姜西子，金艾琳，馬琳，唐娜，張清富，孫麗梅，邱雪杉

（中國醫(yī)科大學(xué)1. 附屬第一醫(yī)院病理科，沈陽 110001； 2. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室，沈陽 110122）

非小細(xì)胞肺癌中PHF20與凋亡相關(guān)蛋白Bax的表達(dá)及相關(guān)性

姜西子1，2，金艾琳1，2，馬琳1，2，唐娜1，2，張清富1，2，孫麗梅1，2，邱雪杉1，2

（中國醫(yī)科大學(xué)1. 附屬第一醫(yī)院病理科，沈陽 110001； 2. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室，沈陽 110122）

目的探討化療前非小細(xì)胞肺癌中PHF20與Bax的表達(dá)差異及其相關(guān)性。方法采用免疫組化方法檢測PHF20與Bax在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)情況，分析PHF20的臨床意義以及PHF20與Bax可能存在的相關(guān)性。結(jié)果非小細(xì)胞肺癌中PHF20蛋白在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)。PHF20在鱗癌中高表達(dá)，在腺癌中低表達(dá)，并與細(xì)胞分化程度、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。肺鱗癌中PHF20和Bax的表達(dá)呈正相關(guān)。結(jié)論非小細(xì)胞肺癌中PHF20的表達(dá)變化與腫瘤進(jìn)展密切相關(guān)，而且與Bax表達(dá)存在相關(guān)性，其具體機(jī)制的研究將很可能為非小細(xì)胞肺癌的治療提供新的靶點(diǎn)。

非小細(xì)胞肺癌；PHF20；Bax

Abstract ObjectiveTo investigate the differences in the expression of PHF20 and Bax and their correlations in non-small cell lung cancer before chemotherapy.MethodsAn immunohistochemical method was used to detect the expression of PHF20 and Bax in nonsmall cell lung cancer，and to analyze the clinical significance of PHF20 and the possible correlation between PHF20 and Bax proteins.ResultsPHF20 protein is expressed in the cytoplasm of non-small cell lung cancer cells. Moreover，it is highly expressed in squamous cell carcinoma，less expressed in adenocarcinoma，and closely related with cell differentiation，TNM staging，and lymph node metastasis.The expression of PHF20 and Bax was positively correlated with squamous cell lung carcinoma.ConclusionThe expression of PHF20 in non-small cell lung cancer is closely associated with tumor progression and the expression of Bax. PHF20 may be a new target for the treatment of non-small cell lung cancer.

Keywordsnon-small cell lung cancer； PHF20； Bax

腫瘤的發(fā)生發(fā)展與細(xì)胞增殖和凋亡平衡失調(diào)（特別是凋亡的抑制）相關(guān)。具有植物同源結(jié)構(gòu)域的鋅指蛋白20（PHF20），作為新發(fā)現(xiàn)的1個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，表現(xiàn)出腫瘤抑制因子的活性［1］。PHF20蛋白含有多個(gè)功能域，其第2個(gè)Tudor區(qū)域可識(shí)別并結(jié)合p53，結(jié)合后會(huì)通過阻止p53的泛素化而穩(wěn)定和并促進(jìn)p53的活性轉(zhuǎn)錄［2］。Akt可以磷酸化PHF20，使其從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)，從而喪失穩(wěn)定p53的功能［3］。

Bax蛋白作為主要促凋亡蛋白，能通過控制線粒體膜的通透性來調(diào)節(jié)凋亡進(jìn)而影響細(xì)胞狀態(tài)［4］。在依賴p53的細(xì)胞凋亡中，Bax蛋白表達(dá)明顯受到p53的促進(jìn)［5］。研究［5］證明體外RNA干擾特異性敲除PHF20，可以使p53蛋白及下游Bax凋亡蛋白顯著下調(diào)，在p53缺失的細(xì)胞系中，PHF20敲除后Bax也顯著下降；上調(diào)PHF20后可明顯抑制細(xì)胞增殖和存活。本研究通過檢測非小細(xì)胞肺癌中PHF20和Bax的表達(dá)情況，分析PHF20的臨床意義及PHF20與Bax的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集2008年1月至2012年2月中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科的原發(fā)性肺癌標(biāo)本共195例，并以距離腫塊5 cm的正常肺組織30例作為對(duì)照。所有標(biāo)本經(jīng)2名病理醫(yī)師根據(jù)2009年肺癌TNM分期系統(tǒng)和WTO肺癌分類標(biāo)準(zhǔn)，確定組織類型、細(xì)胞分化以及臨床病理分期。所有患者術(shù)前均未接受放、化療?；颊吣挲g27～78歲，平均年齡58.2歲。其中鱗癌101例，腺癌94例；高分化73例，中分化72例，低分化50例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者99例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者96例；Ⅰ期79例，Ⅱ期68例，Ⅲ期32例，Ⅳ期16例。本研究已獲本單位倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并取得受試者的知情同意。

1.2 免疫組織化學(xué)染色

將石蠟包埋標(biāo)本制成4 μm的切片。采用Eli-Vision兩步法檢測PHF20（1∶75）的表達(dá)，鏈霉素生物素蛋白-過氧化物酶免疫組化法（S-P法）檢測Bax（1∶150）的表達(dá)。以PBS緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照。陽性對(duì)照采用購自福州邁新公司的陽性片。

1.3 陽性判定標(biāo)準(zhǔn)

細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)粗細(xì)一致的棕黃色顆粒者為陽性染色，光鏡下每張切片都選較好的10個(gè)視野（400倍），計(jì)數(shù)1 000個(gè)腫瘤細(xì)胞。將染色強(qiáng)度分3個(gè)等級(jí)并計(jì)分：淺黃色1分，棕黃色2分，黃褐色3分。將PHF20和Bax蛋白表達(dá)百分率分為4個(gè)等級(jí)：≤25%為1分，＞25%～50%為2分，＞50%～75%為3分，＞75%為4分。將染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞率的分值乘積作為最終評(píng)分，分?jǐn)?shù)≥4為陽性表達(dá)，＜4為陰性表達(dá)。本組HE切片診斷和免疫組化染色結(jié)果判讀由2名病理醫(yī)師完成。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件來統(tǒng)計(jì)分析，PHF20和Bax蛋白表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系用χ2檢驗(yàn)分析，PHF20與Bax蛋白表達(dá)的關(guān)系用Spearman等級(jí)相關(guān)分析，P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PHF20和Bax在非小細(xì)胞肺癌和癌旁組織中的表達(dá)

PHF20和Bax蛋白在30例癌旁肺組織中高表達(dá)，陽性表達(dá)率分別為76.7%（23/30）和83.3%（25/30）；PHF20和Bax蛋白在195例非小細(xì)胞肺癌組織中表達(dá)降低，陽性表達(dá)率分別為44.6%（87/195）和62.6%（122/195），兩者都是胞質(zhì)表達(dá)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，在癌旁肺組織和肺癌組織中PHF20蛋白（P = 0.002）和Bax蛋白（P = 0.042）的表達(dá)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.2 PHF20和Bax蛋白表達(dá)與肺癌臨床病理因素的關(guān)系

195例非小細(xì)胞肺癌中，PHF20和Bax蛋白表達(dá)情況與肺癌臨床病理因素具有相關(guān)性，見表1。PHF20和Bax蛋白的陽性表達(dá)率與細(xì)胞分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況相關(guān)。PHF20和Bax的陽性表達(dá)率隨著細(xì)胞分化程度的降低而顯著降低（P分別為0.001和0.002）。在非小細(xì)胞肺癌中，伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時(shí)PHF20和Bax蛋白陽性表達(dá)率較無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時(shí)明顯降低（均P = 0.008）。PHF20蛋白不僅與細(xì)胞分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，還與組織學(xué)分型、TNM分期相關(guān)。PHF20蛋白在肺鱗癌中的陽性表達(dá)率明顯高于肺腺癌中的陽性表達(dá)率（P ＜ 0.001），見圖1、2。TNM分期中Ⅰ期PHF20蛋白表達(dá)率高于Ⅱ～Ⅳ期患者的陽性表達(dá)率（P = 0.008）。PHF20和Bax蛋白的表達(dá)情況與性別、年齡、腫瘤大小無明顯相關(guān)性。

2.3 PHF20和Bax蛋白表達(dá)的相關(guān)性

在101例肺鱗癌組織中，有50例PHF20與Bax蛋白同時(shí)出現(xiàn)陽性表達(dá)，有28例兩者同時(shí)出現(xiàn)陰性表達(dá)，有10例為PHF20陽性表達(dá)而Bax陰性表達(dá)，有13例為PHF20陰性表達(dá)而Bax陽性表達(dá)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P ＜ 0.001），Spearman相關(guān)分析表明，PHF20與Bax表達(dá)具有正相關(guān)性（r = 0.532），見表2。

3 討論

肺癌是人類最為常見的惡性腫瘤之一，其中非小細(xì)胞肺癌占到80%～85%。隨著人口老齡化與生存環(huán)境的污染，肺癌發(fā)病率大幅提高，吸煙人群的增加使肺癌發(fā)病率進(jìn)一步升高，但是目前肺癌的早期診斷受到一定程度的限制，肺癌死亡率已經(jīng)成為惡性腫瘤首位［6］。

PHF蛋白家族主要是含有PHD結(jié)構(gòu)域的鋅指蛋白。鋅指蛋白與人類多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。PHF20作為多區(qū)域蛋白，可以乙酰化p53和組蛋白H4［7］，PHF20是賴氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體的1個(gè)亞基［8］。PHF20具有多個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，其中包括1個(gè)AT-hook區(qū)域、2個(gè)Tudor區(qū)域、1個(gè)PHD 指狀物［9］和1個(gè)C2H2鋅指。其中，與p53結(jié)合的是PHF20的第2個(gè)Tudor區(qū)域，可以特異性地與Lys370或Lys382甲基化或二甲基化的p53多肽相互作用。由小鼠雙微體2（murine double minute-2，Mdm-2）介 導(dǎo) 的p53泛素化的減少正是由于PHF20-p53復(fù)合體的形成，從而通過甲基化的方式維持p53的穩(wěn)定性。PHF20綁定p53的區(qū)域也恰恰是大多數(shù)Mdm-2泛素化的p53位點(diǎn)C端，從而穩(wěn)定并促進(jìn)p53的轉(zhuǎn)錄活性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞增殖［2］。研究［10］發(fā)現(xiàn)，Akt和p53通路的聯(lián)系是通過Akt介導(dǎo)Mdm-2磷酸化實(shí)現(xiàn)的。PHF20的Ser291被活化的Akt磷酸化，使得PHF20從細(xì)胞核移動(dòng)到細(xì)胞質(zhì)而喪失穩(wěn)定p53的功能［3］。本研究結(jié)果表明，非小細(xì)胞肺癌組織中PHF20蛋白的陽性表達(dá)率較癌旁肺組織少，且其陽性表達(dá)率隨細(xì)胞分化程度的降低而降低；鱗癌中的陽性表達(dá)率明顯高于

腺癌，說明與肺癌組織學(xué)分型有關(guān)；伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者比無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者陽性表達(dá)率下降，提示PHF20蛋白具有腫瘤抑制因子的特征。

表1 PHF20和Bax蛋白表達(dá)與肺癌臨床病理因素的關(guān)系Tab.1 The correlation between the expression of PHF20 and Bax proteins and the clinical pathological factors in lung cancer

圖1 PHF20和Bax蛋白在肺鱗癌細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)中的陽性表達(dá) ×200Fig.1 The positive expression of PHF20 and Bax proteins in the cytoplasm of lung squamous cell carcinoma cells ×200

圖2 PHF20和Bax蛋白在肺腺癌細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)中的陽性表達(dá)×200Fig.2 The positive expression of PHF20 and Bax proteins in the cytoplasm of lung adenocarcinoma cells ×200

表2 PHF20和Bax蛋白在肺鱗癌中的相關(guān)性Tab.2 The association of PHF20 and Bax proteins in lung squamous cell carcinoma

在動(dòng)物胚胎發(fā)育和內(nèi)穩(wěn)態(tài)的維持中存在細(xì)胞凋亡，其調(diào)控異常與某些疾病的發(fā)生密切相關(guān)，尤其是癌癥［11］。Bcl-2家族在細(xì)胞凋亡中起著重要作用。Bax是促凋亡基因，屬于Bcl-2家族，自身可以形成同源二聚體或與Bcl-2結(jié)合形成異源二聚體來調(diào)控Bcl-2活性［12］，同時(shí)參與p53依賴的凋亡信號(hào)途徑，促進(jìn)細(xì)胞凋亡［4］。Bax蛋白在多種腫瘤的細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，如喉鱗癌［13］、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、直腸癌、睪丸癌等。已有研究［2］證明，利用體外RNA干擾特異性敲除PHF20蛋白，可以下調(diào)p53蛋白及p53下游的凋亡蛋白p21和Bax；在p53缺失的細(xì)胞系中敲除PHF20蛋白，Bax蛋白仍然顯著下降。本研究結(jié)果顯示，非小細(xì)胞肺癌組織中Bax蛋白的陽性表達(dá)率較癌旁肺組織低，Bax蛋白陽性表達(dá)率主要與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況相關(guān)，伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者比無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者陽性表達(dá)率減弱，這表明Bax蛋白在肺癌發(fā)生發(fā)展過程中可能發(fā)揮了抑制腫瘤細(xì)胞生長增殖以及抑制腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移的作用。本研究結(jié)果與MILAS等［14］的報(bào)道相一致。而且Spearman分析結(jié)果顯示在肺鱗癌中PHF20和Bax蛋白表達(dá)呈現(xiàn)正相關(guān)，進(jìn)一步提示在非小細(xì)胞肺癌中PHF20和Bax蛋白可能存在相互作用來共同調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。

PHF20和Bax蛋白之間可能存在一定的調(diào)控關(guān)系，但是腫瘤細(xì)胞發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素的過程，PHF20和Bax蛋白之間是否通過直接作用來調(diào)控細(xì)胞的生長、增殖和凋亡，以及2種蛋白在腫瘤形成中的關(guān)聯(lián)，PHF20蛋白在腺癌與鱗癌中表達(dá)的差異性有待進(jìn)一步研究。

［1］ FISCHER U，STRUSS AK，HEMMER D，et al. Glioma-expressed antigen 2 （GLEA2）：a novel protein that can elicit immune responses in glioblastoma patients and some controls ［J］. Clin Exp Immunol，2001，126（2）：206-213. DOI：10.1046/j.1365-2249.2001.01635.x.

［2］ CUI G，PARK S，BADEAUX AI，et al. PHF20 is an effector protein of p53 double lysine methylation that stabilizes and activates p53［J］. Nat Struct Mol Biol，2012 ，19（9）：916-924. DOI：10.1038/nsmb.2353.

［3］ PARK S，KIM D，DAN HC，et al. Identification of Akt interaction protein PHF20/TZP that transcriptionally regulates p53［J］. J Biol Chem，2016 ，291（43）：22852. DOI：10.1074/jbc.M111.333922.

［4］ HUSAIN MA，ISHQI HM，SARWAR T，et al. Identification and expression analysis of alternatively spliced new transcript isoform of Bax gene in mouse ［J］. Gene，2017 ，621：21-31. DOI：10.1016/j.gene.2017.04.020.

［5］ MORI S，ITO G，USAMI N，et al. p53 apoptotic pathway molecules are frequently and simultaneously altered in non small cell lung carcinoma ［J］. Cancer，2004，100（8）：1673-1682. DOI：10.1002/cncr.20164.

［6］ LOENARZ C，GE W，COLEMAN ML，et al. PHF8，a gene associated with cleft lip/palate and mental retardation，encodes for an Nepsilon-dimethyl lysine demethylase ［J］. Hum Mol Genet，2010，19（2）：217-222. DOI：10.1093/hmg/ddp480.

［7］ SYKES SM，MELLERT HS，HOLBERT MA，et al. Acetylation of the p53 DNA-binding domain regulates apoptosis induction ［J］. Mol Cell，2006，24（6）：841-851. DOI：10.1016/j.molcel.2006.11.026.

［8］ CAI Y，JIN J，SWANSON SK，et al. Subunit composition and substrate specificity of a MOF-containing histone acetyltransferase distinct from the male-specific lethal （MSL） complex ［J］. J Biol Chem，2010，285（7）：4268-4272. DOI：10.1074/jbc.C109.087981.

［9］ ADAMS-CIOABA MA，LI Z，TEMPEL W，et al. Crystal structures of the Tudor domains of human PHF20 reveal novel structural variations on the royal family of proteins［J］. FEBS Lett，2012，586（6）：859-865. DOI：10.1016/j.febslet.2012.02.012.

［10］ LESSARD J，WU JI，RANISH JA，et al. An essential switch in subunit composition of a chromatin remodeling complex during neural development［J］. Neuron， 2007，55（2）：201-215. DOI：10.1016/j.neuron.2007.06.019.

［11］ HALE AJ，SMITH CA，SUTHERLAND LC，et al. Apoptosis：molecular regulation of cell death ［J］. Eur J Biochem，1996，236（1）：1-26.DOI：10.1111/j.1432-1033.1996.00001.x.

［12］ ROSSE T，OLIVIER R，MONNEY L，et al. Bcl-2 prolongs cell survival after Bax-induced release of cytochrome c ［J］. Nature，1998，391（6666）：496-499. DOI：10.1038/35160.

［13］ 張春明，高偉，董蜀斌，等. Bax與PHF20蛋白在喉鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及臨床意義［J］. 臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2015，29（19）：1701-1705. DOI：10.13201/j.issn.1001-1781.2015.19.009.

［14］ MILAS I，KOMAKI R，HACHIYA T，et al. Epidermal growth factor receptor，cyclooxygenase-2，and BAX expression in the primary nonsmall cell lung cancer and brain metastases［J］. Clin Cancer Res，2003 ，9（3）：1070-1076.

（編輯 于 溪）

Expression and Correlation of PHF20 and Apoptosis-associated Protein Bax in Non-small Cell Lung Cancer

JIANG Xizi1，2，JIN Ailin1，2，MA Lin1，2，TANG Na1，2，ZHANG Qingfu1，2，SUN Limei1，2，QIU Xueshan1，2

（1. Department of Pathology，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China； 2. Department of Pathology，College of Basic Medical Sciences，China Medical University，Shenyang 110122，China）

R734.2

A

0258-4646（2017）10-0887-04

http://kns.cnki.net/kcms/detail/21.1227.R.20170927.1452.012.html

10.12007/j.issn.0258‐4646.2017.10.006

遼寧省教育廳高等學(xué)校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（LT2015029）

姜西子（1991-），女，碩士研究生.

孫麗梅，E-mail：limeisun@hotmail.com

2017-03-28

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2017-09-27 14:52