王芳，周祥群，付潔

（1.海南省第三人民醫(yī)院 心血管內(nèi)科，海南 三亞 572000；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室，河南 新鄉(xiāng) 453003）

降鈣素基因相關(guān)肽對脂多糖誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞TLR4/NK-κB及炎癥因子表達(dá)的影響*

王芳1，周祥群1，付潔2

（1.海南省第三人民醫(yī)院 心血管內(nèi)科，海南 三亞 572000；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室，河南 新鄉(xiāng) 453003）

目的探討降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）對脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）TLR4/NK-κB及炎癥因子表達(dá)的影響。方法貼壁法培養(yǎng)VSMCs，根據(jù)不同的處理方案，分為對照組、LPS處理組、CGRP組、（LPS+CGRP）組及（LPS+CGRP+C8-37）組；ELISA 檢測不同組 VSMCs中白介素 1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）和CGRP基因表達(dá)水平，免疫印跡法（Western blot）檢測不同組VSMCs中Toll樣受體4（TLR4）、IκBa及p65蛋白表達(dá)水平。結(jié)果①LPS處理VSMCs后，隨著LPS濃度的升高，IL-1β和TNF-α表達(dá)水平成梯度增加，并于1 000 ng/ml時(shí)分泌水平最高（P＜0.05），在8 h時(shí)達(dá)到峰值（P＜0.05）；②CGRP劑量依賴性降低LPS誘導(dǎo)IL-1β和TNF-α的表達(dá)（P＜0.05），并于100 nmol/L時(shí)達(dá)到低峰點(diǎn)（P＜0.05）；③CGRP能抑制LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞TLR4蛋白的積累（P＜0.05），抑制IκBa與p65蛋白的磷酸化水平（P＜0.05）；④CGRP阻斷劑C8-37可以逆轉(zhuǎn)CGRP對LPS刺激的VSMCs中IL-1β和TNF-α表達(dá)（P＜0.05），拮抗CGRP對TLR4和NK-κB的抑制（P＜0.05）。結(jié)論CGRP通過抑制TLR4蛋白的積累，阻斷NF-κB信號蛋白IκBa與p65的磷酸化，進(jìn)而削弱LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥因子IL-1β和TNF-α的激活，抑制LPS誘導(dǎo)的VSMCs炎癥的激活。

降鈣素基因相關(guān)肽；血管平滑肌細(xì)胞；Toll樣受體4；NF-κB

Abstract:ObjectiveTo investigate the effectofcalcitonin gene-related peptide (CGRP)on lipopolysaccharide(LPS)-induced expressions of Toll-like receptor 4(TRL4)/NK-κB and cytokines in vascular smooth muscle cells (VSMCs).MethodsVSMCs were cultured and divided randomly into five groups:blank control group,LPS-insulted group,CGRP-stimulated group,LPS+CGRP stimulated group and LPS+CGRP+C8-37 group.Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)was used to measure concentrations of IL-1β and TNF-α.Western blot was used to detect the expression of TLR4,IκBa and p65.ResultsLPS upregulated the expressions of IL-1β and TNF-α in a both time-and dose-dependent manner (P＜0.05),which reached the peak value when the cells were insulted by LPS at 1,000 ng/ml for 8 hours.CGRP reduced the LPS-induced expressions of IL-1β and TNF-α in a dose-dependent manner,which reached the lowest values when CGRPwas under 100 nmol/L (P＜0.05).Moreover,LPS-treated cells exhibited significant decrease of TLR4 and phosphorylation of IκBa and p65,which was attenuated significantly by CGRP(P＜ 0.05).As a specific CGRP antagonist,C8-37 reversed the expression levels of IL-1β and TNF-α in VSMCs stimulated by LPS.ConclusionsThe present study demonstrates that CGRP can significantly block LPS-induced inflammatory response in VSMCs through inhibition of TLR4-mediated NF-κB signaling pathway.

Keywords: calcitonin gene-related peptide;vascular smooth muscle cell;Toll-like receptor 4;NK-κB

動(dòng)脈粥樣硬化是由多種因素共同作用的一種慢性炎癥性血管疾病，在其發(fā)展過程中，血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cell，VSMCs）發(fā)生特異性形態(tài)與功能改變，細(xì)胞收縮和合成表型發(fā)生轉(zhuǎn)換，進(jìn)而激活炎癥過程，促使VSMCs分泌多種促炎癥介質(zhì)（如細(xì)胞因子、趨化因子及黏附分子），最終促進(jìn)血管病理生理發(fā)展、疾病進(jìn)展，導(dǎo)致不良臨床事件發(fā)生[1]。當(dāng)前研究顯示，慢性炎癥是動(dòng)脈粥樣硬化心血管疾病的主要致病機(jī)制[2]，因此，識(shí)別調(diào)節(jié)VSMCs的炎癥反應(yīng)機(jī)制對于治療動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病的具有重要意義。降鈣素基因相關(guān)肽（calcitonin generelated peptide，CGRP）是由37個(gè)氨基酸組成的重要生物活性多肽，具有下降血壓、降低外周阻力、舒張腎動(dòng)脈及增加腎血流量等作用，參與機(jī)體多種生理和病理過程[3]。最近的研究證實(shí)，CGRP在免疫應(yīng)答和抗炎癥方面具有重要調(diào)節(jié)作用[4-5]，但對CGRP是否調(diào)節(jié)VSMCs炎癥激活及相關(guān)機(jī)制尚未明確。本實(shí)驗(yàn)通過脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的 VSMCs炎癥反應(yīng)，探討CGRP對LPS誘導(dǎo)的VSMCs TLR4/NK-κB表達(dá)及其炎癥的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑

無特殊病原體（SPF）級雄性SD大鼠[許可證號：SCXK（京）2012-0001，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司]，9～11周齡，體重300～350 g。不含鈣鎂磷酸鹽緩沖液（D-PBS）、DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液及L-谷氨酰胺（購自美國Hyclone公司），α-Sarcomeric actin（α-SM-actin）、Anti-TLR4、Anti-IκBa、Anti-p-IκBa、Anti-p-p65、Anti-p65 及 Anti-α-Tubulin（購自美國Abcam公司），辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗（HRP）（購自美國 Cell Signaling Technology公司），DMEM、胎牛血清及Trypsin-EDTA胰酶消化液（購自美國Gibco公司）；BCA蛋白定量檢測試劑盒（購自陜西省西安飛揚(yáng)生物科技有限公司），RIPA裂解液（中）（購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司），Calcitonin Gene Related Peptide（購自美國 Abbiotec公司）、Calcitonin Gene Related Peptide Fragment 8-37（購自美國Sigma-Aldrich公司），白介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子 α（tumor necrosis factor α，TNF-α） 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbentassay，ELISA） 定量檢測試劑盒（購自美國R&D公司）；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

酶聯(lián)免疫檢測儀、Power PacTM電泳儀、Transblot電轉(zhuǎn)儀及凝膠成像系統(tǒng)Chemi Doc XRS（購自美國BIO-RAD公司），倒置熒光顯微鏡（日本奧林巴斯公司）。

1.3 方法

1.3.1 VSMCs培養(yǎng)與鑒定雄性SD大鼠，頸椎脫臼處死，75%酒精浸泡消毒5 min，用彎鑷剝離主動(dòng)脈，去除主動(dòng)脈外膜，用剪刀剪碎為1 mm3大小組織塊，用PBS沖洗2次以去除血細(xì)胞，然后將其均勻置于培養(yǎng)皿瓶底，加入10%FBS的DMEM完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)5 d，至皿底鋪滿后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.3.2 VSMCs分組培養(yǎng)與處理第3代的VSMCs在37℃、50 ml/L二氧化碳CO2條件下，置于含10%FBS的DMEM完全培養(yǎng)基中貼壁培養(yǎng)，隔天換液。當(dāng)細(xì)胞長至培養(yǎng)皿80%時(shí)，用含0.05%胰酶-EDTA溶液進(jìn)行細(xì)胞消化傳代，接種于培養(yǎng)板上，接種細(xì)胞密度 2×104～4×106個(gè) /ml，培養(yǎng) 24 h后，進(jìn)行分組實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為4組：①對照組（control）：不作任何處理；②LPS處理組：使用1 000 ng/ml LPS處理心肌細(xì)胞8 h；③CGRP組：給予100 nmol/L CGRP處理8 h；④LPS+CGRP組：給予1 000 ng/ml LPS和100 nmol/L CGRP處理8 h；⑤LPS+CGRP+C8-37組；給予100 nmol/L CGRP和1 μmol/L的CGRP受體拮抗劑C8-37同時(shí)處理8 h。

1.3.3 細(xì)胞免疫熒光鑒定VSMCs細(xì)胞表型將滅菌的細(xì)胞爬片放入24孔培養(yǎng)板中，然后以2×104～5×104個(gè)/ml細(xì)胞密度將VSMCs接種至爬片上，培養(yǎng)48h后用PBS洗滌細(xì)胞，之后加入4%多聚甲醛固定10min，用PBS漂洗3次，1%Trixon-100通透細(xì)胞10 min，PBS漂洗3次，5%BSA室溫封閉30 min，加入一抗（α-SM-actin），放置4℃孵育過夜。PBS洗滌3次，加入二抗Cy3，37℃孵育1 h。PBS洗滌3次，DAPI（1∶1 000）孵育10 min，PBS洗滌3次，封片劑封片，熒光顯微鏡觀察。

1.3.4 炎癥因子的ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%FBS的DMEM/培養(yǎng)基中，按照3×106個(gè)/ml的細(xì)胞密度種植于96孔板內(nèi)，培養(yǎng)24 h后，進(jìn)行分組細(xì)胞刺激處理。細(xì)胞處理結(jié)束后，收集培養(yǎng)基上清進(jìn)行ELISA檢測。按照IL-1β和TNF-α檢測試劑盒的操作步驟進(jìn)行ELISA檢測。使用酶標(biāo)儀于450 nm處測各孔OD值，每個(gè)樣本重復(fù)3個(gè)復(fù)孔。然后繪制標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線，按曲線方程計(jì)算各樣本濃度值。最后取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.3.5 免疫印跡法（Western blot）檢測提取細(xì)胞總蛋白，測定蛋白含量。以50 μg/每孔道的蛋白上樣量進(jìn)行SDS-PACE電泳，然后半干轉(zhuǎn)將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，于50 g/L的脫脂奶粉TBST溶液中室溫封閉120 min，然后分別加入1∶1 000兔抗TLR4、IκBa、p-IκBa、p-p65、p65 及 α-Tubulin，4℃振搖孵育過夜。TBST洗膜10 min×3次，加入HRP二抗（1∶5 000）室溫振搖孵育120 min，洗膜。然后加入ECL試劑發(fā)光，采用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析靶蛋白的相對表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 VSMCs的鑒定

原代VSMCs接種48 h后，在顯微鏡下呈梭形或不規(guī)則扁平狀細(xì)胞。α-SM-actin免疫熒光染色結(jié)果顯示95%以上細(xì)胞均為α-SM-actin蛋白（紅色）。見圖1。

圖1 免疫熒光檢測VSMCs標(biāo)志物α-SM-actin（標(biāo)尺=50μm）

2.2 LPS誘導(dǎo)下炎癥因子IL-1β和TNF-α表達(dá)變化

經(jīng) 0、10、100 及 1 000 ng/ml LPS 誘導(dǎo) VSMCs細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，各組IL-1β和TNF-α表達(dá)比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見表1）；隨著LPS濃度的增加，IL-1β和TNF-α表達(dá)成梯度上升，并于1 000 ng/ml時(shí)分泌水平最高（P＜0.05）。使用1 000 ng/ml濃度的LPS在不同時(shí)間處理VSMCs，觀察IL-1β和TNF-α表達(dá)水平隨作用時(shí)間的變化，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見表2）。LPS在作用4 h后，IL-1β和TNF-α表達(dá)逐漸增加，在8 h時(shí)達(dá)到峰值，隨后逐漸降低（P＜0.05）。

表1 不同LPS濃度誘導(dǎo)下炎癥因子IL-1β和TNF-α表達(dá)水平的比較 （pg/ml，±s）

表1 不同LPS濃度誘導(dǎo)下炎癥因子IL-1β和TNF-α表達(dá)水平的比較 （pg/ml，±s）

因子 0 ng/ml 10 ng/ml 100 ng/ml 1 000 ng/ml F值 P值IL-1β 35.000±2.887 49.236±2.309 64.667±4.372 97.667±7.623 31.930 0.000 TNF-α 221.333±25.075 389.667±11.141 484.667±10.990 646.667±34.954 60.434 0.000

表2 不同作用時(shí)間LPS濃度誘導(dǎo)下炎癥因子IL-1β和TNF-α表達(dá)變化 （pg/ml，±s）

表2 不同作用時(shí)間LPS濃度誘導(dǎo)下炎癥因子IL-1β和TNF-α表達(dá)變化 （pg/ml，±s）

LPS作用時(shí)間 IL-1β TNF-α 0 h 32.667±2.901 242.667±4.485 2 h 42.333±2.028 316.333±10.990 4 h 64.334±8.021 457.334±12.991 8 h 99.667±8.762 642.000±20.133 12 h 72.667±4.726 570.000±24.333 24 h 62.000±2728 547.000±14.640 F值 27.719 95.291 P值 0.000 0.000

2.3 外源CGRP劑量依賴性降低LPS誘導(dǎo)IL-1β和TNF-α的表達(dá)

與 0 ng/ml組比較，1 000 ng/ml LPS能增加VSMCs釋放炎癥因子IL-1β和TNF-α，但同時(shí)給予0、0.1、10、100 及 1 000 nmol/L 的 CGRP 預(yù)處理后，各組IL-1β和TNF-α表達(dá)比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；隨著CGRP濃度的上升，LPS誘導(dǎo)IL-1β和TNF-α呈濃度依賴性降低，并于100 nmol/L時(shí)達(dá)到低峰點(diǎn)（P＜0.05）。見表3。

表3 CGRP劑量依賴性降低LPS誘導(dǎo)IL-1β和TNF-α的表達(dá) （pg/ml，±s）

表3 CGRP劑量依賴性降低LPS誘導(dǎo)IL-1β和TNF-α的表達(dá) （pg/ml，±s）

因子 0 nmol/L 0.1 nmol/L 10 nmol/L 100 nmol/L 1 000 nmol/L F值 P值IL-1β 97.667±7.623 96.667±7.535 78.000±1.528 65.124±2.309 79.667±2.646 11.379 0.001 TNF-α 642.032±20.133 622.315±19.053 542.101±11.790 371.667±17.786 515.534±18.818 49.179 0.000

2.4 CGRP拮抗劑對 VSMCs分泌 IL-1β 和TNF-α的影響

給予CGRP拮抗劑后，各組IL-1β和TNF-α表達(dá)比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（IL-1β：F=39.339，P=0.000；TNF-α：F=87.166，P=0.000）；與對照組比較，1 000 ng/ml LPS引起VSMCs IL-1β和TNF-α的增加（P＜0.05），而單獨(dú)給予CGRP預(yù)處理后，并未改變IL-1β和TNF-α的表達(dá)（P＞0.05）；但是在LPS基礎(chǔ)上同時(shí)給予CGRP預(yù)處理后，卻能抑制LPS引起的細(xì)胞內(nèi)IL-1β和TNF-α表達(dá)的增加（P＜0.05）；而與 LPS+CGRP組比較，添加 CGRP的抑制劑C8-37能拮抗CGRP的該作用（P＜0.05）。見圖2。

圖2 CGRP抑制LPS誘導(dǎo)VSMCs內(nèi)IL-1β和TNF-α的表達(dá)

2.5 CGRP對VSMCs分泌TLR4的影響

Western blot檢測比較各組TLR4的表達(dá)差異，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=170.026，P=0.000）。與對照組比較，LPS增加VSMCs TLR4的積累（P＜0.05），單獨(dú)給予CGRP預(yù)處理，對TLR4蛋白表達(dá)未影響（P＞0.05）；但同時(shí)給予（LPS+GRP）預(yù)處理后，卻能抑制LPS引起的細(xì)胞內(nèi)TLR4蛋白表達(dá)的增加（P＜0.05）；而CGRP的抑制劑C8-37卻又能拮抗CGRP對TLR4的抑制作用（P＜0.05）。見圖3。

圖3 CGRP抑制LPS誘導(dǎo)的VSMCs內(nèi)TLR4的積累

2.6 CGRP抑制LPS誘導(dǎo)的VSMCs IκBa和 p65的磷酸化

Western blot檢測比較各組IκBa和p65的活化差異，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（IκBa：F=116.188，P=0.000；p65：F=88.403，P=0.000）。與對照組比較，LPS 激活 VSMCs IκBa and NF-κB p65 的磷酸化（P＜0.05），而單獨(dú)給予 CGRP 預(yù)處理，對 IκBa磷酸化無明顯作用（P＞0.05），但卻抑制p65的磷酸化水平（P＜0.05）；但同時(shí)給予（LPS+CGRP）預(yù)處理后，更進(jìn)一步抑制LPS促進(jìn)的細(xì)胞內(nèi)IκBa和p65蛋白磷酸化（P＜0.05）；而CGRP的抑制劑C8-37卻又能拮抗CGRP對 IκBa和p65的抑制作用（P＜0.05）。見圖4。

圖4 CGRP抑制LPS誘導(dǎo)的VSMCs內(nèi)IκBa和p65磷酸化

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化是一種慢性炎癥性血管疾病，它由多種因素共同誘導(dǎo)作用形成，在其發(fā)展過程中，VSMCs發(fā)生表型轉(zhuǎn)換，由收縮靜止型變?yōu)樵鲋尺w移型細(xì)胞，分泌細(xì)胞外基質(zhì)，激活炎癥信號，而且釋放炎癥細(xì)胞因子和趨化因子，進(jìn)而與浸潤炎癥細(xì)胞相互作用，最終促進(jìn)炎癥和病變[1，6]。

CGRP是一種廣泛分布于神經(jīng)和心血管系統(tǒng)的血管活性肽，其分布與血管緊密聯(lián)系，在血管中CGRP的含量高于心臟。生理?xiàng)l件下，CGRP與降鈣素受體樣受體/受體活性修飾蛋白1（receptor activity modifying protein 1，RAMP1）組成的復(fù)合受體結(jié)合才能發(fā)揮作用[7]。本研究顯示，CGRP涉及神經(jīng)類疾病，如三叉神經(jīng)和偏頭痛等[8]，并在心血管的自我穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)和血管結(jié)構(gòu)中具有關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用[9-10]。KROEGER等研究顯示，在肝臟中，CGRP還能通過減少促炎癥介質(zhì)富集而發(fā)揮抗炎癥作用[11]。但是CGRP對VSMCs炎癥的作用，卻尚不明確。

本研究首先通過LPS刺激建立VSMCs炎癥模型[12]，觀察CGRP對LPS誘導(dǎo)的VSMCs炎癥因子IL-1β和TNF-α表達(dá)表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，與對照組比較，隨著LPS濃度的增加，IL-1β和TNF-α表達(dá)成梯度上升，并于1 000 ng/ml LPS作用8 h時(shí)，炎癥因子IL-1β和TNF-α表達(dá)達(dá)到峰值（P＜0.05）。單獨(dú)給予CGRP預(yù)處理后，并未改變IL-1β和TNF-α的表達(dá)；但是在LPS基礎(chǔ)上同時(shí)給予CGRP預(yù)處理后，卻能抑制LPS引起的細(xì)胞內(nèi)IL-1β和TNF-α表達(dá)的增加（P＜0.05）；而CGRP的抑制劑C8-37能拮抗CGRP的該作用（P＜0.05），以上結(jié)果表明，CGRP能夠抑制LPS誘導(dǎo)的VSMCs炎癥因子IL-1β和TNF-α表達(dá)，從而抑制細(xì)胞炎癥反應(yīng)。

大量研究證實(shí)，LPS可以與TLR4受體相結(jié)合，激活NF-κB，引起炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子的表達(dá)，起到抗免疫調(diào)節(jié)的作用[13-15]。但CGRP是否能通過TLR4/NF-κB信號通路，抑制細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的釋放，抵抗LPS介導(dǎo)的VSMCs炎癥反應(yīng)呢？本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，CGRP通過阻斷LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)TLR4的積累，抑制NF-κB信號蛋白IκBa與p65蛋白激活，削弱細(xì)胞炎癥因子IL-1β和TNF-α的表達(dá)，從而抑制VSMCs的炎癥激活反應(yīng)。

本研究顯示，CGRP通過抑制TLR4積累和NF-κB信號蛋白IκBa與p65的活性，進(jìn)而削弱LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥因子IL-1β和TNF-α的上調(diào)，抑制LPS誘導(dǎo)的VSMCs炎癥的激活，發(fā)揮抗炎作用，這為以慢性炎癥為主要發(fā)病機(jī)制的動(dòng)脈粥樣硬化的防治提供新的靶點(diǎn)和治療策略。但本研究也存在一定局限性，對CGRP與TLR4和NK-κB上下游信號通路之間的關(guān)系，還不深入，仍需進(jìn)一步研究。

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Effect of CGRP on lipopolysaccharide-induced expressions of TLR4/NK-κB and inflammatory factors of vascular smooth muscle cells*

Fang Wang1,Xiang-qun Zhou1,Jie Fu2
(1.Department of Cardiology,the Third People's Hospital of Hainan Province,Sanya,Hainan 572000,China;2.Department of Histology and Embryology,Xinxiang Medical College,Xinxiang,Henan 453003,China)

R685.6

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.21.003

1005-8982（2017）21-0012-06

2017-02-28

海南省衛(wèi)生廳課題（No：1421320.24A1004）