張亮亮，徐曼，胡新宇，汪詠梅

(江蘇省生物質(zhì)能源與材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所，南京 210042)

EGCG-Cu絡(luò)合物與牛血清蛋白相互作用研究

張亮亮，徐曼，胡新宇，汪詠梅

(江蘇省生物質(zhì)能源與材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所，南京 210042)

表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)為茶葉中主要活性成分之一，具有抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤血管生成等多種生理活性功能。EGCG能夠與蛋白質(zhì)及金屬離子形成絡(luò)合物，從而影響其各種生理活性功能。筆者利用熒光猝滅法分別研究了EGCG及其Cu(Ⅱ)絡(luò)合物(EGCG-Cu)與牛血清白蛋白(BSA)的相互作用，并分析了Cu(Ⅱ)的存在對(duì)EGCG與BSA相互作用的影響。利用Stern-Volmer曲線分析了EGCG及其Cu(Ⅱ)絡(luò)合物分別與BSA絡(luò)合反應(yīng)中不同的熒光猝滅機(jī)理，采用Stern-Volmer方程及不同Stern-Volmer修正方程計(jì)算得到3種不同反應(yīng)體系中EGCG與BSA相互作用的結(jié)合常數(shù)。結(jié)果表明：隨EGCG和EGCG-Cu絡(luò)合物樣品濃度的增加，BSA出現(xiàn)典型的熒光猝滅現(xiàn)象，表明EGCG和EGCG-Cu絡(luò)合物均與BSA發(fā)生了相互作用。反應(yīng)溶液中Cu(Ⅱ)的存在會(huì)改變EGCG與BSA的相互作用形式，并降低EGCG與BSA相互作用的結(jié)合常數(shù)。此外，EGCG與Cu(Ⅱ)絡(luò)合后能夠提高EGCG與BSA之間的結(jié)合常數(shù)。研究結(jié)果可為深入分析EGCG在體內(nèi)的各種生理活性功能提供參考。

表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)；牛血清白蛋白(BSA)；熒光猝滅法；Stern-Volmer方程

血清白蛋白是血漿中含量最豐富的蛋白質(zhì)之一，分布于全身組織和體液中，占血液蛋白總量的60%以上。此類(lèi)蛋白能與許多藥物和生物活性小分子進(jìn)行可逆非共價(jià)結(jié)合，從而發(fā)揮其儲(chǔ)存、轉(zhuǎn)運(yùn)等重要的生理功能。表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(Epigallocatechin-3-gallate，EGCG)是茶葉中最具生理活性的化學(xué)成分之一，在抑菌、消炎、抗突變、降壓、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、鎮(zhèn)靜、護(hù)肝、抗氧化、抗癌、抑制脂肪氧化酶等方面有顯著效果[1]。血清白蛋白分子中的色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)殘基能吸收紫外光，且能夠發(fā)射熒光，所以血清白蛋白具有天然熒光[2]。由于Trp、Tyr和Phe的側(cè)鏈基團(tuán)不同，三者的熒光光譜也不同，Trp的熒光強(qiáng)度最大，Phe的熒光強(qiáng)度較小。血清白蛋白的內(nèi)源熒光主要是Trp和Tyr殘基發(fā)射的，因此，通常利用Trp的熒光研究蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象及與小分子的相互作用[3-4]。

熒光猝滅法是研究生物大分子與小分子、離子相互作用的主要手段[5-6]。研究蛋白質(zhì)的熒光猝滅過(guò)程能夠得到小分子與蛋白質(zhì)作用的結(jié)合常數(shù)、作用區(qū)域及位置信息。研究表明，激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm時(shí)，蛋白質(zhì)的熒光來(lái)自Trp和Tyr二者的貢獻(xiàn)，但主要是Trp的貢獻(xiàn)[7]。熒光猝滅過(guò)程可以分為兩種：一種是動(dòng)態(tài)猝滅，另一種是靜態(tài)猝滅。動(dòng)態(tài)猝滅是猝滅劑和熒光物質(zhì)的激發(fā)態(tài)分子之間所發(fā)生的相互作用過(guò)程，如能量轉(zhuǎn)移或電子轉(zhuǎn)移過(guò)程。靜態(tài)猝滅的特征是猝滅劑和熒光物質(zhì)分子在基態(tài)時(shí)發(fā)生配合反應(yīng)，產(chǎn)生配合物。使用Stern-Volmer方程可判斷藥物分子對(duì)蛋白質(zhì)熒光的猝滅機(jī)理。不同的猝滅機(jī)理反應(yīng)需用不同的Stern-Volmer修正方程來(lái)計(jì)算藥物分子對(duì)蛋白質(zhì)絡(luò)合反應(yīng)的結(jié)合常數(shù)。血漿中的一些金屬離子可影響血清白蛋白和藥物小分子的相互作用[8]。極微量的金屬離子通過(guò)與血清白蛋白形成復(fù)合體影響蛋白質(zhì)的構(gòu)象[9]。筆者所在實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)Cu(Ⅱ)能夠改變EGCG對(duì)牛血清白蛋白(β-lactoglobulin)的熒光猝滅能力及其絡(luò)合反應(yīng)的結(jié)合常數(shù)[10]。研究金屬離子對(duì)小分子藥物與血清白蛋白之間相互作用的影響對(duì)深入了解藥物在體內(nèi)的運(yùn)輸及代謝過(guò)程具有重要意義。筆者采用熒光猝滅法分別研究了EGCG及其Cu(Ⅱ)絡(luò)合物(EGCG-Cu)與牛血清白蛋白(BSA)的相互作用，以及Cu(Ⅱ)的存在對(duì)EGCG與BSA相互作用的影響，并分別使用不同的Stern-Volmer修正方程計(jì)算3種不同反應(yīng)體系中EGCG與BSA相互作用的結(jié)合常數(shù)。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

LS55型熒光/磷光/發(fā)光分光光度計(jì)(PerkinElmer公司，美國(guó))，UV-1750紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(島津公司，日本)。

牛血清白蛋白(BSA)(Sigma-Aldrich公司)用20 mmol/L醋酸鹽緩沖液(pH 7.4)配成濃度為0.03 mmol/L儲(chǔ)備液，于4℃保存?zhèn)溆?；表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG，純度≥95%),由立頓茶葉公司提供。將EGCG溶于50%甲醇水溶液中配成濃度約為0.2 mmol/L的反應(yīng)溶液。溶液中BSA和EGCG濃度分別經(jīng)紫外分光光度計(jì)在各自的摩爾消光系數(shù)下進(jìn)行校正：ε280(BSA)=43 000 L/(mol·cm)，ε280(EGCG)=9 700 L/(mol·cm)。分別稱(chēng)取一定量的CuCl2·3H2O溶于0.1 mol/L鹽酸溶液配成濃度為0.2和0.5 mmol/L的Cu(Ⅱ)溶液。分別取等體積的0.2 mmol/L EGCG溶液和0.2 mmol/L Cu(Ⅱ)溶液混合后得到0.1 mmol/L的EGCG-Cu絡(luò)合物溶液。本試驗(yàn)所用緩沖液為磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)，所用試劑均為分析純，試驗(yàn)用水為一級(jí)水。

1.2 熒光光譜測(cè)定

1.2.1 EGCG-BSA反應(yīng)

移取2.8 mL醋酸鹽緩沖溶液(pH 7.4)于1 cm石英池中，加入200 μL濃度為0.03 mmol/L的BSA溶液。充分混勻后用移液器逐次加入經(jīng)50%甲醇水溶液稀釋后濃度為0.07 mmol/L的EGCG溶液進(jìn)行熒光滴定反應(yīng)，每次加入EGCG溶液40 μL，EGCG加入總量為200 μL。反應(yīng)溶液中BSA的終濃度為1.88 μmol/L。每次加入溶液后混合均勻，以280 nm為激發(fā)波長(zhǎng)(λex)，在熒光分光光度計(jì)上記錄290～450 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的發(fā)射光譜。反應(yīng)均在常溫(23℃)下進(jìn)行。每次滴定試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2 [EGCG-Cu]-BSA反應(yīng)

移取2.8 mL醋酸鹽緩沖溶液(pH 7.4)于1 cm石英池中，加入200 μL濃度為0.03 mmol/L的BSA溶液。充分混勻后用移液器逐次加入濃度為0.1 mmol/L的EGCG-Cu絡(luò)合物溶液進(jìn)行熒光滴定反應(yīng)，每次加入EGCG-Cu絡(luò)合物溶液40 μL，加入總量為200 μL。每次加入后，充分混合，并按照1.2.1部分所述方法記錄反應(yīng)溶液的發(fā)射光譜。

1.2.3 EGCG-反應(yīng)

移取2.8 mL醋酸鹽緩沖溶液(pH 7.4)于1 cm石英池中，加入200 μL濃度為0.03 mmol/L的BSA溶液，混勻，再加入40 μL濃度為0.5 mmol/L的CuCl2溶液。充分混勻后用移液器逐次加入經(jīng)50%甲醇水溶液稀釋后濃度為0.07 mmol/L的EGCG溶液進(jìn)行熒光滴定絡(luò)合反應(yīng)，每次加入EGCG溶液40 μL，加入總量為200 μL。每次滴定反應(yīng)后按照1.2.1部分所述方法記錄反應(yīng)溶液的發(fā)射光譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 EGCG、EGCG-Cu絡(luò)合物對(duì)BSA熒光光譜影響

BSA分子中因存在色氨酸、酪氨酸及苯丙氨酸殘基使其本身具有較強(qiáng)的內(nèi)源熒光。在280 nm波長(zhǎng)激發(fā)下得到的為蛋白質(zhì)分子色氨酸和酪氨酸的熒光發(fā)射光譜，其峰值在350 nm左右，而在同一條件下，EGCG均不產(chǎn)生熒光。EGCG和EGCG-Cu絡(luò)合物對(duì)BSA的熒光光譜影響如圖1所示。從圖1A和B中可以看出，固定BSA濃度，隨樣品濃度增加，BSA在350 nm處的熒光發(fā)射峰強(qiáng)度明顯減弱，出現(xiàn)典型的熒光猝滅現(xiàn)象，表明EGCG和EGCG-Cu絡(luò)合物均與BSA發(fā)生了相互作用。同時(shí)，可以發(fā)現(xiàn)在猝滅過(guò)程中BSA熒光發(fā)射光譜最大峰值波長(zhǎng)均產(chǎn)生了明顯的紅移。當(dāng)BSA溶液中EGCG和EGCG-Cu濃度分別達(dá)到4.67和6.67 μmol/L后，BSA熒光發(fā)射光譜最大峰值波長(zhǎng)分別紅移了約15和16 nm。這表明在pH為7.4時(shí)，隨EGCG濃度增加，BSA發(fā)色團(tuán)的微環(huán)境發(fā)生了變化[11]。在Cu(Ⅱ)存在條件下，EGCG對(duì)BSA的熒光發(fā)射光譜的影響如圖1C所示。從圖1C可以看出，保持反應(yīng)溶液中BSA和Cu(Ⅱ)濃度不變，逐漸增加反應(yīng)溶液中EGCG濃度，BSA在350 nm處的熒光發(fā)射峰強(qiáng)度也出現(xiàn)了明顯減弱，呈現(xiàn)典型的熒光猝滅現(xiàn)象，表明反應(yīng)溶液中Cu(Ⅱ)存在情況下EGCG可以繼續(xù)與BSA發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)。但與EGCG-BSA及[EGCG-Cu]-BSA熒光猝滅過(guò)程不同，在EGCG-熒光猝滅過(guò)程中，BSA熒光發(fā)射光譜最大峰值波長(zhǎng)未發(fā)生明顯的紅移。因此，結(jié)合文獻(xiàn)[12]分析，推測(cè)Cu(Ⅱ)與BSA絡(luò)合反應(yīng)后蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)可能發(fā)生了改變，從而改變了EGCG與BSA的相互作用關(guān)系。

a:BSA濃度=1.88 μmol/L;b:Cu2+濃度=6.67 μmol/L圖1 不同濃度下EGCG(A)和EGCG-Cu(B)絡(luò)合物對(duì)BSA熒光光譜的影響以及Cu(Ⅱ)存在條件下EGCG對(duì)BSA熒光光譜的影響(C)(pH 7.4,λex=280 nm)Fig.1 Quenching effects of different concentrations of EGCG (A) and [EGCG-Cu] complex (B) on BSA fluorescence intensity as well as quenching effects of different concentrations of EGCG on BSA fluorescence intensity in the presence of Cu(Ⅱ) (C) (pH 7.4,λex=280 nm)

2.2 結(jié)合常數(shù)計(jì)算

小分子化合物對(duì)生物大分子的熒光猝滅方式分為靜態(tài)猝滅和動(dòng)態(tài)猝滅兩種。動(dòng)態(tài)猝滅其作用過(guò)程遵循Stern-Volmer方程[13]：

F0/F=1+Kqτ0[Q]=1+Ksv[Q]

(1)

式中：F和F0分別為猝滅劑存在和不存在時(shí)的熒光強(qiáng)度；Kq為雙分子猝滅過(guò)程速率常數(shù)，L/(mol·s)；Ksv為動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)，L/mol；τ0為無(wú)猝滅劑時(shí)生物大分子的平均壽命，一般約1×10-8s[14]；[Q]為猝滅劑濃度，mol/L。

pH為7.4時(shí)EGCG和EGCG-Cu絡(luò)合物對(duì)BSA熒光猝滅的Stern-Volmer曲線如圖2所示。從圖2可以看出，在3種反應(yīng)體系中Stern-Volmer曲線呈現(xiàn)不同變化趨勢(shì)。其中，EGCG-Cu絡(luò)合物濃度對(duì)BSA熒光猝滅的Stern-Volmer曲線呈較好的線性關(guān)系(圖2B)，其猝滅常數(shù)可由Stern-Volmer方程計(jì)算得到(圖3B)，結(jié)果見(jiàn)表1。當(dāng)EGCG濃度較高時(shí)，BSA熒光猝滅的Stern-Volmer曲線會(huì)向X軸彎曲(圖2A)，這表明EGCG在高濃度下只能猝滅部分BSA上的發(fā)色基團(tuán)[5]。在這種情況下，EGCG對(duì)BSA的猝滅常數(shù)可由修正的Stern-Volmer方程[13]計(jì)算得到。

F0/ΔF=(1/(fa×Ka)×(1/[Q])+1/fa

(2)

式中：ΔF=F0-F，F(xiàn)和F0分別為猝滅劑存在和不存在時(shí)的熒光強(qiáng)度；fa為猝滅劑可以接近的熒光基團(tuán)的百分比；[Q]為猝滅劑濃度，mol/L；Ka為修正的Stern-Volmer猝滅常數(shù)，即結(jié)合常數(shù)Ksv，L/mol。以F0/ΔF為縱坐標(biāo)，1/[Q]為橫坐標(biāo)作圖(圖3A)可以得到方程的截距1/fa和斜率1/(fa×Ka)。根據(jù)方程的截距和斜率值可以計(jì)算出fa和Ka。

可利用以上修正的Stern-Volmer方程(2)計(jì)算得到EGCG與BSA的結(jié)合常數(shù)Ksv(表1)。

圖2 EGCG(A)和EGCG-Cu(B)絡(luò)合物對(duì)BSA熒光猝滅Stern-Volmer曲線變化趨勢(shì)及EGCG對(duì)BSA-Cu熒光猝滅Stern-Volmer曲線變化趨勢(shì)(C)Fig.2 Stern-Volmer plots for BSA fluorescence quenching by EGCG (A) and [EGCG-Cu] complex (B) as well as Stern-Volmer plot for fluorescence quenching by EGCG (C)

圖3 EGCG(A)和EGCG-Cu絡(luò)合物(B)對(duì)BSA熒光猝滅Stern-Volmer修正方程曲線及EGCG對(duì)BSA-Cu熒光猝滅Stern-Volmer修正方程曲線(C)Fig.3 Modified Stern-Volmer plot for EGCG (A) and [EGCG-Cu] (B) quenching of BSA fluorescence as well as modified Stern-Volmer plot for EGCG quenching of fluorescence (C)

表1 不同Stern-Volmer修正方程計(jì)算得到的結(jié)合常數(shù)(Ksv)Table 1 Modified Stern-Volmer quenching constants (Ksv)

注：Cu(Ⅱ)濃度為6.67 μmol/L；試驗(yàn)數(shù)據(jù)表示為平均值±SD(n=3)。

有些情況下，因同時(shí)存在分子間碰撞(動(dòng)態(tài)猝滅)和形成復(fù)合物(靜態(tài)猝滅)，血清蛋白的熒光被多酚類(lèi)化合物猝滅。在BSA溶液中存在Cu(Ⅱ)條件下，當(dāng)反應(yīng)溶液中存在高濃度EGCG時(shí)，Stern-Volmer曲線會(huì)向Y軸彎曲(圖2C)，Stern-Volmer方程(1)可修正為F0/F=(1+KD[Q])(1+KS[Q])，并進(jìn)一步改寫(xiě)為Stern-Volmer修正方程(3)[13]：

[(F0/F)-1](1/[Q])=(KD+KS)+KDKS[Q]

(3)

式中：KS和KD分別為靜態(tài)和動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)，L/mol；[Q]為猝滅劑的濃度，mol/L；以[(F0/F)-1](1/[Q])為縱坐標(biāo)，[Q]為橫坐標(biāo)作圖(圖3C)，可計(jì)算得到KS和KD值。KS和KD相加即得結(jié)合常數(shù)Ksv。

可通過(guò)以上Stern-Volmer修正方程(3)計(jì)算得到EGCG與的結(jié)合常數(shù)Ksv(表1)。由表1可見(jiàn)，EGCG與的結(jié)合常數(shù)(1.17×105L/mol)小于EGCG與BSA的結(jié)合常數(shù)(5.17×105L/mol)，而[EGCG-Cu]與BSA的結(jié)合常數(shù)(8.88×105L/mol)則大于EGCG與BSA的結(jié)合常數(shù)。由此說(shuō)明，反應(yīng)溶液中Cu(Ⅱ)的存在會(huì)降低EGCG與BSA相互反應(yīng)的結(jié)合常數(shù)，相反，EGCG絡(luò)合Cu(Ⅱ)后能夠提高EGCG與BSA相互作用的結(jié)合常數(shù)。

3 結(jié) 論

利用熒光猝滅法分別研究了EGCG及其Cu(Ⅱ)絡(luò)合物與BSA的相互作用，以及Cu(Ⅱ)存在條件下對(duì)EGCG與BSA相互作用的影響，分析了不同絡(luò)合反應(yīng)的熒光猝滅機(jī)理。利用不同的Stern-Volmer方程的修正方程分別計(jì)算得到EGCG-BSA、[EGCG-Cu]-BSA、EGCG-絡(luò)合反應(yīng)體系的結(jié)合常數(shù)。研究發(fā)現(xiàn)反應(yīng)溶液中Cu(Ⅱ)的存在會(huì)改變EGCG與BSA的相互作用形式，并降低EGCG與BSA相互反應(yīng)的結(jié)合常數(shù)，相反，EGCG絡(luò)合Cu(Ⅱ)后能夠提高EGCG與BSA相互作用的結(jié)合常數(shù)。本研究結(jié)果對(duì)了解茶多酚在體內(nèi)的狀態(tài)和藥理作用具有重要意義。此外，對(duì)利用熒光猝滅法研究小分子化合物與蛋白質(zhì)相互作用過(guò)程中不同Stern-Volmer修正方程的選擇具有指導(dǎo)意義。

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Study on binding of EGCG-Cu complex to bovine serum albumin

ZHANG Liangliang,XU Man,HU Xinyu,WANG Yongmei

(Key Lab.of Biomass Energy and Material,Jiangsu Province， Institute of Chemical Industry of Forest Products, CAF,Nanjing 210042,China)

Epigallocatechin-3-gallate (EGCG),the major polyphenolic constituent of green tea,has a variety of biological functionsinvitro,including the inhibition of cell proliferation,induction of cell cycle arrest or apoptosis,and inhibition of tumor angiogenesis and vascular tumor growth.The potential chelating activity of EGCG for metal ions,especially transitional metal ions,has significant effects on the bioactivity of EGCG.Binding interactions between EGCG and its copper complex and bovine serum albumin (BSA) were investigated through fluorescence spectroscopy in this study.The effect of copper on the interaction between EGCG and BSA was also analyzed.The different quenching mechanisms in the binding interaction were studied and the binding constants of EGCG,EGCG-Cu(Ⅱ) to BSA were obtained by using different modified Stern-Volmer equations.The results showed that,when EGCG and EGCG-Cu(Ⅱ) were added to the BSA solution,the fluorescence was quenched,indicating that interactions happened between EGCG,EGCG-Cu(Ⅱ) and BSA.The fluorescence intensity gradually decreased with the increasing concentration of EGCG with an obvious red-shift of the maximum of BSA.When EGCG was continuously added to BSA solution containing Cu(Ⅱ) at pH 7.4,the fluorescence of BSA decreased.There was no spectral shift when the EGCG was added to BSA containing Cu(Ⅱ),indicating that the mode of EGCG-BSA interaction is expected to be altered by Cu(Ⅱ).Additionally,the binding constant between EGCG and BSA increased significantly after EGCG was modified by Cu(Ⅱ) to form EGCG-Cu(Ⅱ) complex.Our results suggest that after chelating with copper,the interaction mode of EGCG with BSA is altered and this could have various implications on its other physicochemical activities.

EGCG;BSA;fluorescence spectroscopy;Stern-Volmer equation

Q614.33

A

2096-1359(2017)05-0046-05

2016-12-03

2017-01-25

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(2017YFD0601000)；江蘇省生物質(zhì)能源與材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目(JSBEM-S-201707)。

張亮亮，男，博士，副研究員，研究方向?yàn)橹参飭螌?多酚)化學(xué)。E-mail:zhll20086@163.com