彭健，張耀婷，李慧，肖小龍，韋超盈，周宇箏，盧愛，張禮銘，周梅，陳杰，丁成明，夏贊賢

（1.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410008；2.中南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410013）

啤酒酵母Ubr1野生型和缺失型菌株的比較蛋白組學(xué)分析*

彭健1，張耀婷1，李慧2，肖小龍2，韋超盈2，周宇箏2，盧愛2，張禮銘2，周梅2，陳杰1，丁成明1，夏贊賢2

（1.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410008；2.中南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410013）

目的尋找并驗(yàn)證Ubr1泛素化底物蛋白大規(guī)模篩選方法的可行性。方法通過對(duì)啤酒酵母RJD347（Ubr1野生型）和AVY26（Ubr1缺失型）的差異蛋白質(zhì)組學(xué)比較，分析酵母中可能存在的Ubr1直接或間接作用的底物蛋白。進(jìn)一步通過外源表達(dá)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證差異蛋白與Ubr1之間的相關(guān)性。結(jié)果組學(xué)研究得到249個(gè)差異表達(dá)蛋白，其中145個(gè)蛋白在AVY26（Ubr1缺失型）中表達(dá)上調(diào)。選取其中40個(gè)并外源表達(dá)驗(yàn)證5個(gè)差異蛋白MLC2、SCD6、ARG1、HOG1及RTF1與Ubr1具有相關(guān)性，受泛素連接酶Ubr1的泛素化調(diào)控。結(jié)論建立Ubr1泛素化底物候選蛋白庫(kù)，同時(shí)驗(yàn)證出5個(gè)潛在Ubr1泛素化底物蛋白。

啤酒酵母；泛素連接酶E3成分N-識(shí)別蛋白1；泛素化；蛋白質(zhì)組學(xué)

Abstract:ObjectiveTo justify the rationality of proteomic screening on a large scale and identify potential substrates ofUbr1with the approach.MethodsIn this work,comparative proteomic analysis between RJD347(Ubr1wild type)and AVY26(Ubr1deletion type)has been performed to screen the possible substrate proteins ofUbr1.Moreover,the correlation between the differentially expressed proteins andUbr1was further verified by protein work.ResultsIn total,249 proteins which were differentially expressed were identified,of which 145 proteins were up-regulated in AVY26.Furthermore,the protein work confirmed 5 proteins including MLC2,SCD6,ARG1,HOG1 and RTF1 that were closely related toUbr1.ConclusionsA massive database of 249 proteins that are differentially expressed between RJD347 and AVY26 is established.Five potential substrates ofUbr1ubiquitination proteins is identified,which provides the experimental basis for further understanding of biological processes ofUbr1.

Keywords:Saccharomyces cerevisiae;ubiquitin protein ligase E3 component N-recognin 1;ubiquitination;proteomics

泛素（ubiquitin）是一種包含76個(gè)氨基酸并存在 于所有真核生物中的小分子蛋白[1]。泛素化修飾參與細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞增殖和凋亡、脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）損傷、基因表達(dá)、信號(hào)傳遞及炎癥反應(yīng)等幾乎一切生命活動(dòng)[2-3]，并且與腫瘤[4]、心血管等[5]疾病的發(fā)生密切相關(guān)。在泛素化修飾過程中，泛素連接酶對(duì)底物的識(shí)別是決定泛素化修飾特異性的關(guān)鍵[6]。泛素連接酶E3成分N-識(shí)別蛋白1（ubiquitin protein ligase E3 component N-recognin 1，Ubr1）已被證明是N端規(guī)則信號(hào)通路最重要的E3連接酶，能識(shí)別含不穩(wěn)定氨基酸末端的蛋白質(zhì)[7]，結(jié)構(gòu)上存在3個(gè)底物結(jié)合位點(diǎn)，分別能特異性結(jié)合蛋白質(zhì)的堿性N端殘基，大的疏水性N端殘基，以及分子內(nèi)包含Ubr1結(jié)合結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄抑制因子CUP9[8]。在啤酒酵母中，Ubr1通過泛素化降解轉(zhuǎn)錄抑制因子CUP9，從而調(diào)控寡肽/二肽轉(zhuǎn)移蛋白2（peptide transporter 2,PTR2）的表達(dá)，促進(jìn)酵母對(duì)寡肽和二肽的吸收[8]。Ubr1在人體組織和細(xì)胞中也有表達(dá)，且與人腫瘤蛋白p53誘導(dǎo)蛋白3（TP53I3）的泛素化降解有關(guān)[9]。此外，有研究表明，Ubr1作為N端規(guī)則信號(hào)通路上的泛素連接酶，能夠識(shí)別細(xì)胞質(zhì)內(nèi)錯(cuò)誤折疊的蛋白并使之通過泛素-蛋白酶體途徑降解[10]。然而，目前研究確定的Ubr1泛素化底物數(shù)量有限，絕大多數(shù)Ubr1的底物尚未被發(fā)現(xiàn)，缺乏系統(tǒng)性的底物篩選研究。

鑒定E3連接酶的底物不僅可以使筆者了解E3連接酶參與到的生物學(xué)過程，而且有助于筆者深入研究該E3連接酶催化底物泛素化的分子機(jī)制。傳統(tǒng)的研究E3連接酶底物的方法通常是利用酵母雙雜交等技術(shù)篩選相互作用的蛋白質(zhì)[11]，再通過體外泛素化反應(yīng)和體內(nèi)泛素化反應(yīng)的方法確定與該E3連接酶相互作用的蛋白質(zhì)是否是其底物。但該技術(shù)通量低，效率不高[12]。因此，篩選鑒定泛素化底物是當(dāng)前泛素化研究的主要難點(diǎn)。蛋白質(zhì)組學(xué)是后基因組時(shí)代主要的研究方法之一，能夠在蛋白質(zhì)水平上直接、大規(guī)模研究基因功能。YUMIMOTO等[13]采用差異蛋白質(zhì)組質(zhì)譜鑒定方法對(duì)F-box族的泛素連接酶進(jìn)行底物篩選，鑒定到515個(gè)與3個(gè)E3連接酶相互作用的蛋白。因此，差異蛋白質(zhì)組質(zhì)譜鑒定法是分析泛素連接酶底物的有力工具[13]。

酵母作為模式生物，不僅具有原核生物操作簡(jiǎn)單、生長(zhǎng)快速的特點(diǎn)，并且還具有真核細(xì)胞翻譯后修飾功能的優(yōu)勢(shì)[14]。因此，本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)Ubr1野生型RJD347及Ubr1缺失型AVY26的比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究，分析啤酒酵母中可能存在的Ubr1直接或間接作用的底物蛋白。

1 材料與方法

1.1 菌株及主要試劑

1.1.1 菌株Escherichia coliDH5α（由本實(shí)驗(yàn)室提供），酵母菌株（MATaura 3-52）[8]、AVY26（MATaura 3-52Ubr1Δ，Hi3G）[8]、Ubr1 野生型（Saccharomyces cerevisiae SC295）、（MATα GAL4 GAL80 ura 3-52、Leu 2-3、112 reg1-501 gal1 pep 4-3）[7]及 Ubr1 缺失型[Saccharomyce scerevisiae SC295（Ubr1Δ）]（SC295 ubr deleted）[7]（由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存[7]）（見表1）。

1.1.2 主要材料和試劑表達(dá)載體pFLAGUBR1-SBX（由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存），鼠抗Flag單克隆抗體（美國(guó)Sigma公司）、辣根過氧化物酶HRP-兔抗鼠抗體（上海Beyotime Biotechnology公司）、內(nèi)切酶XhoⅠ和SalⅠ及T4連接酶（美國(guó)New England Biolabs公司），其他化學(xué)試劑如組氨酸、尿嘧啶、聚乙二醇PEG3350、醋酸鋰及單鏈鮭魚精子等均為國(guó)產(chǎn)分析純。實(shí)驗(yàn)所用菌株及載體信息見表1。

表1 引物設(shè)計(jì)

1.2 菌體蛋白樣品的準(zhǔn)備

挑取RJD347和AVY26分別接種至酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基（YPD培養(yǎng)基）中，30℃培養(yǎng)至菌體OD600約為0.75，離心收集菌體，用酵母裂解緩沖液（SDT緩沖液）重懸菌體，經(jīng)Fast Prep-24高速均質(zhì)器（美國(guó)MP Biomedicals公司）裂解60s，13000 r/min離心，上清液經(jīng)蛋白樣品酶解（filter-aidedsample preparation，F(xiàn)ASP）用于質(zhì)譜分析。

1.3 質(zhì)譜分析

Q Exactive HF質(zhì)譜儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）與液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）系統(tǒng)聯(lián)用，對(duì)肽段樣品進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 質(zhì)粒構(gòu)建及酵母轉(zhuǎn)化

1.4.1 質(zhì)粒構(gòu)建以提取的酵母基因組DNA為模板，聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增 5 個(gè)差異蛋白（MLC2、SCD6、ARG1、HOG1 和RTF1）基因，PCR所用引物設(shè)計(jì)見表1。XhoⅠ和SalⅠ雙酶切擴(kuò)增片段及pFLAG-UBR1-SBX載體片段，膠回收酶切產(chǎn)物，酶連過夜后轉(zhuǎn)化至Escherichia coli DH5α，涂布于含氨芐的LB培養(yǎng)板，37℃過夜培養(yǎng)，篩選陽(yáng)性單克隆菌落，提取質(zhì)粒，雙酶切鑒定后取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒送鉑尚生物公司測(cè)序。

1.4.2 酵母轉(zhuǎn)化取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SC295和SC295（Ubr1Δ）菌液離心，去上清液，磷酸鹽緩沖液PBS沖洗2次，實(shí)驗(yàn)組取1 μg質(zhì)粒（加無菌水至34 μl）、對(duì)照組（無菌水 34 μl）分別加入適量 PEG3301、醋酸鋰、鮭魚單鏈精子后轉(zhuǎn)化至SC295和SC295（Ubr1Δ）的沉淀中，42℃溫浴40min，加入1ml YPD，30℃搖床培養(yǎng)2～3 h，涂布于SD-L培養(yǎng)板，30℃培養(yǎng)2～3d，挑取單克隆菌液進(jìn)行PCR驗(yàn)證。

1.5 Western blot檢測(cè)

挑取陽(yáng)性單克隆菌落，經(jīng)10%的聚丙烯酰胺凝膠分離后，電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯PVDF膜上，以5%脫脂牛奶室溫?fù)u床封閉1h，加入鼠抗Flag單克隆抗體，室溫?fù)u床孵育2h，加入HRP標(biāo)記的兔抗鼠IgG，室溫?fù)u床孵育1 h，ECL發(fā)光成像。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用DAVID在線對(duì)酵母細(xì)胞胞內(nèi)差異蛋白進(jìn)行功能注釋聚類分析；應(yīng)用R語言“heatmap”包繪制蛋白差異表達(dá)聚類圖。

2 結(jié)果

2.1 RJD347與AVY26胞內(nèi)蛋白組學(xué)差異分析

RJD347、AVY26胞內(nèi)總蛋白質(zhì)譜分析共檢測(cè)到2 388種蛋白，其中有249種蛋白在RJD347（Ubr1野生型）和AVY26（Ubr1缺失型）中不同（見圖1），該蛋白中，145個(gè)蛋白在AVY26中表達(dá)上調(diào)。由于Ubr1已被證明是N端規(guī)則信號(hào)通路最重要的E3連接酶，因此在AVY26中，Ubr1泛素化底物的含量上升。由此可見，質(zhì)譜結(jié)果檢測(cè)到的145個(gè)上調(diào)蛋白可能是UBR1潛在的泛素化底物。

此外，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AVY26中有104個(gè)蛋白表達(dá)呈下調(diào)趨勢(shì)（見圖1），質(zhì)譜結(jié)果也顯示，PTR2蛋白在AVY26中含量較野生型減少（見表2）。筆者篩選RJD347與AVY26蛋白表達(dá)差異倍數(shù)較大的40種蛋白進(jìn)行進(jìn)一步分析（見表2），表3分別列出AVY26/RJD347（A/R）胞內(nèi)蛋白差異倍數(shù)Ratio等相關(guān)信息。其中Ratio（A/R）＞1表示該蛋白在突變菌株中升高，Ratio（A/R）＜1為蛋白在突變菌株中降低。表3中列舉在AVY26胞內(nèi)蛋白含量上升的20種蛋白，該上調(diào)的蛋白可能是E3連接酶Ubr1潛在的泛素化底物。進(jìn)一步通過數(shù)據(jù)庫(kù)查找及文獻(xiàn)比對(duì)，發(fā)現(xiàn)差異倍數(shù)較大的蛋白如 MLC2、SCD6及ARG家族（ARG1、3、4、5、6 和 7）、HOG1、GDH1、RTF1、AKR1、HXT4 及 SMC3目前還未有研究報(bào)道與Ubr1泛素化調(diào)節(jié)相關(guān)。見表2和圖2。

圖1 RJD347與AVY26胞內(nèi)蛋白表達(dá)差異聚類圖

2.2 外源驗(yàn)證差異蛋白與Ubr1的相關(guān)性

SC295菌株因缺失pep4-3基因編碼翻譯后調(diào)控酵母液泡水解酶，這有利于蛋白外源表達(dá)及穩(wěn)定性的檢測(cè)。為進(jìn)一步驗(yàn)證上述差異蛋白與Ubr1之間的相關(guān)性，筆者篩選差異最大的5種差異蛋白進(jìn)行外源驗(yàn)證，在總蛋白趨于一致的情況下（見圖2），MLC2、SCD6、ARG1、HOG1 在 SC295 中未檢測(cè)到蛋白表達(dá)，而在SC295（Ubr1Δ）中檢測(cè)到蛋白高表達(dá)（見圖2A～D）。RTF1雖然在SC295能夠被檢測(cè)，但在SC295（Ubr1Δ）中蛋白水平明顯高于野生菌（見圖2E）。由此看出，在SC295中，Ubr1的潛在作用底物 MLC2、SCD6、ARG1、HOG1 及 RTF1 由于受Ubr1的調(diào)控，可能被泛素化降解，因而無法檢測(cè)到蛋白的表達(dá)或檢測(cè)到低表達(dá)；而在SC295（Ubr1Δ）中，則呈現(xiàn)相反的結(jié)果（見圖3）。因此，可以初步確定MLC2、SCD6、ARG1、HOG1 及 RTF1 蛋白與泛素連接酶Ubr1相關(guān)，并可能是泛素化Ubr1的直接作用底物。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果也與質(zhì)譜組學(xué)分析相符。

表2 RJD347與AVY26中差異最大的前40種胞內(nèi)蛋白

圖2 Ubr1泛素化底物篩選差異倍數(shù)

圖3 差異蛋白轉(zhuǎn)化至野生型和突變型Ubr1中的蛋白表達(dá)

3 討論

目前研究發(fā)現(xiàn)，Ubr1在酵母系統(tǒng)中存在221個(gè)相互作用蛋白，而在人體中則證實(shí)只存在84個(gè)相互作用蛋白。本研究通過比對(duì)RJD347與AVY26胞內(nèi)蛋白質(zhì)組的差異，發(fā)現(xiàn)共249個(gè)蛋白有差異表達(dá)，其中145個(gè)蛋白在AVY26中含量增加，104個(gè)蛋白含量降低。由于Ubr1作為泛素E3連接酶，可直接調(diào)控底物蛋白的泛素化降解，因此145個(gè)在AVY26中含量增加的蛋白為泛素連接酶Ubr1的潛在泛素化底物。進(jìn)一步通過外源驗(yàn)證蛋白MLC2、SCD6、ARG1、HOG1及RTF1在SC295（Ubr1Δ）中表達(dá)提高。

泛素連接酶Ubr1的潛在泛素化底物在酵母生理代謝過程中起重要的作用，SCD6是翻譯起始抑制子，在DNA復(fù)制應(yīng)激時(shí)形成胞間集合體，通過其RGG結(jié)構(gòu)域結(jié)合eIF4G抑制前起始復(fù)合物的募集[15]。值得注意的是，一些Ubr1潛在的泛素化底物蛋白在人體中也存在其相應(yīng)的同源蛋白，且與人體多種疾病相關(guān)并參與有機(jī)體重要的活動(dòng)調(diào)控。酵母源MLC2（myolp Light Chain）可調(diào)控酵母細(xì)胞Ⅱ型肌球蛋白Myolp輕鏈，參與Myolp重鏈輕鏈環(huán)肽解體[16]，對(duì)應(yīng)人源肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈激酶MLC2（Myosin light chain 2）在人體中具有催化肌球蛋白的磷酸化，控制平滑肌的收縮活動(dòng)的作用，MLC2的表達(dá)失調(diào)可導(dǎo)致原發(fā)性心肌癥的發(fā)生[17]。此外，精氨酸酶（Arginase）家族中的 ARG1、3、4、5、6 及 7 檢測(cè)到在 Ubr1Δ 缺失型中高表達(dá)（見表3），說明ARG家族蛋白為Ubr1的潛在直接底物。酵母Ubr1泛素化底物的篩選研究有助于筆者深入了解Ubr1參與生物學(xué)過程，同時(shí)還可以為人體內(nèi)Ubr1介導(dǎo)的N端規(guī)則及對(duì)應(yīng)的泛素化底物篩選提供線索，為研究上述相關(guān)疾病發(fā)病機(jī)制及人類生命活動(dòng)提供新思路。

本研究采用差異蛋白質(zhì)組學(xué)的方法篩選Ubr1泛素化底物的方法，不僅不受蛋白表達(dá)純化的影響，覆蓋率廣，可直接檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)生理狀態(tài)下的Ubr1作用底物，提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，為篩選鑒定E3連接酶Ubr1作用底物提供大量候選蛋白，為研究Ubr1催化底物泛素化的機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，對(duì)研究該潛在底物的同源蛋白是否受泛素化調(diào)節(jié)生命活動(dòng)及相關(guān)疾病具有重要意義。

[1]ETZIONI A,CIECHANOVER A,PIKARSKY E.Immune defects caused by mutations in the ubiquitin system[J].J Allergy Clin-Immunol,2017,139(3):743-753.

[2]MOYNAGH P N.The roles of Pellino E3 ubiquitin ligases in immunity[J].Na Rev Immunol,2014,14(2):122-131.

[3]VARSHAVSKY A.Discovery of the biology of the ubiquitin system[J].JAMA,2014,311(19):1969-1970.

[4]POTU H,PETERSON LF,KANDARPA M,et al.Usp9x regulates Ets-1 ubiquitination and stability to control NRAS expression and tumorigenicity in melanoma[J].Nat Commun,2017(8):14449.

[5]YANG N,YU F,SHAO G,et al.The E3 ubiquitin ligase c-Cbl mediates integrin β1ubiquitination during dilated cardiomyopathy[J].BiochemBiophys Res Commun,2016,479(4):728-735.

[6]NGUYEN H C,WANG W,XIONG Y.Cullin-RING E3 ubiquitin ligases:bridges to destruction[J].Subcell Biochem,2017(83):323-347.

[7]XIA Z,WEBSTER A,DU F,et al.Substrate-binding sites of UBR1,the ubiquitin ligase of the N-end rule pathway[J].J Biol Chem,2008,283(35):24011-24028.

[8]XIA Z,TURNER G C,HWANG C S,et al.Amino acids induce peptide uptake via accelerated degradation of CUP9,the transcriptional repressor of the PTR2 peptide transporter[J].J Biol Chem,2014,283(43):28958-28968.

[9]STANCOVSKI I,GONEN H,ORIAN A,et al.Degradation of the proto-oncogene product c-Fos by the ubiquitin proteolytic system in vivo and in vitro:identification and characterization of the conjugating enzymes[J].Mol Cell Biol,1995,15(12):7106-7116.

[10]EISELE F,WOLF D H.Degradation of misfolded protein in the cytoplasm is mediated by the ubiquitin ligase Ubr1[J].Febs Letters,2008,582(30):4143-4146.

[11]劉禹辰,賀福初,王建.大規(guī)模酵母雙雜交技術(shù)的發(fā)展及其在蛋白質(zhì)相互作用組學(xué)中的應(yīng)用[J].生命科學(xué),2014,26(4):421-429.

[12]郭正光.兩種高效研究泛素連接酶底物的新策略[D].北京:北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院,2012.

[13]YUMIMOTO K,MATSUMOTO M,OYAMADA K,et al.Comprehensive identification of substrates for F-box proteins by differential proteomics analysis[J].J Proteome Res,2012,11(6):3175-3185.

[14]田小梅,任建洪,房聰.不同碳源下畢赤酵母GS115蛋白組學(xué)分析[J].中國(guó)生物工程雜志,2012,32(1):21-29.

[15]RAJYAGURU P,SHE M,PARKER R.Scd6 targets eIF4G to repress translation: RGG motif proteins as a class of eIF4G-binding proteins[J].Mol Cell,2012,45(2):244-254.

[16]LUO J,VALLEN E A,DRAVIS C,et al.Identification and functional analysis of the essential and regulatory light chains of the only typeⅡmyosin myo1p in Saccharomyces cerevisiae[J].J Cell Biol,2004,165(6):843-855.

[17]LU K H,CHEN P N,HSIEH Y H,et al.3-Hydroxyflavone inhibits human osteosarcoma U2OS and 143B cells metastasis by affecting EMT and repressing u-PA/MMP-2 via FAK-Src to MEK/ERK and RhoA/MLC2 pathways and reduces 143B tumor growth in vivo[J].Food Chem Toxicol,2016(97):177-186.

Comparative proteomic analysis ofUbr1wild type and deletion type ofSaccharomyces cerevisiae*

Jian Peng1,Yao-ting Zhang1,Hui Li2,Xiao-long Xiao2,Chao-ying Wei2,Yu-zheng Zhou2,Ai Lu2,Li-ming Zhang2,Mei Zhou2,Jie Chen1,Cheng-ming Ding1,Zan-xian Xia2
(1.Xiangya Hospital,Central South University,Changsha,Hunan 410008,China;2.School of Life Sciences,Central South University,Changsha,Hunan 410013,China)

Q591.2

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.21.004

1005-8982（2017）21-0018-07

2017-04-11

國(guó)家自然科學(xué)基金聯(lián)合項(xiàng)目（No：U1603126）；湖南省自然科學(xué)基金（No：2017JJ2334）

夏贊賢，E-mail：xiazanxian@sklmg.edu.cn