程俊文，賀 亮，魏海龍，宋吉玲，胡傳久，鄒景泉，李海波，蔣云鶴

（1. 浙江省林業(yè)科學(xué)研究院 浙江省森林資源生物與化學(xué)利用重點實驗室，浙江 杭州 310023；

2. 杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院， 浙江 杭州 310024）

doi:10.3969/j.issn.1001-3776.2017.04.006

超聲波協(xié)同復(fù)合酶法提取桑黃多糖工藝優(yōu)化

程俊文1，賀 亮1，魏海龍1，宋吉玲2，胡傳久1，鄒景泉1，李海波1，蔣云鶴1

（1. 浙江省林業(yè)科學(xué)研究院 浙江省森林資源生物與化學(xué)利用重點實驗室，浙江 杭州 310023；

2. 杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院， 浙江 杭州 310024）

doi:10.3969/j.issn.1001-3776.2017.04.006

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，通過Box-Benhnken組合設(shè)計和響應(yīng)曲面分析法優(yōu)化桑黃Inonotus sanghuang子實體中多糖的超聲波協(xié)同復(fù)合酶法提取工藝條件。在前期預(yù)實驗的基礎(chǔ)上，采用纖維素酶、果膠酶和蛋白酶按2:1:1組成復(fù)合酶對桑黃子實體進(jìn)行酶解處理，添加量為2%，溫度50℃，pH 6.5，在水溶液中酶解1 h。然后對工藝中的超聲波功率、超聲時間、液料比進(jìn)行優(yōu)化。響應(yīng)面分析結(jié)果表明，桑黃子實體中多糖的最佳提取條件為：超聲功率360.6 W，液料比32.5:1，超聲時間32.7 min，多糖得率可得3.31%，與理論值3.46%基本吻合。

桑黃；多糖；超聲波；復(fù)合酶；響應(yīng)面

Abstract：Extraction technology of polysaccharide from Inonotus sanghuang was optimized by ultrasonic-assisted enzymatic method and response surface analysis. Based on the results of single factor experiment, enzymolysis of I. sanghuang sporcarp was carried out with 2% of complex phosphoesterasum (ratio of cellulose, pectinase, protease of 2:1:1) at 50℃ under pH of 6.5 for 1 hour. Then optimization of extraction technology was implemented on ultrasonic power, ultrasound time and ratio of liquid and material. The response surface analysis demonstrated that polusaccharide yield topped 3.31% under condition as follows: ultrasonic power 360.6W, liquid/material ratio 32.5:1, ultrasound treatment time 32.7minutes, similar to theoretical value of 3.46%.

Key words:Inonotus sanghuang; polysaccharide; ultrasonic; compound enzyme; response surface methodology

桑黃，中藥名，為桑黃纖孔菌Inonotus sanghuang的子實體，屬擔(dān)子菌亞門 Basidiomycotina[1]銹革孔菌科Hymenochaetaceae纖孔菌屬Inonotus，是一種珍貴的藥用真菌。醫(yī)學(xué)研究表明，桑黃具有抗腫瘤、抗氧化、抗肝纖維化、增強免疫等藥理活性[2-4]，被國際公認(rèn)為抗腫瘤效果最好的藥用真菌之一。與大多數(shù)藥用真菌一樣，桑黃水提物的主要活性成分是多糖，而多糖是構(gòu)成真菌細(xì)胞壁的主要成分，與纖維素、蛋白質(zhì)等緊密聯(lián)結(jié)，不易分離。近年來，浙江、安徽等省桑黃人工栽培規(guī)模不斷擴大，因此對桑黃多糖提取技術(shù)的研究具有重要的意義。

目前，桑黃多糖的提取方法多為傳統(tǒng)的熱水浸提法，該法操作簡單，但提取時間長、提取率低。酶具有水解纖維素、原果膠和糖蛋白的作用，酶的高效性能夠節(jié)約提取能源與時間，酶的專一性使得到的產(chǎn)物穩(wěn)定，純度、活性高[5]；超聲波是一種彈性波，產(chǎn)生并傳遞強大的能量，能使物質(zhì)中分子加速運動，有利于植物細(xì)胞中的有效成分轉(zhuǎn)移、擴散及提取[6]。本實驗采用超聲波協(xié)同復(fù)合酶法提取桑黃多糖，達(dá)到提高多糖提取率的目的。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

桑黃子實體由浙江省森林資源生物與化學(xué)利用重點實驗室人工培育，菌種為桑黃纖孔菌，2015年5月采自浙江省淳安縣，采用液氮法保存；蛋白酶（酶活力8×104U?g-1）、果膠酶（酶活力9×104U?g-1）、纖維素酶（酶活力2.5×104U?g-1）均購自上海伯奧生物科技有限公司；苯酚、無水乙醇、氯仿、正丁醇均為國產(chǎn)分析醇，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器

R-201旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海申勝生物技術(shù)有限公司；20B型中藥粉碎機，南京邦斯特制藥設(shè)備有限公司；JY92-ⅡDN超聲波細(xì)胞粉碎機，寧波新芝生物科技股份有限公司；DKZ-2型電熱恒溫振蕩水槽，上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司；PL602-S電子天平，梅特勒—托利多儀器（上海）有限公司；UV-2600紫外分光光度計，日本島津公司。

1.2 方法

1.2.1 桑黃子實體多糖的提取 取干燥的桑黃子實體，用20B型中藥粉碎機粉碎成40目，用95%乙醇浸提12 h，抽濾，取濾渣風(fēng)干粉碎備用。稱取1 g預(yù)處理子實體粉，按液料比40:1（mL:g）加水混勻，用檸檬酸調(diào)節(jié)pH值，根據(jù)各種生物酶的最佳酶活作用條件，在前期預(yù)實驗的基礎(chǔ)上，纖維素酶、果膠酶、蛋白酶按2:1:1組成復(fù)合酶，添加量為2%，溫度50℃，pH 6.5，在水溶液中酶解1 h，然后在一定液料比、超聲功率、超聲時間下利用JY92-ⅡDN超聲波細(xì)胞粉碎機進(jìn)行提取，3 000 r?min-1離心10 min，上清液用乙醇醇沉4 h后3 000 r?min-1離心5 min，沉淀溶解后測定。

1.2.2 響應(yīng)面法分析實驗 選擇超聲功率、液料比、超聲時間3個因素所確定的水平范圍，運用Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計原理，采用3因素3水平的響應(yīng)面設(shè)計，利用Design Expert 8.05軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析。自變量的試驗水平分別以-1，0，1進(jìn)行編碼，試驗因素及水平設(shè)計見表1。

1.3 分析方法

1.3.1 桑黃多糖含量的測定 采用苯酚-硫酸比色法[7]。

1.3.2 多糖得率計算

多糖得率（Y）/%＝多糖含量×稀釋體積樣品干質(zhì)量×100

1.3.3 實驗數(shù)據(jù)分析 用Design Expert 8.05進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和處理。

表1 響應(yīng)面分析因子及水平Table 1 Factors and levels of response surface analysis

2 結(jié)果與分析

2.1 響應(yīng)面分析方案及結(jié)果

根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計原理，共有17個試驗點，其中12個為析因點，5個零點試驗用以估計試驗誤差。以多糖得率為響應(yīng)值，試驗方案及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計方案及試驗結(jié)果Table 2 Design and results by RSM

2.2 回歸模型建立及方差分析

用Design Expert 8.05對表2實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析[8]，獲得多糖得率對超聲功率、液料比和超聲時間的多元二次回歸方程：

由表3可知，以多糖得率為目標(biāo)函數(shù)的回歸方程的回歸效果達(dá)到極顯著水平，P值均＜0.000 1；模型的決定系數(shù)R2= 0.971 5，說明模型與實際實驗擬合較好；校正決定系數(shù)AdjR2= 0.934 8，說明該模型能解釋97.15%響應(yīng)值的變化；模型的失擬項表示模型預(yù)測值與實際值不擬合的概率，表3中模型失擬項的P值為0.166 3，大于0.05，表明模型的失擬項不顯著；根據(jù)表3的顯著性分析結(jié)果，各因素的一次項、二次項以及X1X3、X2X3的交互項對多糖得率的影響均呈顯著（P＜0.05）影響。分析表明這個模型建立的回歸方程能運用于超聲波協(xié)同復(fù)合酶法提取桑黃子實體多糖提取條件優(yōu)化的理論預(yù)測。

表 3回歸模型方差分析Table 3 ANOVA of regression model

2.3 響應(yīng)面圖形分析

分別將模型中的超聲功率、液料比及超聲時間的其中一個因素固定在0水平，得到另外兩個因素的交互影響結(jié)果，二次回歸方程的響應(yīng)面及其等高線如圖1，圖2，圖3所示，各個因素及其相互間的交互作用對響應(yīng)值的影響結(jié)果通過該組圖可以直觀地反映出來。極值條件應(yīng)該在等高線的圓心處。由幾組圖可以看出，影響桑黃子實體多糖提取得率的最顯著因素為超聲功率（X1），表現(xiàn)為響應(yīng)面變化弧度較大。超聲時間（X3）和液料比（X2）響應(yīng)面弧度變化平緩，說明對響應(yīng)值影響相對較小。

此外，等高線的形狀可反映出交互效應(yīng)的強弱，橢圓形表示二因素交互作用顯著，而圓形則與之相反[9]。從圖1至圖3可以看出，X2與X3，X1與X3之間交互作用顯著。

圖1 超聲功率和液料比交互影響多糖得率的曲面圖（A）和等高線圖（B）Figure 1 Surface diagram and contour of polysaccharide yield under interaction of ultrasonic power and liquid/ material ratio

圖2 超聲功率和超聲時間交互影響多糖得率的曲面圖（A）和等高線圖（B）Figure 2 Surface diagram and contour of polysaccharide yield under interaction of ultrasonic power and treatment time

圖3 液料比和超聲時間交互影響多糖得率的曲面圖（A）和等高線圖（B）Figure 3 Surface diagram and contour of polysaccharide yield under interaction of liquid/ material ratio and ultrasonic treatment time

2.4 驗證實驗

根據(jù)Box-Behnken試驗所得的結(jié)果和二次多項回歸方程，利用Design Expert 8.05分析，得到最佳提取條件為：超聲功率360.6 W，液料比32.5:1，超聲時間32.7 min，多糖得率理論值可達(dá)3.46%。

為檢驗?zāi)Ｐ皖A(yù)測值與實際實驗值之間的相關(guān)性，即檢驗響應(yīng)面優(yōu)化模型的可靠性，對桑黃子實體中多糖提取得率進(jìn)行實驗驗證。實驗中超聲功率、液料比和超聲時間的優(yōu)化值分別為360.6 W，32.5:1，32.7 min，三次平行實驗，測得多糖得率分別為3.29%，3.35%，3.28%，實際多糖得率平均值為3.31%，達(dá)到了回歸模型預(yù)測理論值的95.7%，實驗結(jié)果與模型符合良好，說明該模型能較好地模擬和預(yù)測桑黃子實體多糖得率。

3 結(jié)論

本實驗針對桑黃子實體組織結(jié)構(gòu)木質(zhì)化程度高，傳統(tǒng)的熱水浸提法多糖得率普遍較低的情況，通過集成運用生物酶法和超聲波法，先采用纖維素酶、果膠酶、蛋白酶按2:1:1組成復(fù)合酶對桑黃子實體進(jìn)行酶解處理，添加量為2%，溫度50℃，pH 6.5，在水溶液中酶解1 h。進(jìn)而對工藝中超聲波功率、超聲時間、液料比等參數(shù)條件進(jìn)行了實驗設(shè)計，根據(jù)Box-Benhnken中心組合實驗設(shè)計及三因素三水平的響應(yīng)面分析，通過二次多項回歸模型進(jìn)行方差分析和回歸擬合，預(yù)測了桑黃子實體多糖的最佳提取工藝條件為：超聲功率360.6 W，液料比32.5:1，超聲時間32.7 min，多糖得率理論值可達(dá)3.46%。驗證實驗中多糖得率3.31%，與預(yù)測值十分接近，證明了該實驗方法的穩(wěn)定性。

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Ultrasonic-assisted Enzymatic Method Extraction of Polysaccharide from Inonotus sanghuang

CHENG Jun-wen1，HE Liang1，WEI Hai-long1，SONG Ji-ling2，HU Chuan-jiu1，ZOU Jing-quan1，LI Hai-bo1，JIANG Yun-he1
（1. Zhejiang Academy of Forestry, Key Laboratory of Biological and Chemical Utilization of Forest Resources, Hangzhou 310023, China; 2.Hangzhou Academy of Agricultural Sciences of Zhejiang, Hangzhou 310024, China）

TQ461

A

1001-3776（2017）04-0033-06

2017-03-09；

2017-06-23

浙江省科技廳院所專項（2014F50018）；國家自然科學(xué)基金項目（31501815）；浙江省農(nóng)業(yè)（食用菌）新品種選育項目（2016C02057-8）和杭州市科委種子種苗專項（20150932H07）的部分研究內(nèi)容

程俊文，碩士，副研究員，從事食用藥用菌活性成分加工研究；E-mail：jwchengzj@163.com。通信作者：鄒景泉，工程師，從事森林資源研究；E-mail：422046791@qq.com。