肖方震，林代華，劉維俊，韓騰偉，周淑姮，鄧艷琴，2

DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2017.09.007

福建省動物宿主感染巴貝蟲調(diào)查研究

肖方震1，林代華1，劉維俊1，韓騰偉1，周淑姮1，鄧艷琴1，2

目的了解福建省動物宿主感染巴貝蟲狀況。方法2014-2016年本中心在福建各地捕鼠，籠日法捕鼠，采集鼠心臟血，同時采集牛、羊和狗的血液樣本，采用PCR擴(kuò)增巴貝蟲18S rRNA基因，感染率的比較采用χ2檢驗或Fisher’s確切概率法。結(jié)果調(diào)查共布放鼠籠5 917籠次，捕鼠381只，鼠密度為6.44%。全省鼠類巴貝蟲的感染率7.61%。家棲鼠中僅3只感染巴貝蟲，感染率為1.68%。野鼠中26只感染巴貝蟲，感染率為12.87%。野鼠感染率遠(yuǎn)高于家鼠，差異存在統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。地區(qū)分布看，閩中地區(qū)感染率最高，其次為閩東，閩南地區(qū)感染率最低，差異存在統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。其他動物，牛的血樣未檢出巴貝蟲，狗和羊的血樣中各1只檢出巴貝蟲，感染率分別為1.79%和0.55%。鼠類的巴貝蟲感染率高于其他動物的感染率，差異存在統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。序列分析顯示鼠類感染的均為田鼠巴貝蟲。而犬中檢出的巴貝蟲為犬巴貝蟲。結(jié)論福建省巴貝蟲宿主動物中鼠類尤其是野鼠，感染率最高，可能是我省巴貝蟲最重要的宿主。

巴貝蟲；宿主動物；調(diào)查；福建

巴貝蟲屬于原生動物亞界、頂端復(fù)合門、孢子蟲綱、梨漿蟲亞綱、梨漿蟲目、巴貝蟲科、巴貝蟲屬。巴貝蟲中的雙芽巴貝蟲(Babesiabigemina)、牛巴貝蟲(Babesiabovis)、犬巴貝蟲(Babesiacanis)和田鼠巴貝蟲(Babesiamicroti)等7種明確可以致人巴貝蟲病[1-2]。目前巴貝蟲病日益呈現(xiàn)全球性分布，尤其是在美國、歐洲一些國家病例日益增多，近年我國浙江、云南等地區(qū)也陸續(xù)出現(xiàn)人感染巴貝蟲的病例[3-6]，因此巴貝蟲病受到越來越多的關(guān)注。巴貝蟲寄生的宿主動物多見于家畜和嚙齒類動物，包括牛、羊、馬、鼠類等。本研究既往研究的基礎(chǔ)上[13]，進(jìn)一步調(diào)查我省巴貝蟲的動物宿主感染狀況，更全面地了解我省動物攜帶巴貝蟲的狀況，以防止人與動物之間的傳播。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 本中心在福建的閩東、閩西、閩南、閩北和閩中共11個點采用籠日法進(jìn)行捕鼠，一共采集了381份鼠血、65份牛血、183份羊血和56份狗血樣本，在捕鼠同時捕獲的3只黃鼠狼的血液，血液樣品置于-80 ℃保存。

1.2 DNA提取 使用血液基因組DNA提取試劑盒(泰京生物)提取動物血液的巴貝蟲DNA，所有的操作均按照該試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3 PCR擴(kuò)增 參考相關(guān)文獻(xiàn)[7]在巴貝蟲的18S rRNA設(shè)計巴貝蟲的引物PIRO-A：5′-AAT ACC CAA TCC TGA CAC AGG G-3′；PIRO-B：5′-TTA AAT ACG AAT GCC AAC-3′。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s、60 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s、循環(huán)35次， 72 ℃總延伸5 min。每次PCR過程均設(shè)有陰性對照和陽性對照。為避免發(fā)生假陽性反應(yīng)，DNA模板提取、PCR反應(yīng)、電泳均在不同的房間操作。

1.4 產(chǎn)物檢測 反應(yīng)產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠電泳45 min，電壓為80 V，利用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理，率的比較采用四格表χ2檢驗、行列表χ2檢驗和Fisher’s確切概率法，P<0.05表示有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.6 序列分析 所有陽性產(chǎn)物純化，送上海生物工程有限公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果通過美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)進(jìn)行比對。應(yīng)用BioEdit軟件對序列進(jìn)行剪接，應(yīng)用MEGA6.0軟件，進(jìn)行同源性分析，以Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié) 果

所有的宿主動物的血樣進(jìn)行PCR擴(kuò)增，34個血樣中擴(kuò)增得到437 bp左右的片段(見圖1)，與預(yù)期的目標(biāo)條帶相符合。其中鼠類擴(kuò)增出29份陽性標(biāo)本，其他動物擴(kuò)增出5份陽性標(biāo)本。

2.1 鼠類感染巴貝蟲情況 調(diào)查共布放鼠籠5 917籠次，捕鼠381只，鼠密度為6.44%。捕獲381只鼠類，包括179只家棲鼠和202只野鼠。共發(fā)現(xiàn)29只鼠類感染巴貝蟲，全省鼠類巴貝蟲的感染率7.61%。以地區(qū)分布看，閩中地區(qū)的感染率最高，為13.46%，閩東地區(qū)次之，感染率為7.14%。閩南地區(qū)的鼠類未檢出巴貝蟲(見表1)。各地區(qū)間巴貝蟲的感染率差異(χ2=7.94，P<0.05)。

M: DNA marker; 8: Negative control; 9: Positive control; 1-7: Blood samples圖1 18S rRNA基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification of Babesia 18S rRNA gene

表1 福建省巴貝蟲感染情況
Tab.1 Babesia infection of rodents in different regions in Fujian

地區(qū)Region布籠數(shù)No.ofcage捕獲數(shù)/只No.ofexamined鼠密度%Densityrate/%陽性數(shù)/只No.ofpositive陽性率%Positiverate/%閩中CentralFujian12091048.601413.46閩東EasternFujian14901268.4697.14閩西WesternFujian1216604.9335.00閩南SouthernFujian487163.2900.00閩北NorthernFujian1515754.9534.00合計Total59173816.44297.61

以鼠種分析，家棲鼠檢出巴貝蟲感染僅3只，感染率為1.68%。野鼠中26只感染巴貝蟲，感染率為12.87%，擴(kuò)大調(diào)查的結(jié)果依然顯示，我省野鼠的巴貝蟲感染率遠(yuǎn)高于家鼠的巴貝蟲感染率(χ2=16.91，P<0.05)。家棲鼠中黃胸鼠和褐家鼠感染有巴貝蟲。常見家棲鼠種差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(Fisher’s確切概率法，P>0.05)。野鼠中感染巴貝蟲的主要鼠種包括板齒鼠、社鼠和針毛鼠。尤其是板齒鼠和社鼠的感染率達(dá)40%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他鼠種，差異存在統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=39.51，P<0.05)。

表2 不同鼠種感染巴貝蟲情況
Tab.2 Babesia infection in different rodents

鼠種Speciesofrodents檢測數(shù)/只No.ofexamined陽性數(shù)/只No.ofpositive陽性率%Positiverate/%家棲鼠Domesticatedrodents黃胸鼠R.flavipectus6011.67小家鼠MusmusculusLinnaeus400褐家鼠R.norvebicus11521.74合計Total17931.68野鼠Wildrodents黃毛鼠R.losea7011.43板齒鼠B.indica451840青毛鼠R.bowersilatouchei2400社鼠R.confucianus10440針毛鼠N.fulvescens5036其他Others300合計Total2022612.87總計Total381297.61

2.2 其他動物 我們同時檢測了牛、羊、狗和黃鼠狼的血液樣本。牛的血樣樣本匯總未檢出巴貝蟲，狗和羊的血液樣本中各有1份血樣檢出巴貝蟲，感染率分別為1.79%和0.55%。令人驚奇的是3份的黃鼠狼血樣中均檢出了巴貝蟲陽性。鼠類和其他動物的感染率比較，差異存在統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=12.95，P<0.05)。

表3 其他動物感染巴貝蟲情況
Tab.3 Babesia infection in different animals

其他動物Speciesofotheranimals檢測數(shù)/只No.ofexamined陽性數(shù)/只No.ofpositive陽性率%Positiverate/%牛Ox6500狗Dog5611.79羊Goat18310.55黃鼠狼Weasel33100

2.3 序列分析 通過測序，32份陽性產(chǎn)物獲得序列，2份出現(xiàn)雙峰未有結(jié)果(1份來自黃鼠狼，1份來自羊)。通過BLAST進(jìn)行比對，來源于鼠類感染的巴貝蟲均為田鼠巴貝蟲，黃鼠狼感染的巴貝蟲亦為田鼠巴貝蟲，序列與浙江的序列(AB241632)序列最接近，同源性達(dá)99%。狗感染的巴貝蟲為犬巴貝蟲。序列與巴西(KU662365)和印度(KT246307)的犬巴貝蟲序列最接近，同源性為99%。同源性比對顯示，除閩中(GT3)1份田鼠巴貝蟲序列同源性為99%，其余田鼠巴貝蟲的序列完全一致。而犬巴貝蟲序列與田鼠巴貝蟲序列同源性僅為87%。將序列與NCBI中的雙芽巴貝蟲、犬巴貝蟲等序列構(gòu)建進(jìn)化樹(見圖2)。

圖2 巴貝蟲18S RrRNA序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree based on partial 18S rRNA sequences of Babesia protozoa

3 討 論

巴貝蟲病作為一種寄生于哺乳動物紅細(xì)胞內(nèi)的人獸共患病，人群對巴貝蟲普遍易感，大部分病例癥狀較輕，呈亞臨床感染狀況，但在免疫功能低下的人群以及脾切除的病人中，它的致病力顯著增強(qiáng)，甚至?xí)氯怂劳鯷8-9]。近年歐美國家以及我國浙江、云南等地區(qū)多次出現(xiàn)人感染巴貝蟲的病例。同時作為血源性寄生蟲病，經(jīng)輸血或血制品以及感染巴貝蟲病例報道日趨增多[10-11]，甚至出現(xiàn)通過器官移植感染的報道[12]，因此該病日益受到重視。該病種作為新發(fā)的人獸共患病，我省對于該病宿主以及傳播媒介都缺乏系統(tǒng)的調(diào)查。各種相關(guān)資料匱乏。本研究調(diào)查了福建可能的幾種巴貝蟲宿主動物，結(jié)果顯示在牛、羊還是狗中檢出的巴貝蟲感染率并不高，狗的檢出率為1.79%，羊的檢出率亦只有0.55%。但在鼠類中檢出率較高，達(dá)7.61%，野鼠更是高達(dá)12.87%，這與我們前期開展的部分地區(qū)的調(diào)查結(jié)果基本一致[13]。我們認(rèn)為鼠類尤其是野鼠，是我省巴貝蟲的最重要宿主。與我省相鄰的溫州，開展的調(diào)查顯示其巴貝蟲的感染率為10%，與本次調(diào)查結(jié)果也較接近[14]。福建省森林覆蓋率全國第一，森林資源豐富，獨特的自然地理環(huán)境為巴貝蟲的傳播提供了有利的條件。近年隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，旅游業(yè)方興未艾，對于旅游人員以及生活在林區(qū)的居民做好個人防護(hù)，特別是加強(qiáng)野鼠的防范是很有必要的。黃鼠狼屬于野生動物，3只黃鼠狼均檢出了巴貝蟲，但由于在同一地方捕獲的，而且樣本量太少，因此包括黃鼠狼在內(nèi)的其他野生動物，作為巴貝蟲宿主的重要性有待進(jìn)一步研究。序列比對顯示，我省鼠類感染的巴貝蟲均為田鼠巴貝蟲，不論是家棲鼠還是野棲鼠，其感染的田鼠巴貝蟲序列高度一致。在犬的血液中首次檢出了犬巴貝蟲，該序列與印度等地分離的巴貝蟲序列有高度的同源性。

我省在多個宿主中檢出巴貝蟲，這需要引起相關(guān)的防控部門的重視。對于家畜可采取定期滅蜱，加強(qiáng)畜間檢疫，早期發(fā)現(xiàn)病畜，并給予積極的治療等措施。對于鼠類，我們要積極消滅鼠類，并減少接觸野鼠。我省動物宿主主要是田鼠巴貝蟲感染，田鼠巴貝蟲是感染人體的主要的蟲種，同時該蟲種亦是輸血感染巴貝蟲病的最主要蟲種[11]。作為一種可以輸血傳播的疾病，需要引起我省血液中心重視，加強(qiáng)血源管理。對獻(xiàn)血者進(jìn)行巴貝蟲等蜱傳播疾病的篩查，防止經(jīng)輸血傳播引起的人巴貝蟲病。

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NaturalhostsinfectedwithBabesiainFujianProvince,China

XIAO Fang-zhen1, LIN Dai-hua1, LIU Wei-jun1, HAN Teng-wei1, ZHOU Shu-heng1, DENG Yan-qin1,2

(1.FujianKeyLaboratoryforZoonoses,FujianCenterforDiseaseControlandPrevention,Fuzhou350001,China; 2.FujianMedicalUniversity,Fuzhou350001,China)

We explored the status ofBabesiainfection in natural hosts in Fujian Province. Rodents in Fujian Province were captured by the night trapping method during 2014-2016. Heart blood samples were collected. At the same time blood samples of ox, goats and dogs were also collected, from which the fragments of 18S rRNA gene ofBabesiawere amplified by polymerase chain reaction (PCR). Data on infection rate were analyzed with Chi-square or Fisher exact test to indicate statistical significance. Results showed that 5 917 cages were laid and 381 rodents were captured, density of rodent was 6.44%. The overallBabesiainfection rate in rodents was 7.61%, while infection rate in domesticated rodents was 1.68%, and the infection rate in wide rodents was 12.87%. The infection rate was higher in wild rodents than that in domesticated rodents, and the statistical analysis result revealed a significant difference. The infection rates in region of Central Fujian and Eastern Fujian was high, and no infection was found in Southern Fujian region. The statistical analysis result revealed a significant difference in infection rate among different regions. The infection rate of goats and dogs were determined to be 1.79% and 0.55%, and no infection was found in ox. The infection rate was higher in rodents than that in other host animals, and the statistical analysis result revealed a significant difference. It is suggested that the rodents, especially the wide rodents are the main natural hosts ofBabesia.

Babesia; host animals; investigation; Fujian

Deng Yan-qin, Email: fjcdcdyq@163.com

福建省醫(yī)學(xué)創(chuàng)新課題(2012-CXB-12)和福建省自然科學(xué)基金項目(2017J01139)聯(lián)合資助

鄧艷琴，Email：fjcdcdyq@163.com

1.福建省疾病預(yù)防控制中心，福建省人獸共患病研究重點實驗室，福州 350001；2.福建醫(yī)科大學(xué)，福州 350004

R382

：A

：1002-2694(2017)09-0789-04

2017-02-16編輯：張智芳

Supported by the Medical Innovation Funding of Fujian Province (No. 2012-CXB-12) and the Natural Science Foundation of Fujian (No. 2017J01139)