王欽美，張志宏，崔建國(guó)

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，遼寧 沈陽 110866； 2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，遼寧 沈陽 110866)

無性繁殖植株的生理年齡
——由端粒長(zhǎng)度引發(fā)的思考

王欽美1,2，張志宏1*，崔建國(guó)2

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，遼寧 沈陽 110866； 2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，遼寧 沈陽 110866)

植物細(xì)胞中端粒長(zhǎng)度隨年齡的變化遠(yuǎn)比動(dòng)物復(fù)雜，可分為不變組、延長(zhǎng)組、縮短組和循環(huán)變化組。盡管如此，端粒長(zhǎng)度亦可用于預(yù)測(cè)植物年齡。在植物組織培養(yǎng)過程中，端粒長(zhǎng)度也會(huì)變化。故無性繁殖植株生理年齡值得思考和研究。本文基于端粒長(zhǎng)度探討了無性繁殖植株生理年齡。認(rèn)為生理年齡較老供體可能會(huì)無性繁殖出“小老頭”無性系，端粒長(zhǎng)度可能成為預(yù)測(cè)植物材料無性繁殖能力和愈傷組織再分化能力的有效新指標(biāo)，老樹復(fù)幼和端粒長(zhǎng)度的關(guān)系是一個(gè)很好的研究課題。此外，提出了植物愈傷組織需要足夠的時(shí)間來抹除外植體“痕跡”的新觀點(diǎn)。關(guān)于植物無性繁殖過程中的端粒長(zhǎng)度，有很多問題亟待研究和探索。

端粒；離體快速繁殖；扦插；嫁接；生理年齡

Abstract: The change of telomere length during aging of plant cells has been found to be much more complicated than that in animals. It can be divided into the invariant group, the prolongation group, the shortening group and the circle change group. Nevertheless, the age of plants can also be predicted based on telomere length. Moreover, the telomere length can change during plant tissue culture. Thus, the physiological age of asexual plants is worth to be studied. In the article, the physiological age of asexual plants is discussed based on telomere length. It is concluded that the older donor might produce clone with small body but old physiological age, telomere length might be a novel reliable indicator for assessment the ability of both asexual propagation and callus redifferentiation of plants, the relationship between old-tree reinvigoration and telomere length might be a good research project. Furthermore, it is proposed that plant calli need enough time to erase the traces of the explants. Many problems about the telomere length during asexual propagation of plants are urgent to be researched and explored.

Keywords: telomere;invitrorapid propagation; cutting; grafting; physiological age

端粒是位于真核生物染色體末端的核蛋白結(jié)構(gòu)，它由端粒DNA重復(fù)序列、組蛋白八聚體和蛋白端粒帽子共同形成[1-2]。大多數(shù)陸生植物的端粒DNA是擬南芥式的7核苷酸重復(fù)(TTTAGGG)n[3]，但是也有人類式重復(fù)等很多例外情況存在(表1)[2]。端粒能夠保護(hù)線性染色體不被內(nèi)源核酸酶損傷，避免線性染色體被誤識(shí)為未配對(duì)的染色體斷片[2]；端粒與細(xì)胞分裂、細(xì)胞衰老及壽命有著密切的聯(lián)系[4]。在人類[5-6]和澳大利亞海獅等動(dòng)物體細(xì)胞中[7-9]，端粒隨DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂次數(shù)的增加而縮短。當(dāng)端粒短到一定程度，細(xì)胞進(jìn)入衰老期[10]。因此，人類和動(dòng)物體細(xì)胞的端?？s短被認(rèn)為是老化的指標(biāo)。雖然在大麥[11]和人參[9]等植物中也檢測(cè)到年齡和端粒長(zhǎng)度呈顯著相關(guān)[4]，但是植物中端粒長(zhǎng)度和年齡的關(guān)系卻遠(yuǎn)比動(dòng)物復(fù)雜得多。隨著植物年齡的增長(zhǎng)和發(fā)育的進(jìn)行，有些物種有些部位的端粒長(zhǎng)度呈延長(zhǎng)趨勢(shì)、有些縮短、有些基本不變，甚至有些呈現(xiàn)周期性變化(表2)?？傊?，不同植物物種、同一物種不同基因型、同一物種不同組織、同一物種不同分化程度的相同組織、不同環(huán)境及生理?xiàng)l件下的相同部位，端粒長(zhǎng)度都可能存在差異[3,9]。盡管如此，針對(duì)有些多年生植物物種的研究發(fā)現(xiàn)，端粒長(zhǎng)度可以用來預(yù)測(cè)植株的年齡。例如，2015年Liang等人建立了人參年齡和端粒長(zhǎng)度相關(guān)的數(shù)學(xué)模型[9]；

表1 目前發(fā)現(xiàn)的陸生植物端粒DNA多樣性(非擬南芥式重復(fù))Table 1 The current knowledge on telomere DNA diversity in land plants (The non-Arabidopsis-type of telomeric repeats)

2015年劉頔等人建立了油松端粒長(zhǎng)度和樹齡的相關(guān)關(guān)系模型[4]。植物體的端粒調(diào)控存在復(fù)雜的機(jī)制：端粒酶可以在一定程度上維持或者延長(zhǎng)端粒DNA的長(zhǎng)度[22]；在缺乏端粒酶的情況下，端?？杀弧耙蕾囉谥亟M的替代機(jī)制”所延長(zhǎng)[23]；新近研究發(fā)現(xiàn)多種表觀遺傳機(jī)制參與了端粒穩(wěn)定性[24-25]?？梢婈P(guān)于植物端粒長(zhǎng)度的維持機(jī)制，仍有很多內(nèi)容有待研究。

表2 目前發(fā)現(xiàn)的植物端粒長(zhǎng)度隨年齡、發(fā)育和細(xì)胞分裂的變化情況)Table 2 The current knowledge on telomere length changes in plants during aging, development and cell division

植物離體快速繁殖，即植物組織培養(yǎng)，是植物無性繁殖的典范。它是利用植物細(xì)胞的全能性，在無菌條件下，對(duì)離體的植物器官、組織、細(xì)胞及原生質(zhì)體進(jìn)行培養(yǎng)，以獲得完整植株的技術(shù)。盡管體細(xì)胞無性系變異廣泛存在[26-29],較之有性繁殖技術(shù)，植物組織培養(yǎng)技術(shù)具備繁殖速度快，繁殖植株能在更大程度上保持母株的優(yōu)良性狀等諸多優(yōu)點(diǎn)[26]。在林業(yè)領(lǐng)域，植物離體快速繁殖具備更加重要的意義。因?yàn)榱帜就ǔ＞邆渖L(zhǎng)周期長(zhǎng)、子代性狀分離顯著等特點(diǎn)。一旦發(fā)現(xiàn)優(yōu)良單株，比如雜種優(yōu)勢(shì)成年優(yōu)株，利用離體快速繁殖可以實(shí)現(xiàn)短期繁殖大量?jī)?yōu)良植株的目的。值得注意的是，2014年Aronen和Ryyn?nen研究發(fā)現(xiàn)隨著白樺愈傷組織離體培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，其端粒長(zhǎng)度呈逐漸縮短的趨勢(shì)[3]。又因?yàn)槎肆ｉL(zhǎng)度也可以用于預(yù)測(cè)植物細(xì)胞的分裂能力和植株的年齡[4,9,30]，所以以上發(fā)現(xiàn)引發(fā)了我們對(duì)于無性繁殖植株生理年齡的思考，本文將圍繞端粒長(zhǎng)度這條主線探討無性繁殖植株的生理年齡。

1 端粒長(zhǎng)度與“小老頭”無性系

研究發(fā)現(xiàn)同一植株不同器官的端粒長(zhǎng)度有所不同[3,9,17]，那么對(duì)于葉片細(xì)胞中端粒較短的植株。如果選用葉片作為外植體，葉片再分化產(chǎn)生的愈傷組織再分化產(chǎn)生植株的端粒長(zhǎng)度與同等大小的實(shí)生苗相比會(huì)不會(huì)有所變化？愈傷組織可能的高端粒酶活性能在一定程度上使端粒的長(zhǎng)度有所恢復(fù)甚至變得更長(zhǎng)[17-19]，那么以葉片為外植體的不經(jīng)過愈傷的直接器官或直接體細(xì)胞胚胎發(fā)生植株的端粒長(zhǎng)度又會(huì)如何呢？如果葉片產(chǎn)生植株端粒長(zhǎng)度比相應(yīng)的實(shí)生苗短，是否證明葉片無性植株的生理年齡老于實(shí)生苗？本課題組先前的研究發(fā)現(xiàn)以大花君子蘭葉片作為外植體，通過直接器官發(fā)生路徑產(chǎn)生的植株存在生長(zhǎng)異常緩慢的現(xiàn)象。這很可能是因?yàn)槿~片直接發(fā)生植株的端粒長(zhǎng)度較短、實(shí)際生理年齡較老。如果用于無性繁殖的外植體或插條取自百年老樹，“小老頭”無性系，即表現(xiàn)為“三歲之軀，百歲之身”的無性系，是否真的存在？如果存在，那么這種無性繁殖植株會(huì)成為典型“小老頭樹”且壽命會(huì)短于實(shí)生苗。

研究發(fā)現(xiàn)從生理年齡較老的器官或組織取外植體進(jìn)行無性繁殖，其后代往往存在早衰或優(yōu)勢(shì)衰退甚至喪失等現(xiàn)象，但是從接近根際部位或生理年齡較小的器官或組織取外植體獲得無性系較容易保持母株優(yōu)良性狀，無性系苗木生長(zhǎng)健壯、生機(jī)盎然[31]。由于一般樹木接近根際部位的莖干形成層的端粒長(zhǎng)度較長(zhǎng)[3,13]。所以推測(cè)較長(zhǎng)的端粒賦予植物更佳的無性繁殖表現(xiàn)。這也證明由端粒長(zhǎng)度預(yù)測(cè)細(xì)胞增殖能力和無性繁殖表現(xiàn)的可行性。然而，經(jīng)過愈傷階段的間接器官/體細(xì)胞胚胎發(fā)生可能會(huì)是特例。因?yàn)橐延醒芯孔C明合適的離體培養(yǎng)條件會(huì)使愈傷細(xì)胞的端粒長(zhǎng)度延長(zhǎng)至大于外植體細(xì)胞端粒的長(zhǎng)度[17-19]。愈傷組織特有的端粒延長(zhǎng)機(jī)制，恰恰解釋了為什么植物的分化外植體能夠返老還童式地再生出大量看似幼嫩的植株。

豆科固氮速生豐產(chǎn)樹種馬占相思(AcaciamangiumWilld.)的葉子具備二型性[32]。幼齡植株首先產(chǎn)生小葉數(shù)不同的復(fù)葉，然后產(chǎn)生中間過渡類型的葉狀柄，之后產(chǎn)生的為完全葉狀柄。完全葉狀柄被認(rèn)為是馬占相思植株成熟的標(biāo)志，而復(fù)葉被認(rèn)為是馬占相思幼齡的標(biāo)志[32-33]。研究發(fā)現(xiàn)取自幼齡馬占相思植株的莖外植體產(chǎn)生的幼齡形態(tài)的試管苗比例明顯高于成齡植株外植體產(chǎn)生的試管苗；成齡莖外植體也可產(chǎn)生幼齡形態(tài)試管苗，但其產(chǎn)生試管苗多數(shù)具備成齡形態(tài)的葉狀柄[32]。可能因?yàn)榫邆涑升g特征試管苗的生理年齡大于具備幼齡特征的試管苗和實(shí)生苗的生理年齡。推測(cè)成齡莖外植體的葉腋分生組織端粒長(zhǎng)度可能短于幼齡外植體，從而致使老齡外植體產(chǎn)生的試管苗多數(shù)具備成齡樹的特征——葉狀柄。因此，可以認(rèn)為具備成齡形態(tài)葉狀柄的馬占相思試管苗生理年齡較老，為 “三歲之軀，百歲之身”的典范。比較研究馬占相思幼齡特征試管苗和成齡特征試管苗的壽命、端粒長(zhǎng)度以及兩種葉子和外植體的端粒長(zhǎng)度是很有必要的。

老樹樹干形成層端粒越往上越短[3,13]，越接近樹干基部的枝條扦插通常越容易生根[34]。那么是否可以認(rèn)為樹干較上位置的側(cè)枝扦插得到的植株的生理年齡較老？推測(cè)這類扦插繁殖植株的生理年齡大于同等大小的實(shí)生苗。以上證據(jù)仍然支持“三歲之軀，百歲之身”。

總之，生理年齡較老的植物材料作為無性繁殖的供體，不經(jīng)過愈傷組織階段產(chǎn)生的無性系的生理年齡可能遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于同等大小的實(shí)生苗。盡管這類無性繁殖植株在初期看上去也是“嬌小”如童，但是從生理上來講它們可能已算“百歲老人”！

2 端粒長(zhǎng)度與外植體無性繁殖能力

Liang等人建立了人參年齡和端粒長(zhǎng)度相關(guān)的數(shù)學(xué)模型。根據(jù)此模型，可由人參主根上部的端粒長(zhǎng)度預(yù)測(cè)人參年齡[9]。那么是否可以由端粒長(zhǎng)度預(yù)測(cè)植物材料的無性繁殖能力呢？報(bào)道顯示歐洲赤松和白樺樹干下端形成層端粒長(zhǎng)度長(zhǎng)[3,13]；樹干下端枝用做插穗生根率相對(duì)較高[34]；越老的組織用于做外植體，離體再生能力越弱[28]；很多植物的端粒長(zhǎng)度隨年齡和發(fā)育的進(jìn)行而變化[4,9]。以上發(fā)現(xiàn)證明端粒長(zhǎng)度可以反映植物/細(xì)胞的生理年齡，而植物材料/細(xì)胞的生理年齡又可以決定其無性繁殖能力。所以推測(cè)植物材料/細(xì)胞的端粒長(zhǎng)度很可能成為預(yù)測(cè)其無性繁殖能力的有效新指標(biāo)。

3 端粒長(zhǎng)度與愈傷組織再分化潛能

研究發(fā)現(xiàn)大麥的端粒隨著分化而逐漸縮短，但是在大麥愈傷組織培養(yǎng)初期端?？s短，之后又逐漸延長(zhǎng)[18]。此外，幾乎所有植物的愈傷組織都要在培養(yǎng)一段時(shí)間之后才能分化[26,29]。這證明愈傷組織端粒長(zhǎng)度很可能是愈傷再分化的限制因子之一。合適的愈傷培養(yǎng)時(shí)間使細(xì)胞有足夠的機(jī)會(huì)延長(zhǎng)端粒、降低生理年齡，進(jìn)而為再分化做好準(zhǔn)備。因此在具體實(shí)驗(yàn)過程中，應(yīng)該選用端粒較長(zhǎng)的愈傷組織用于誘導(dǎo)出芽。如果以上推論成立，愈傷端粒長(zhǎng)度也將成為評(píng)判愈傷再分化能力的有效新指標(biāo)。

研究發(fā)現(xiàn)可可再生植株葉片的甲基化狀態(tài)處于外植體供體植株葉片和雄蕊(外植體)之間。隨著愈傷組織培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，愈傷再生植株葉片的甲基化狀態(tài)和SSR標(biāo)記逐漸接近供體植株葉片[35]。即短期培養(yǎng)愈傷給出的無性植株的體細(xì)胞無性系變異頻率高，長(zhǎng)期培養(yǎng)愈傷給出的植株的體細(xì)胞無性系變異頻率反而低。有報(bào)道顯示在端粒長(zhǎng)度與生理年齡負(fù)相關(guān)的大麥愈傷組織培養(yǎng)初期端粒長(zhǎng)度變短，而后隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)端粒又逐漸變長(zhǎng)[18]。如果以上關(guān)于端粒長(zhǎng)度和體細(xì)胞無性系變異的兩項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)在植物界較具普遍性，則證明較長(zhǎng)端粒對(duì)應(yīng)較低的體細(xì)胞無性系變異頻率、較短端粒對(duì)應(yīng)較高的體細(xì)胞無性系變異頻率。因?yàn)橐话愕腄NA修復(fù)系統(tǒng)對(duì)端粒序列是無效的，所以端?？s短也是總體DNA損傷積累的感受器[36]。故推測(cè)愈傷組織培養(yǎng)初期的端?？s短恰恰是DNA損傷和體細(xì)胞無性系變異積累的體現(xiàn)，而愈傷組織培養(yǎng)后期則相反。從這個(gè)角度來講，愈傷端粒長(zhǎng)度的動(dòng)態(tài)變化和愈傷產(chǎn)生植株的體細(xì)胞無性系變異情況是相吻合的。雖然前人和課題組前期研究證明植株再生不需要完全精準(zhǔn)地模仿植物發(fā)育過程[29]，但是以上研究發(fā)現(xiàn)證明已經(jīng)分化的外植體細(xì)胞需要足夠的時(shí)間和細(xì)胞分裂次數(shù)來盡可能清除以前細(xì)胞狀態(tài)下的 “痕跡”(包括端粒長(zhǎng)度和甲基化狀態(tài))。一定的愈傷培養(yǎng)周期提供了逐步抹除“痕跡”的機(jī)會(huì)。所以隨著愈傷培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，痕跡清除越來越徹底，產(chǎn)生的植株也就可能越“保真”了。綜上所述，在進(jìn)行組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)該選擇脫分化徹底的、外植體“痕跡”盡可能少的愈傷組織來誘導(dǎo)芽叢或體細(xì)胞胚。

4 端粒長(zhǎng)度與老樹復(fù)幼

植物和動(dòng)物一樣，也會(huì)成熟和衰老[36]。但是植物和動(dòng)物又不同——衰老植物會(huì)返老還童，比如老樹會(huì)通過嫁接復(fù)幼[37]。復(fù)幼的老樹不僅能恢復(fù)幼年期的生長(zhǎng)勢(shì)、外表形態(tài)、生理生化狀態(tài)和細(xì)胞調(diào)控機(jī)制等，而且扦插生根能力也能完全恢復(fù)[38]?？梢姀?fù)幼老樹的生理年齡大大降低，那么復(fù)幼老樹的端粒長(zhǎng)度是否也恢復(fù)到幼齡時(shí)的狀態(tài)呢？復(fù)幼老樹的生理年齡具體又該如何計(jì)算呢？如果科學(xué)研究確實(shí)能夠證明復(fù)幼老樹端粒也恢復(fù)到幼齡狀態(tài)，那么進(jìn)一步研究比較老樹接穗與幼樹砧木的端粒長(zhǎng)度以及復(fù)幼老樹的端?；謴?fù)機(jī)制，將是很有意思的研究課題。

5 前景和展望

目前關(guān)于植物端粒長(zhǎng)度和年齡相關(guān)的研究報(bào)道仍然很有限[9, 36]。很多植物物種，尤其是多年生林木的無性繁殖植株的端粒長(zhǎng)度及壽命有待研究。外植體的端粒長(zhǎng)度是否可以用于預(yù)測(cè)再生能力，愈傷組織的端粒長(zhǎng)度是否可以預(yù)測(cè)再分化能力，何時(shí)誘導(dǎo)愈傷組織再分化更合適？什么樣的愈傷細(xì)胞才能成為再分化的感受態(tài)細(xì)胞？嫁接誘導(dǎo)老樹復(fù)幼是否與端粒長(zhǎng)度的變化有關(guān)？組培再生植株的幼齡化表型是否與端粒的長(zhǎng)度有關(guān)？這些都是亟需研究和解決的科學(xué)問題。例如，僅僅對(duì)于用葉片作為外植體的離體快速繁殖，就有很多內(nèi)容是值得研究的(表3)。尤其對(duì)于葉片端粒長(zhǎng)度與植株其它部位存在明顯差異的物種。我們堅(jiān)信隨著高通量測(cè)序等實(shí)驗(yàn)技術(shù)手段的不斷進(jìn)步，這些問題在不久的將來都將被揭曉。

表3 不同材料端粒長(zhǎng)度比較可能揭示的內(nèi)容

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(責(zé)任編輯：張 研)

ThePhysiologicalAgeofAsexualPlants——ThinkingArisefromTelomereLength

WANGQin-mei1,2，ZHANGZhi-hong1，CUIJian-guo2

(1.College of Horticulture, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, Liaoning, China;2.College of Forestry, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, Liaoning, China)

S722.3

A

1001-1498(2017)05-0866-05

10.13275/j.cnki.lykxyj.2017.05.021

2016-02-06

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31600546)、中國(guó)博士后科學(xué)基金項(xiàng)目(2015M571330)、遼寧省教育廳一般項(xiàng)目(L2015487)、沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)教師青年科研基金項(xiàng)目(20131002)、沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)研究項(xiàng)目(2016-107)。

王欽美，博士，碩士研究生導(dǎo)師。主要研究方向：林木遺傳育種.E-mail : wqmwan@126.com 地址:110866，遼寧省沈陽市沈河區(qū)東陵路120號(hào).

* 通訊作者：張志宏，教授，博士研究生導(dǎo)師。主要研究方向：果樹分子生物學(xué).E-mail : zhang_sau@163.com 地址: 110866，遼寧省沈陽市沈河區(qū)東陵路120號(hào).