云清英，徐剛

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院 檢驗科，山東 濟南 250001；2.中國醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院，遼寧 沈陽 110000）

HIF-1α在成人急性淋巴細胞白血病患者骨髓單個核細胞中的表達及意義*

云清英1，徐剛2

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院 檢驗科，山東 濟南 250001；2.中國醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院，遼寧 沈陽 110000）

目的探討低氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）在成人急性淋巴細胞白血?。ˋLL）患者骨髓單個核細胞中的表達及意義。方法選取73例成人初診ALL患者，同期留取非白血病骨髓30份作為對照組，采集并分離骨髓單個核細胞，利用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)檢測骨髓單個核細胞中HIF-1α基因表達，利用Kaplan-Meier生存分析分析HIF-1α基因表達對患者無復(fù)發(fā)生存時間的影響。結(jié)果成人初診ALL患者骨髓單個核細胞中HIF-1α mRNA相對表達量（1.86±0.18），高于對照組（1.17±0.09），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=25.020，P=0.000）；B系-ALL（B-ALL）和T系-ALL（T-ALL）患者骨髓單個核細胞中HIF-1α mRNA相對表達量均高于對照組（P＜0.05），而 B-ALL和T-ALL患者之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.807，P=0.211）；費城染色體（Ph）陽性和Ph陰性患者HIF-1α mRNA相對表達量均高于對照組（P＜0.05），而Ph陽性和Ph陰性患者之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=1.314，P=0.096）；B-ALL和T-ALL成人初診ALL患者骨髓單個核細胞中HIF-1α信使核糖核酸（mRNA）相對表達量均與性別、年齡、白細胞水平和危險度分級無關(guān)（P＞0.05）；以HIF-1α mRNA相對表達量的P25為截點，將患者分為低表達組（n=18）和高表達組（n=55），低表達組隨訪中復(fù)發(fā)4例，復(fù)發(fā)率22.2%，高表達組隨訪中復(fù)發(fā)20例，復(fù)發(fā)率36.4%，Kaplan-Meier生存分析顯示，低表達組無復(fù)發(fā)生存時間11.2個月，長于高表達組的8.6個月，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=1.771，P=0.183）。結(jié)論HIF-1α在成人初診ALL患者骨髓單個核細胞中呈高表達，可能與ALL患者化療耐藥及復(fù)發(fā)相關(guān)。

急性淋巴細胞白血?。怀扇?；低氧誘導(dǎo)因子-1α；骨髓單個核細胞

Abstract:ObjectiveTo investigate the expression and significance of hypoxia-inducible factor-1α (HIF-1α)in bone marrow mononuclear cells of adult patients with acute lymphoblastic leukemia (ALL).MethodsSeventy-three adult patients with newly-diagnosed ALL were selected.In the same period,30 samples of bone marrow from non-leukemic patients were selected as the control group.Bone marrow mononuclear cells were harvested and isolated.The expression ofHIF-1αgene in bone marrow mononuclear cell was detected by qRT-PCR.The effect of the expression ofHIF-1αgene on the relapse-free survival time was analyzed by Kaplan-Meier.ResultsThe relative expression level of HIF-1α mRNA in bone marrow mononuclear cells of the adult patients with newly diagnosed ALL was (1.86±0.18),which was significantly higher than that ofthe control group (1.17±0.09),and the difference was statistically significant(t=25.020,P=0.000).The relative expression levels of HIF-1α mRNA in bone marrow mononuclear cells of the patients with B-ALL and T-ALL were higher than those of the control group (P＜0.05),while there was no significant difference between those with B-ALL and T-ALL(t=0.807,P=0.211).The relative expression levels of HIF-1α mRNA in bone marrow mononuclear cells of Philadelphia chromosome (Ph)-positive and Ph-negative patients were higher than those of the control group(P＜0.05),while there was no significant difference between Ph-positive group and Ph-negative group(t=1.314,P=0.096).The relative expression levels of HIF-1α mRNA in bone marrow mononuclear cells of the B-ALL and T-ALL patients were unrelated with sex,age,leukocyte level or risk grade (P＞0.05).According to the cutoff value of P25 of the relative expression level of HIF-1α mRNA,the patients were divided into the low expression group(n=18)and the high expression group(n=55).During the follow-up period,4 cases in the low expression group had recurrence,the recurrence rate was 22.2%;20 cases in the high expression group had recrudescence,the recurrence rate was 36.4%.Kaplan-Meier survival analysis showed that the relapse-free survival time in the low expression group was 11.2 months,which was longer than that of the high expression group (8.6 months),but the difference was not statistically significant(χ2=1.771,P=0.183).ConclusionsHIF-1α is highly expressed in bone marrow mononuclear cells of adult patients with newly diagnosed ALL.It may be associated with chemotherapy resistance and recurrence.

Keywords:acute lymphoblastic leukemia;adult;HIF-1α;bone marrow mononuclear cells

急性淋巴細胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）約占成人急性白血病的21%～30%，是成人最為常見的急性白血病類型[1]，雖然已有的治療手段可使多數(shù)患者緩解，但成人ALL患者復(fù)發(fā)率較高，且易發(fā)生化療耐藥，嚴重影響患者預(yù)后[2]。目前，ALL發(fā)病機制尚未完全清楚，有研究指出[3]，缺氧微環(huán)境與腫瘤腫瘤細胞增殖、遷移、侵襲及化療耐藥密切相關(guān)。亦有研究指出[4]，缺氧是急性白血病患者骨髓微環(huán)境的重要組成部分，與細胞增殖及化療敏感性有關(guān)。低氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）作為缺氧條件下機體重要的調(diào)控因子，與多種惡性腫瘤發(fā)生及進展有關(guān)，在調(diào)控腫瘤細胞增殖、分化、生長、侵襲及血管新生等生物學(xué)功能中發(fā)揮重要作用[5]。有研究指出[6]，在原代急性髓系白血病細胞中HIF-1α呈高表達。本研究擬對成人ALL患者外周血單個核細胞中HIF-1α表達進行分析，旨在探討HIF-1α在成人ALL發(fā)病及進展中的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 臨床資料選取2012年2月-2015年12月在本院住院治療的成人初診ALL患者73例。其中，男性33例，女性40例；年齡20～57歲，中位年齡36.4歲；所有患者均經(jīng)骨髓細胞學(xué)、分子生物學(xué)、遺傳學(xué)及免疫分型檢查確診；B系 ALL（B-ALL）46例，T系A(chǔ)LL（T-ALL）27例；Ph陽性13例，Ph陰性60例。同期，留取非白血病骨髓30份作為對照組，均排除血液系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤、急慢性感染及其他疾病者。其中，男性18例，女性12例；年齡19～59歲，中位年齡37.1歲。本研究通過醫(yī)院倫理委員會批準，所有研究對象均行知情同意。

1.1.2 主要試劑和設(shè)備總核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）提取試劑盒（Trizol法）（購自美國 Invitrogen公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增試劑盒（均購自大連寶生物公司），HIF-1α及內(nèi)參引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計合成，F(xiàn)ic011分離液購自中科院血液病學(xué)研究所，實時熒光定量PCR儀（購自美國Bio-rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 治療方案及效果評估所有患者均按照《中國成人急性淋巴細胞白血病診斷與治療專家共識》[7]方案進行治療，并進行效果評估。初診之前均未進行過ALL相關(guān)治療，復(fù)發(fā)前均按照正規(guī)的化療方案進行治療，經(jīng)過第1個療程治療后，完全緩解49例，未緩解24例。

1.2.2 標本采集及骨髓單個核細胞分離所有研究對象于無菌操作下抽取骨髓約5 ml，抗凝，4 h內(nèi)按等體積比緩慢加入到Fic011分離液上層，于1500轉(zhuǎn)/min，離心15 min，細胞分為3層，將位于中間層的單個核細胞小心吸出，置入-80℃冰箱冷凍保存待備檢。

1.2.3 利用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測骨髓單個核細胞中HIF-1α基因表達取骨髓單個核細胞，加入細胞裂解液進行裂解后，用總RNA提取試劑盒對單個核細胞中總RNA進行提取，利用紫外分光光度計對總RNA純度進行檢測，取A260/A280≥1.80作為合格樣品。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為模板單鏈cDNA，用互補脫氧核糖核酸（complem entary deoxyribonucleic acid，cDNA）為模板，用 PCR試劑盒進行PCR。引物序列：HIF-1α引物，正向5'-GGGGAGGACGATGAACATCAA-3'；反向 5'-GGGTG GTTTCTTGTACCCACA-3'。β-actin，正向 5'-GGCT GTATTCCCCTCCATCG-3'；反向 5'-CCAGTTGGTAA CAATGCCATGT-3'。PCR 反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性 30s，95℃變性 30 s，60℃退火 30 s，76℃延伸 30 s，連續(xù)進行38次循環(huán)。每個樣品均設(shè)置3個平行反應(yīng)復(fù)孔。用2-△△Ct法對骨髓單個核細胞中HIF-1α基因相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組比較用獨立樣本t檢驗，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗，利用Kaplan-Meier生存分析HIF-1α基因表達對患者無復(fù)發(fā)生存時間的影響，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 成人初診ALL患者骨髓單個核細胞中HIF-1α基因表達情況

成人初診ALL患者骨髓單個核細胞中HIF-1α mRNA相對表達量（1.86±0.18），高于對照組的（1.17±0.09），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=25.020，P=0.000）。

2.2 不同亞型成人初診ALL患者骨髓單個核細胞中HIF-1α基因表達比較

B-ALL和T-ALL成人初診ALL患者骨髓單個核細胞中HIF-1α mRNA相對表達量分別為（1.83±0.11）和（1.92±0.25），均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=31.199和 13.188，P＜0.05），而 B-ALL和 TALL患者比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.807，P=0.211）；Ph陽性和Ph陰性患者HIF-1α mRNA相對表達量分別為（1.81±0.09）和（1.87±0.16），均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=25.467和 20.718，P＜0.05），而Ph陽性和Ph陰性患者比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=1.314，P=0.096）。

2.3 成人初診ALL患者骨髓單個核細胞中HIF-1α基因表達與臨床指標的關(guān)系

B-ALL和T-ALL成人初診ALL患者骨髓單個核細胞中HIF-1α mRNA相對表達量均與性別、年齡、白細胞水平和危險度分級比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（見附表）。

附表 成人初診ALL患者骨髓單個核細胞中HIF-1α基因表達與臨床指標的關(guān)系 （±s）

附表 成人初診ALL患者骨髓單個核細胞中HIF-1α基因表達與臨床指標的關(guān)系 （±s）

臨床指標性別/例男 女年齡/歲≤35 35～5050～69白細胞水平（個/L）B系 ＜30×109或T系 ＜100×109B系≥30×109或T系≥100×109危險度分級標危 高危B-ALL 20 26 15 18 13 22 24 18 28 HIF-1α mRNA 1.80±0.09 1.85±0.16 1.81±0.10 1.84±0.13 1.87±0.17 1.82±0.12 1.88±0.18 1.79±0.08 1.85±0.19 t/F值 1.479 2.018 0.629 0.954 P值 0.073 0.145 0.266 0.173 T-ALL 13 14 7 12 8 12 15 13 16 HIF-1α mRNA 1.88±0.17 1.94±0.24 1.90±0.19 1.93±0.22 1.96±0.27 1.87±0.21 1.97±0.26 1.91±0.20 1.95±0.28 t/F值 1.207 0.469 0.477 0.634 P值 0.119 0.631 0.319 0.266

2.4 不同治療效果成人初診ALL患者骨髓單個核細胞中HIF-1α基因表達比較

完全緩解組成人初診ALL患者骨髓單個核細胞中HIF-1α mRNA相對表達量為（1.73±0.10），低于未緩解組的（1.82±0.12），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.874，P=0.003）。

2.5 成人初診ALL患者骨髓單個核細胞中HIF-1α基因表達與復(fù)發(fā)的相關(guān)性

所有患者均隨訪1年，未出現(xiàn)失訪病例，隨訪過程中復(fù)發(fā)24例。以HIF-1α mRNA相對表達量的P25為截點，患者分為低表達組（n=18）和高表達組（n=55），低表達組隨訪中復(fù)發(fā)4例，復(fù)發(fā)率22.2%，高表達組隨訪中復(fù)發(fā)20例，復(fù)發(fā)率36.4%，Kaplan-Meier生存分析顯示，低表達組無復(fù)發(fā)生存時間11.2個月，長于高表達組的8.6個月，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=1.771，P=0.183）（見附圖）。

附圖 成人初診ALL患者HIF-1α mRNA相對表達量對無復(fù)發(fā)生存時間的影響

3 討論

ALL作為成人常見的急性白血病類型，化療耐藥及復(fù)發(fā)是影響患者預(yù)后的主要因素，即使是復(fù)發(fā)后采取更強的化療藥物治療，治愈率僅有30%～40%[7]，而且這些患者再次化療失敗風險較高、生存率則更低[8]。因此，積極探討影響成人ALL化療耐藥及復(fù)發(fā)的相關(guān)因素，對改善患者預(yù)后具有重要意義。有研究指出[9]，白血病患者脊髓微環(huán)境缺氧在化療耐藥及白血病細胞增殖中發(fā)揮重要作用。HIF-1作為重要的缺氧誘導(dǎo)因子，在常氧環(huán)境中性質(zhì)不穩(wěn)定，而在缺氧環(huán)境下可穩(wěn)定存在，且與細胞增殖、分化、生長及侵襲能力有關(guān)，HIF-1α是HIF-1重要的亞基類型，在HIF-1發(fā)揮作用中起關(guān)鍵性作用[10]。惡性腫瘤細胞由于過度增殖，遠超腫瘤血管供氧能力而使組織局部缺氧，成為惡性腫瘤重要特征[11]，現(xiàn)有研究已證實[12]，HIF-1α在多數(shù)實體瘤組織中存在不同程度高表達。本研究顯示，成人初診ALL患者骨髓單個核細胞中HIF-1α mRNA相對表達量高于對照組，說明HIF-1α在成人初診ALL患者骨髓單個核細胞中呈高表達，可能參與了ALL的發(fā)生。

在對不同亞型成人初診ALL患者分析發(fā)現(xiàn)，成人初診ALL患者骨髓單個核細胞中HIF-1α mRNA相對表達量在B-ALL和T-ALL、Ph陽性和Ph陰性比較無差異，說明HIF-1α基因在成人初診ALL患者骨髓單個核細胞中高表達與ALL的亞型無關(guān)，提示成人ALL患者骨髓造血微環(huán)境可能普遍存在缺氧改變，與ALVAREZ-MARTINS等[13]研究結(jié)論相同。本研究在分析骨髓單個核細胞中HIF-1α基因表達與臨床指標相關(guān)性時發(fā)現(xiàn)，ALL患者骨髓單個核細胞中HIF-1α基因表達與性別、年齡、白細胞水平和危險度分級無關(guān)，但可以看出，女性、年齡50～69歲、白細胞水平升高、高?；颊逪IF-1α基因表達水平呈升高趨勢，分析原因可能與本研究樣本量較少有關(guān)。本研究顯示，完全緩解組成人初診ALL患者骨髓單個核細胞中HIF-1α mRNA相對表達量低于未緩解組，說明HIF-1α可能與成人初診ALL患者化療效果有關(guān)，可能參與化療耐藥的發(fā)生，進一步隨訪1年發(fā)現(xiàn)，HIF-1α基因低表達組，復(fù)發(fā)率22.2%，低于高表達組的36.4%，Kaplan-Meier生存分析顯示，低表達組無復(fù)發(fā)生存時間11.2個月，長于高表達組的8.6個月，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示成人初診ALL患者骨髓單個核細胞中HIF-1α基因高表達可能參與了患者復(fù)發(fā)，是導(dǎo)致ALL患者對化療藥物不敏感及復(fù)發(fā)的因素。

綜上所述，HIF-1α在成人初診ALL患者骨髓單個核細胞中呈高表達，可能與ALL患者化療耐藥及復(fù)發(fā)相關(guān)，有望成為成人ALL治療靶點，尤其為難治復(fù)發(fā)性患者治療提供靶點。

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Expression and significance ofHIF-1αin bone marrow mononuclear cells of adult patients with ALL*

Qing-ying Yun1,Gang Xu2
(1.Clinical Laboratory,the Second Affiliated Hospital,Shandong University of Traditional Chinese Medicine,Jinan,Shandong 250001,China;2.The Fourth Hospital of China Medical University,Shenyang,Liaoning 110000,China)

R733.71

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.21.009

1005-8982（2017）21-0049-05

2017-01-17

遼寧省自然科學(xué)基金（No：2013021039）