瘤干細胞的功能提供理論支持。

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（編輯 于 溪）

miR-429 Negatively Regulates Osteosarcoma Stem Cell-like Properties by Targeting Sox2

YU Ling，ZHANG Zhengpei，SUN Xiangran，ZHENG Di，GUO Weichun

（Department of Orthopedics，Renmin Hospital of Wuhan University，Wuhan 430060，China）

R738.1

A

0258-4646（2017）10-0874-04

http://kns.cnki.net/kcms/detail/21.1227.R.20170927.0942.006.html

10.12007/j.issn.0258‐4646.2017.10.003

國家自然科學(xué)基金（8150257）；中央高?；究蒲谢穑?042015kf0069）

余鈴（1987-），男，主治醫(yī)師，博士.

郭衛(wèi)春，E-mail：guoweichun@aliyun.com

2017-03-13

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2017-09-27 09:42