侯鳳香 金俊杰 李培德 金大春 錢錦銘（溫州科技職業(yè)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院（溫州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院）325006）

不同養(yǎng)殖模式鴨腸道大腸桿菌耐藥性分析

侯鳳香 金俊杰 李培德 金大春 錢錦銘*（溫州科技職業(yè)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院（溫州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院）325006）

為對(duì)比不同養(yǎng)殖模式下，鴨大腸桿菌的耐藥性，本文針對(duì)傳統(tǒng)平養(yǎng)與網(wǎng)床圈養(yǎng)2種不同養(yǎng)殖模式下的臨床健康鴨群，分離鑒定出47株大腸桿菌，選用20種抗生素對(duì)其進(jìn)行耐藥性測(cè)定分析。結(jié)果顯示，傳統(tǒng)平養(yǎng)的鴨場(chǎng)其耐藥性、耐藥普均較網(wǎng)床圈養(yǎng)嚴(yán)重的多，在20種抗生素中，傳統(tǒng)平養(yǎng)對(duì)3種藥物敏感，網(wǎng)床圈養(yǎng)對(duì)7種藥物敏感；對(duì)其他藥物的耐藥率，除鏈霉素的耐藥率外，傳統(tǒng)平養(yǎng)的鴨場(chǎng)均高于網(wǎng)床圈養(yǎng)；多重耐藥方面，傳統(tǒng)平養(yǎng)的24株菌中有2株對(duì)所有20種受試抗菌藥物均敏感，網(wǎng)床圈養(yǎng)的23株菌中有6株對(duì)所有20種受試抗菌藥物均敏感，網(wǎng)床圈養(yǎng)有2R、4R、6R、8R；傳統(tǒng)平養(yǎng)的耐藥普較廣，2R-12R均存在，在兩種模式中，3R以上菌株網(wǎng)床圈養(yǎng)占34.78%，傳統(tǒng)平養(yǎng)的79.17%。結(jié)果表明：網(wǎng)床圈養(yǎng)養(yǎng)殖可以減緩耐藥性產(chǎn)生。

養(yǎng)殖模式；鴨；耐藥性

大腸埃希氏菌 (E.coli）通常被稱為大腸桿菌，是Escherich在1885年發(fā)現(xiàn)的，在相當(dāng)長(zhǎng)的一段時(shí)間內(nèi)，一直被當(dāng)作正常腸道菌群的組成部分，認(rèn)為是非致病菌。直到20世紀(jì)中葉，才認(rèn)識(shí)到大腸桿菌為條件下致病菌，非致病性大腸桿菌容易獲得致病性大腸桿菌的毒力因子而轉(zhuǎn)變?yōu)橹虏【?，引起?dòng)物和人的多種疾病[1]，尤其對(duì)嬰兒和幼畜 (禽），常引起嚴(yán)重腹瀉和敗血癥。20世紀(jì)50年代禽致病性大腸桿菌幾乎沒有耐藥性產(chǎn)生，而60年代的分離株對(duì)鏈霉素、四環(huán)素產(chǎn)生了耐藥性。

伴隨著畜牧業(yè)的規(guī)?；l(fā)展，在畜禽的養(yǎng)殖過程中，抗菌藥物被廣泛地用于疫病的治療與預(yù)防，導(dǎo)致細(xì)菌的耐藥性逐漸增強(qiáng)，特別是禽源性大腸桿菌，其耐藥菌株越來越多，多重耐藥菌株也在不斷增加，有的分離株對(duì)一些尚未推廣使用的新型抗生素也具有很強(qiáng)的耐藥性[2-3]，同時(shí)，也有文獻(xiàn)報(bào)道，細(xì)菌的耐藥性可以通過動(dòng)物源、食物源傳染給人類[4-5]，而使許多抗生素在治療人的細(xì)菌性疾病時(shí)無效，從而嚴(yán)重威脅人類的健康。

鴨大腸桿菌病是由大腸桿菌引起的一種急性敗血性傳染病，各年齡均可感染，以2～6周齡的小鴨為主。特征是發(fā)病急、死亡快。剖檢變化以敗血癥為主，肝臟腫大，呈膽汁狀的銅綠色或是青銅色；脾臟腫大，呈紫黑色斑紋狀；肺有淤血或水腫；卵巢出血；肝被膜、心包膜和氣囊壁表面等附有黃白色纖維素性滲出物；全身漿膜呈急性滲出性炎癥，對(duì)養(yǎng)鴨業(yè)的危害很大。本文通過對(duì)傳統(tǒng)平養(yǎng)與網(wǎng)床圈養(yǎng)兩種不同養(yǎng)殖模式，采集臨床健康鴨泄殖腔拭子，分離出大腸桿菌，選取20種抗生素，進(jìn)行耐藥性檢測(cè)，并進(jìn)行對(duì)比分析，以降低對(duì)養(yǎng)殖業(yè)的危害，減少菌株耐藥性的傳播，保障公共衛(wèi)生安全，為制定有效的用藥方案及控制大腸桿菌耐藥性發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株

47株菌株分別采集自溫州3家傳統(tǒng)平養(yǎng)與3家網(wǎng)床圈養(yǎng)鴨場(chǎng)內(nèi)的臨床健康鴨群；大腸埃希菌質(zhì)控菌株ATCC25922購自溫州康泰生物科技有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

Kary-Blair運(yùn)送培養(yǎng)基購自青島海博生物技術(shù)有限公司；麥康凱、伊紅美藍(lán)、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、MH平皿培養(yǎng)基均購自溫州康泰生物科技有限公司。

1.1.3 細(xì)菌微量生化反應(yīng)管與藥敏紙片

腸桿菌科微量生化反應(yīng)管、鏈霉素 (S）、卡那霉素(K）、慶大霉素 (CN）、阿米卡星 (AK）、妥布霉素 (TOB）、大觀霉素 (SH）、復(fù)方新諾明 (SXT）、氨芐西林 (AMP）、頭孢唑林 (KZ）、頭孢曲松 (CRO）、頭孢噻肟 (CTX）、頭孢哌酮/舒巴坦 (SCF）、阿莫西林/棒酸 (AMC）、諾氟沙星(NOR）、氧氟沙星 (OFX）、環(huán)丙沙星 (CIP）、恩諾沙星(ENR）、四環(huán)素 (TE）、多西環(huán)素 (DO）、氟苯尼考 (FFC）藥敏紙片均購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株分離、鑒定

采集臨床健康鴨群泄殖腔拭子樣品，移入Kary-Blair運(yùn)送培養(yǎng)基內(nèi)，于12h內(nèi)劃線接種至麥康凱平皿培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)18h。挑取麥康凱平皿培養(yǎng)基上粉紅色單個(gè)菌落，劃線接種至伊紅美藍(lán)平皿培養(yǎng)基內(nèi)，37℃培養(yǎng)18h。挑取伊紅美藍(lán)平皿培養(yǎng)基上深紫色、帶金屬光澤單個(gè)菌落，劃線接種至營(yíng)養(yǎng)瓊脂平皿培養(yǎng)基內(nèi)，37℃培養(yǎng)18h[6]。將待檢菌接種至腸桿菌科微量生化反應(yīng)管中，37℃培養(yǎng)培養(yǎng)24～96h，觀察并記錄生化反應(yīng)結(jié)果，按說明書予以判定。

1.2.2 藥敏試驗(yàn)

按照臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì) (Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）推薦的K-B藥敏紙片法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，每次測(cè)定均以質(zhì)控菌株ATCC25922為參照。根據(jù)CLSI 2016標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果[7]。

2 結(jié)果與分析

對(duì)52份鴨泄殖腔拭子樣品進(jìn)行大腸桿菌分離培養(yǎng)，經(jīng)菌落形態(tài)觀察、氫氧化鉀拉絲試驗(yàn)、革蘭染色、生化鑒定得到47株大腸桿菌，分離率為90.4%。其中傳統(tǒng)平養(yǎng)鴨場(chǎng)26份樣品，分離鑒定得到24株大腸桿菌，網(wǎng)床圈養(yǎng)鴨場(chǎng)26份樣品，分離鑒定得到23株大腸桿菌。

2.1 藥物敏感性結(jié)果

傳統(tǒng)平養(yǎng)養(yǎng)鴨場(chǎng)分離到的24株大腸桿菌對(duì)阿米卡星、大觀霉素、頭孢哌酮/舒巴坦三種藥物敏感，耐藥率為0；對(duì)剩余的17種藥物均具有不同的耐藥率，對(duì)卡那霉素、鏈霉素、新諾明、氟苯尼考、多西環(huán)素、氨芐西林、阿莫西林/棒酸七種藥物具有較高的耐藥性 (41.67～79.17%）；對(duì)四環(huán)素對(duì)四環(huán)素的耐藥性最高，高達(dá)83.33%。相對(duì)比下，網(wǎng)床圈養(yǎng)養(yǎng)鴨場(chǎng)分離到的23株大腸桿菌對(duì)阿米卡星、大觀霉素、頭孢唑林、頭孢噻肟、頭孢哌酮/舒巴坦、氧氟沙星、環(huán)丙沙星七種藥物敏感，耐藥率為0；對(duì)剩余的13種藥物均具有不同的耐藥率，對(duì)其中的新諾明、多西環(huán)素、四環(huán)素、鏈霉素、氨芐西林具有較高的耐藥率72.73%，為最高；對(duì)新諾明、鏈霉素、氟苯尼考、氨芐西林、諾氟沙星、阿莫西林/棒酸、多西環(huán)素7種藥物具有較高的耐藥性 (43.24%～75.68%）。藥敏試驗(yàn)結(jié)果見附表。

2.2 多重耐藥性結(jié)果

在47株鴨腸道大腸桿菌分離株中，傳統(tǒng)平養(yǎng)的24株菌中有2株對(duì)所有20種受試抗菌藥物均敏感，網(wǎng)床圈養(yǎng)的23株菌中有6株對(duì)所有20種受試抗菌藥物均敏感；兩種養(yǎng)殖模式均是0株對(duì)1種抗菌藥物耐藥；網(wǎng)床圈養(yǎng)的6株對(duì)2種抗菌藥物耐藥 (2R），傳統(tǒng)平養(yǎng)的3株對(duì)2種抗菌藥物耐藥(2R）；網(wǎng)床圈養(yǎng)0株對(duì)3，5，7，9-20種抗菌藥物耐藥，傳統(tǒng)平養(yǎng)的22株均存在不同程度的多重耐藥，耐藥性最為嚴(yán)重的1株對(duì)12種抗菌藥物耐藥 (12R）；在分離菌株中，3R以上菌株網(wǎng)床圈養(yǎng)占34.78%，傳統(tǒng)平養(yǎng)的79.17%。多種耐藥結(jié)果見附圖。

3 討論

本研究顯示，傳統(tǒng)平養(yǎng)的鴨場(chǎng)其耐藥性、耐藥普均較網(wǎng)床圈養(yǎng)嚴(yán)重的多，在20種抗生素中，傳統(tǒng)平養(yǎng)對(duì)3種藥物敏感，網(wǎng)床圈養(yǎng)對(duì)7種藥物敏感；對(duì)其他藥物的耐藥率，網(wǎng)床圈養(yǎng)除鏈霉素的耐藥率高于傳統(tǒng)平養(yǎng)的鴨場(chǎng)外，其他耐藥率均低于傳統(tǒng)平養(yǎng)的鴨場(chǎng)；在多重耐藥方面，傳統(tǒng)平養(yǎng)的24株菌中有2株對(duì)所有20種受試抗菌藥物均敏感，網(wǎng)床圈養(yǎng)的23株菌中有6株對(duì)所有20種受試抗菌藥物均敏感，網(wǎng)床圈養(yǎng)有2R、4R、6R、8R；傳統(tǒng)平養(yǎng)的耐藥普較廣，2R-12R均存在，在兩種模式中，3R以上菌株網(wǎng)床圈養(yǎng)占34.78%，傳統(tǒng)平養(yǎng)的79.17%，由此可見，網(wǎng)床圈養(yǎng)養(yǎng)殖可以減緩耐藥性產(chǎn)生。

傳統(tǒng)的平養(yǎng)模式即設(shè)置水池或是提供水槽，供鴨洗浴嬉戲，糞污直接排泄于地面、水中，污染環(huán)境、水體、鴨體，增加鴨與各種病原體接觸的機(jī)率，導(dǎo)致發(fā)病。鴨大腸桿菌病的發(fā)生與鴨的飼養(yǎng)環(huán)境與飼養(yǎng)方式密切相關(guān)，帶菌的鴨在其活動(dòng)范圍內(nèi)也可通過排泄的糞便污染當(dāng)?shù)氐氖澄?、草?chǎng)、水源或其他水體及場(chǎng)所，造成交叉污染和感染，危害極大。網(wǎng)床圈養(yǎng)模式

鴨在網(wǎng)床上面自由活動(dòng)，網(wǎng)下糞便被直接收集，該模式提高了鴨養(yǎng)殖的衛(wèi)生水平，減少疫病的傳播，李花柚等[8]研究報(bào)道，蛋鴨生態(tài)網(wǎng)床圈養(yǎng)技術(shù)可以使蛋鴨大腸桿菌病發(fā)病率下降90%左右，獸藥使用亦下降90%，大大降低飼養(yǎng)成本。

大腸桿菌病的發(fā)病率和死亡率較高，每年給世界養(yǎng)禽業(yè)帶來嚴(yán)重?fù)p失。同時(shí)，禽類是人源腸外致病性大腸桿菌的一個(gè)傳播媒介，加強(qiáng)中國(guó)禽致病性大腸桿菌的防制和監(jiān)控，對(duì)養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展及公共衛(wèi)生安全具有重要意義[9]。伴隨著禽致病性大腸桿菌耐藥性的加劇，使禽大腸桿菌病上升為危害養(yǎng)禽業(yè)最棘手的疾病之一。減緩耐藥性的產(chǎn)生或是消除耐藥性已成為當(dāng)前重要課題，有研究表明，中草藥對(duì)大腸桿菌的防治具有很好的作用，不僅可以抑菌治病，還可以消除耐藥性，同時(shí)安全無毒副作用[10]。改變傳統(tǒng)養(yǎng)殖模式，走生態(tài)化養(yǎng)殖之路，也可以減緩耐藥性產(chǎn)生，對(duì)促進(jìn)畜牧業(yè)的轉(zhuǎn)型升級(jí)具有重要作用。本文為制定有效的用藥方案及控制大腸桿菌耐藥性問題提供參考及理論依據(jù)。

附表 兩種養(yǎng)殖模式鴨腸道大腸桿菌分離株藥敏試驗(yàn)結(jié)果

附圖 兩種養(yǎng)殖模式鴨腸道大腸桿菌對(duì)20種抗菌藥物的多重耐藥性分布

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溫州市公益性科技計(jì)劃項(xiàng)目 （N20140038）；溫州市2015年農(nóng)業(yè)豐收計(jì)劃項(xiàng)目。

侯鳳香 （1982-），女，山東省鄆城縣人，碩士，講師，主要從事動(dòng)物傳染病學(xué)研究工作。

*通訊作者：錢錦銘 （1961-），男，浙江省溫州市人，副教授，主要從事生態(tài)畜牧業(yè)研究工作。