逄文慧，李園園，胡忠義，范 琳，趙陽國，崔振玲

DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2017.09.002

RNA恒溫擴(kuò)增實時檢測技術(shù)快速鑒定偶發(fā)分枝桿菌的研究

逄文慧1,2，李園園2，胡忠義2，范 琳2，趙陽國1，崔振玲2

目的建立RNA恒溫擴(kuò)增實時檢測技術(shù)快速鑒定偶發(fā)分枝桿菌(RIARD-MF)的方法，評估其在鑒定分枝桿菌臨床分離株中的應(yīng)用效果。方法將偶發(fā)分枝桿菌的16S rRNA特異序列作為目的靶標(biāo)進(jìn)行檢測，設(shè)計含T7啟動子逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增引物和RNA探針，分別對5種非分枝桿菌細(xì)菌、20種分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株和259株臨床分枝桿菌分離株進(jìn)行42 ℃恒溫擴(kuò)增實時檢測，參考標(biāo)準(zhǔn)為PCR基因測序結(jié)果。結(jié)果RIARD-MF方法學(xué)檢測靈敏度可達(dá)60 CFU/mL。在25種細(xì)菌的RIARD-MF特異性檢測中：只有偶發(fā)分枝桿菌檢測結(jié)果為陽性，其余24種細(xì)菌均為陰性，與測序檢測結(jié)果一致。在檢測分枝桿菌臨床分離菌株時，RIARD-MF鑒定偶發(fā)分枝桿菌5株，其余為非偶發(fā)分枝桿菌，與測序結(jié)果一致，檢測靈敏度和特異度均為100%。結(jié)論RIARD-MF鑒定偶發(fā)分枝桿菌具有較高的特異度、靈敏度和準(zhǔn)確性，且檢測快速，有望成為一種新的偶發(fā)分枝桿菌臨床分離菌株鑒定方法。

RNA恒溫擴(kuò)增；鑒定；偶發(fā)分枝桿菌

偶發(fā)分枝桿菌(Mycobacteriumfortuitum)作為非結(jié)核分枝桿菌(nontuberculousmycobacteria，NTM)的一種，可存在于水、土壤、灰塵等自然環(huán)境中，并且因其對消毒劑及重金屬的耐受性使其能生存于飲水系統(tǒng)中。皮膚黏膜、呼吸道、胃腸道等都是偶發(fā)分枝桿菌可侵入人體的途徑，偶發(fā)分枝桿菌侵入人體后可引起無癥狀的感染，或引起肺部病變、消化道病變、皮膚軟組織病變、骨關(guān)節(jié)病變、淋巴結(jié)病變等。機(jī)體免疫功能低下者如AIDS患者還可能進(jìn)一步引起全身播散性的傳染病。近來醫(yī)源相關(guān)性偶發(fā)分枝桿感染菌病逐漸增多，如血液透析、靜脈導(dǎo)管相性血行感染、手術(shù)或注射部位的偶發(fā)分枝桿菌感染等。偶發(fā)分枝桿菌對傳統(tǒng)抗結(jié)核藥物高度耐藥，但對頭孢西丁、亞胺培南和阿奇霉素等抗生素敏感[1]。由于偶發(fā)分枝桿菌亦為抗酸陽性桿菌，僅根據(jù)抗酸涂片染色法易被誤判為結(jié)核分枝桿菌，而傳統(tǒng)的生化鑒定需要較長時間，因此，在診斷和治療NTM感染時，若能準(zhǔn)確快速地鑒定出偶發(fā)分枝桿菌，不僅對病人的快速康復(fù)有重大意義，同時又可增加對偶發(fā)分枝桿菌感染的流行病學(xué)研究。本研究建立了RNA恒溫擴(kuò)增實時檢測技術(shù)鑒定偶發(fā)分枝桿菌(RNA isothermal transcription-mediated amplification and real-time detection forMycobacteriumfortuitum，RIARD-MF)的方法，并評估了該方法檢測臨床分離株的應(yīng)用效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 呼吸道非分枝桿菌 由同濟(jì)大學(xué)附屬上海市肺科醫(yī)院檢驗科提供5種經(jīng)過16S rRNA測序鑒定的呼吸道非分枝桿菌，依次為：銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、綠膿假單胞菌(Pseudomonaspyocyaneum)、溶血性鏈球菌(Hemolyticstreptococcus)、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)、鮑曼不動桿菌(Acinetobacterbaumannii)。

1.1.2 分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株 來源于國家菌種保存中心的20種分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株，分別為：偶發(fā)分枝桿菌(M.fortuitum, ATCC6481)、結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv(M.tuberculosis, ATCC27294)、土分枝桿菌(M.terra, ATCC19619)、鳥分枝桿菌(M.avium, ATCC25291)、新金色分枝桿菌(M.neoaurum, ATCC25795)、田鼠分枝桿菌(M.microti, ATCC19422)、母牛分枝桿菌(M.vaccae, ATCC15483)、馬爾摩分枝桿菌(M.malmoense, ATCC29571)、瘰疬分枝桿菌(M.scrofulaceum, ATCC19981)、堪薩斯分枝桿菌(M.kansassi, ATCC12478)、金色分枝桿菌(M.aurum, ATCC23366)、龜分枝桿菌(M.chelonae, ATCC14472)、戈登分枝桿菌(M.gordonae, ATCC14470)、恥垢分枝桿菌(M.smegmatis, ATCC19420)、副偶發(fā)分枝桿菌(M.parafortuitum, ATCC19686)、愛知分枝桿菌(M.aichiense, ATCC27280)、淡黃分枝桿菌(M.gilvum, ATCC43909)、草分枝桿菌(M.phlei, ATCC11758)、不產(chǎn)色分枝桿菌(M.nonchromogenicum, ATCC19530)、胞內(nèi)分枝桿菌(M.intracellulare, ATCC13950)。

1.1.3 結(jié)核分枝桿菌臨床分離株 由同濟(jì)大學(xué)附屬上海市肺科醫(yī)院結(jié)核實驗室菌株庫提供的臨床結(jié)核分枝桿菌分離株43株和臨床NTM分離株216株。

1.1.4 實驗菌株的培養(yǎng) 20種分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株和259株臨床分枝桿菌分離株的培養(yǎng)采用Middlebrook 7H10培養(yǎng)基；溶血性鏈球菌接種于血平板培養(yǎng)基培養(yǎng)；其他4種呼吸道非分枝桿菌接種于麥康凱培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 RIARD-MF法的建立 RIARD-MF鑒定偶發(fā)分枝桿菌的方法參考李園園[2-4]等采用RNA恒溫擴(kuò)增實時檢測技術(shù)鑒別胞內(nèi)分枝桿菌和鳥分枝桿菌的方法。將偶發(fā)分枝桿菌的16S rRNA特異序列作為目的靶標(biāo)，設(shè)計逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增引物(含T7啟動子)和RNA探針，建立偶發(fā)分枝桿菌RNA恒溫擴(kuò)增體系。RNA探針的序列(5′→3′)：CGUGGACCACGCGCUUCACCACG，F(xiàn)AM標(biāo)記探針的5′端，DABCYL標(biāo)記探針的3′端，由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成；上、下游引物的序列(5′→3′)：TTCTAAGCCTGGGAAA和AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACCAACAAGCT GATAGGC，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。用DEPC處理過的無菌H2O配制成10 mmol/L檸檬酸鈉(pH 8.0)，作為樣本稀釋液。收集培養(yǎng)至對數(shù)期的待檢菌株的陽性培養(yǎng)物，用生理鹽水將其比濁至1 mg/mL，取1 mL菌懸液，以13 000 r/min于Eppendorf 5418型常溫離心機(jī)離心5 min，棄除上清液，加入樣本稀釋液50 μL進(jìn)行吹打重懸，重懸液放入超聲核酸提取儀(購自上海仁度生物科技有限公司)中超聲處理15 min。配制擴(kuò)增檢測液：pH 8.1 Tris-HCl緩沖液40 mmol/L，氯化鈉25 mmol/L，氯化鎂8 mmol/L，二硫蘇糖醇5 mmol/L，亞精胺2 mmol/L，牛血清白蛋白80 μg/mL，dATP、dCTP、dGTP和dTTP各0.2 mmol/L，ATP、CTP、GTP和 UTP各1 mmol/L，探針和上游、下游引物終濃度均為0.5 mmol/L，總體積30 μL。處理待檢菌株時，將活的偶發(fā)分枝桿菌作為陽性對照，無菌水作為陰性對照進(jìn)行同步處理。超聲處理后，吸取樣本2 μL，加入擴(kuò)增檢測液中，于PCR儀上運行程序：60 ℃ 10 min，42 ℃ 5 min，同時42 ℃預(yù)熱酶液(含T7 RNA轉(zhuǎn)錄酶和M-MLV各2 000 U)。預(yù)熱結(jié)束后，向反應(yīng)體系中加入10 μL酶液，混勻后立刻放入實時熒光定量PCR儀中，運行程序：42 ℃ 1 min × 40 cycle；熒光信號收集：1次/min(共40次)，通道為FAM。檢測時間為閾值線與樣本曲線交點的橫坐標(biāo)，擴(kuò)增陽性樣本為檢測時間在40 min內(nèi)的。RNA恒溫擴(kuò)增曲線結(jié)果為陽性的判定為偶發(fā)分枝桿菌；擴(kuò)增曲線結(jié)果為陰性的判定為非偶發(fā)分枝桿菌。全程檢測時間約2 h。檢測試劑購自上海仁度生物科技有限公司。

1.2.2 RIARD-MF靈敏度檢測 準(zhǔn)備透明玻璃磨菌瓶，加入玻璃磨菌珠蓋過玻璃管底，加入適量的生理鹽水，刮取生長于Middlebrook 7H10培養(yǎng)基上的偶發(fā)分枝桿菌至生理鹽水中，擰緊磨菌瓶，于渦旋振蕩器上震蕩磨菌，磨勻后，采用BD PhoenixSpec Nephelometer 440910比濁儀(購自美國碧迪公司)繼續(xù)用生理鹽水將菌液濁度比濁至1 mg/mL。此后用生理鹽水進(jìn)行10倍倍比梯度稀釋，稀釋濃度分別為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9mg/mL，采用RIARD-MF法對每個稀釋梯度的菌懸液進(jìn)行檢測，另在Middlebrook 7H10培養(yǎng)基上進(jìn)行接種，接種量為每個稀釋梯度菌懸液100 μL，于37 ℃隔水式恒溫培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)2至4周后，記錄菌落生長數(shù)。

1.2.3 RIARD-MF特異度檢測 將20種分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株和5種呼吸道非分枝桿菌培養(yǎng)至對數(shù)期，分別收集它們的陽性培養(yǎng)物，并按上述方法磨菌比濁至濁度為1 mg/mL，采用RIARD-MF法分別對其進(jìn)行檢測。

1.2.4 RIARD-MF法鑒別臨床分枝桿菌分離株 將259株臨床分枝桿菌分離株進(jìn)行培養(yǎng)，采用RIARD-MF法分別檢測其陽性培養(yǎng)物。

1.2.5 PCR基因測序 對待檢測臨床分離菌株的hsp65及16S rRNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增并完成基因測序，擴(kuò)增hsp65基因上游引物序列(5′→3′)：ATCGCCAAGGAGATCGAGCT，下游引物序列(5′→3′)：AAGGTGCCGCGGATCTTGTT[5]；擴(kuò)增16S rRNA基因上游引物序列(5′→3′)：TGGAGAGTTTGATCCTGGCTCAG，下游引物序列(5′→3′)：TACCGCGGCTGCTGGCAC[6]。反應(yīng)體系的配制按照PrimeStar PCR反應(yīng)試劑盒說明，模板DNA量為10 ng，上游、下游引物的濃度皆為0.5 μmol/L。反應(yīng)程序：98 ℃ 10 s，hsp65基因退火溫度：61 ℃ 10 s；16S rRNA基因退火溫度：60 ℃ 10 s，72 ℃ 45 s，× 30 cycle。反應(yīng)結(jié)束后，通過瓊脂糖凝膠對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，擴(kuò)增成功的PCR產(chǎn)物送華大基因進(jìn)行基因測序。經(jīng)Blast在線比對對測序結(jié)果進(jìn)行同源性分析，以此鑒別出不同菌種。

2 結(jié) 果

2.1 RIARD-MF靈敏度檢測結(jié)果 RIARD-MF檢測偶發(fā)分枝桿菌的梯度稀釋液結(jié)果顯示，當(dāng)菌液濃度≥1×10-5mg/mL時，樣本檢測為陽性。在接種了100 μL 1×10-5mg/mL濃度菌懸液的Middlebrook 7H10培養(yǎng)基中，其菌落生長數(shù)平均為6個，故靈敏度可達(dá)60 CFU/mL(見圖1)。

1:1 mg/mL; 2: 10-1 mg/mL; 3: 10-2 mg/mL; 4: 10-3 mg/mL; 5: 10-4 mg/mL; 6: 10-5 mg/mL; 7: 10-6, 10-7, 10-8, 10-9 mg/mL and negative control.圖1 RIARD-MF檢測偶發(fā)分枝桿菌靈敏度檢測圖Fig.1 Sensitivity of RIARD-MF on identification and detection for M. fortuitum

2.2 RIARD-MF法特異度檢測結(jié)果 5種非分枝桿菌和20種分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株的檢測結(jié)果如下：只有偶發(fā)分枝桿菌陽性，其他細(xì)菌均為陰性，特異度可達(dá)100%(見圖2)。

1: M. fortuitum; 2: the other 19 species of Mycobacterium except for M. fortuitum and 5 species of non-Mycobacterium.圖2 RIARD-MF檢測偶發(fā)分枝桿菌特異度檢測圖Fig.2 Specificity of RIARD-MF on identification and detection for M. fortuitum

2.3 RIARD-MF鑒定分枝桿菌臨床分離株結(jié)果 對259株臨床分離菌株進(jìn)行RIARD-MF檢測，結(jié)果顯示：5株為偶發(fā)分枝桿菌，其他254株分枝桿菌檢測為陰性。對檢測結(jié)果為陽性的5株進(jìn)行PCR基因測序，結(jié)果表明其為偶發(fā)分枝桿菌，其余254株P(guān)CR基因測序鑒定結(jié)果如下：82株胞內(nèi)分枝桿菌，7株戈登分枝桿菌，43株結(jié)核分枝桿菌，21株馬賽分枝桿菌，8株鳥分枝桿菌，53株膿腫分枝桿菌，13株金色分枝桿菌，5株海分枝桿菌，4株堪薩斯分枝桿菌，副偶發(fā)分枝桿菌M.colombiense、M.marseillense和M.bolletii各兩株，中庸分枝桿菌、外來分枝桿菌、土分枝桿菌、慢性黃分枝桿菌、M.kumamotonense、M.engbekii、M.algericum、瘰疬分枝桿菌、龜分枝桿菌、恥垢分枝桿菌各1株。以PCR基因測序的結(jié)果作為參考標(biāo)準(zhǔn)，對RIARD-MF法檢測偶發(fā)分枝桿菌的特異度、靈敏度、陽性及陰性預(yù)測值分別進(jìn)行計算，結(jié)果依次為100%(254/254)、100%(5/5)、100%(5/5)、100%(254/254)，kappa值為1(表1)。

表1 259株分枝桿菌RIARD-MF鑒定結(jié)果
Tab.1 RIARD-MF identification and detection of 259 mycobacterial strains

RIARD-MF基因測序Genesequencing偶發(fā)分枝桿菌M.fortuitum其他分枝桿菌Othermycobacteria偶發(fā)分枝桿菌M.fortuitum50其他分枝桿菌Othermycobacteria0254

3 討 論

偶發(fā)分枝桿菌屬于常見的致病性NTM[7]，1938年由Costa Cruz命名，我國首次報道偶發(fā)分枝桿菌是由該菌引起的敗血癥[8]。近年來全球感染偶發(fā)分枝桿菌的病例報道逐漸增加[9]。Hadjiliadis[10]等報道的20例老年NTM患者當(dāng)中，有14例為偶發(fā)分枝桿菌引起的肺炎。Esteban[11]等報道了在馬德里地區(qū)的28例NTM感染病例中，偶發(fā)分枝桿菌感染患者占10例。Lai[12]等報道了2000年至2008年臺灣地區(qū)的偶發(fā)分枝桿菌在致病的NTM中占13.0%，僅次于胞內(nèi)分枝桿菌和膿腫分枝桿菌。Umrao[13]等對2013年至2015年間的263株臨床分離NTM的鑒定顯示，偶發(fā)分枝桿菌占22%，所占比例僅次于第一位的膿腫分枝桿菌。據(jù)估計至今每一百萬人之間，就有4到6例偶發(fā)分枝桿菌感染患者[14]。偶發(fā)分枝桿菌可以引起皮膚感染、肺部病變、淋巴結(jié)炎和眼部感染[15]，此外它還趨向侵犯醫(yī)源性創(chuàng)傷或注射部位而引起的院內(nèi)感染。1998年福建省南平市樟湖鎮(zhèn)某診所由于醫(yī)療器具消毒不嚴(yán)格導(dǎo)致暴發(fā)偶發(fā)分支桿菌感染59例[16]。偶發(fā)分枝桿菌感染已成為一種重要的NTM感染疾病，因此，快速并準(zhǔn)確的菌種鑒定對早期診斷偶發(fā)分枝桿菌疾病、正確指導(dǎo)臨床用藥和流行情況監(jiān)測具有重要意義。

在傳統(tǒng)的生化鑒定NTM的方法中，偶發(fā)分枝桿菌在芳基硫酸酯酶試驗、鐵的吸收試驗和NaCl的耐受性試驗中均呈陽性反應(yīng)，但是生化檢測方法繁瑣復(fù)雜、耗時，并且試驗結(jié)果只能說明偶發(fā)分枝桿菌的一些表型特性，并不能精確區(qū)分NTM的種類。分枝菌酸的高效液相色譜法雖然能在一次試驗中快速準(zhǔn)確的鑒定偶發(fā)分枝桿菌，但是所需設(shè)備較昂貴不易普及[17-19]。PCR和限制性內(nèi)切酶分析(PCR and restriction endonuclease analysis，PRA)雖能快速鑒定偶發(fā)分枝桿菌，但其操作過程較為復(fù)雜[19]。以DNA為檢測靶標(biāo)的NTM分子鑒定方法多數(shù)需通過PCR儀擴(kuò)增后進(jìn)行檢測[20-24]，不恰當(dāng)?shù)牟僮魅菀自趯嶒炇覂?nèi)引發(fā)交叉污染，導(dǎo)致假陽性結(jié)果的產(chǎn)生，使得臨床相關(guān)性變差；此外對于作為分子檢測金標(biāo)準(zhǔn)的PCR基因測序，在檢測含有混合菌株的臨床標(biāo)本時，其基因測序結(jié)果存在一定的不準(zhǔn)確性，因此要獲得準(zhǔn)確的鑒定結(jié)果需要運用特異性探針的方法來檢測。

RIARD技術(shù)是一項以RNA為檢測靶標(biāo)的新技術(shù)，針對活的分枝桿菌進(jìn)行檢測，不受死菌的干擾，且其特異度和靈敏度都較高，操作簡便。使用該技術(shù)檢測臨床痰標(biāo)本中的結(jié)核分枝桿菌其檢測靈敏度和特異度分別為94.8%和97.5%[25]；檢測臨床分離株中的鳥分枝桿菌靈敏度和特異度均為100%[2]。RIARD技術(shù)不但擁有同DNA核酸分子檢測技術(shù)相同的高特異度和高靈敏度的特點，其還具有反應(yīng)穩(wěn)定且低污染的優(yōu)勢，因此該技術(shù)被應(yīng)用于多種病原體的檢測。

本研究運用RIARD技術(shù)，將偶發(fā)分枝桿菌的16S rRNA特異序列作為檢測靶標(biāo)，構(gòu)建RIARD檢測鑒定偶發(fā)分枝桿菌的檢測體系。方法學(xué)研究顯示，RIARD-MF具有較高的檢測靈敏度，可以檢測到樣本中較低濃度的偶發(fā)分枝桿菌活菌；能夠特異的區(qū)分偶發(fā)分枝桿菌和其他19種分枝桿菌以及呼吸道常見致病普通細(xì)菌，顯示出較該方法具有非常高的特異度。在259株臨床分離株的初步驗證評估中，鑒定偶發(fā)分枝桿菌的靈敏度和特異度均可達(dá)100%，顯示出該方法用于臨床分離株中偶發(fā)分枝桿菌快速檢測鑒定的優(yōu)勢?；谠摲椒ㄝ^高的方法學(xué)靈敏度也提示該方法可通過進(jìn)一步的研究優(yōu)化，有望用于臨床樣本中偶發(fā)分枝桿菌的直接檢測。

本研究建立的RIARD-MF方法，其檢測準(zhǔn)確、快速，用一般實驗室常規(guī)配備的實時定量PCR儀即可進(jìn)行檢測。該方法具有直接應(yīng)用到臨床分離株中的偶發(fā)分枝桿菌鑒定的檢測潛力，有望成為一種新型鑒定偶發(fā)分枝桿菌的分子鑒定方法。

[1] Tang SJ, Gao W. Clinical tuberculosis[M]. Beijing: People’s Medical Publishing House, 2011: 700-706. (in Chinese)

唐神結(jié), 高文. 臨床結(jié)核病學(xué)[M]. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2011: 700-706.

[2] Li YY, Lu JM, Cheng S, et al. Analysis and identification forMycobacteriumaviumwith real-time isothermal transcription-mediated RNA amplification assay[J]. Chin J Clinical Lab Sci, 2013, 31(09): 641-644. (in Chinese)

李園園, 陸俊梅, 程松, 等. RNA恒溫擴(kuò)增實時檢測技術(shù)快速鑒定鳥分枝桿菌[J]. 臨床檢驗雜志. 2013, 31(09): 641-644.

[3] Li YY, Cheng S, Lu JM, et al. RNA isothermal transcription-mediated amplification and real-time detection combined melt curve analysis for the identification ofMycobacteriumintracellulare[J]. Chin J Zoonoses, 2014, 30(01): 58-62. DOI: 10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2014.01.013 (in Chinese)

李園園, 程松, 陸俊梅, 等. RNA恒溫擴(kuò)增聯(lián)合熔解曲線分析鑒定胞內(nèi)分枝桿菌的應(yīng)用研究[J]. 中國人獸共患病學(xué)報. 2014, 30(01): 58-62.

[4] Li YY. Evaluation of the isothermal RNA amplification assay for common pathogenesis nontuberculousMycobacterium[D]. Suzhou: Soochow University, 2014. (in Chinese)

李園園. RNA恒溫擴(kuò)增實時檢測技術(shù)鑒定常見致病非結(jié)核分枝桿菌研究[D]. 蘇州: 蘇州大學(xué), 2014.

[5] Mcnabb A, Eisler D, Adie K, et al. Assessment of partial sequencing of the 65-kilodalton heat shock protein gene(hsp65) for routine identification ofMycobacteriumspecies isolated from clinical sources[J]. J Clin Microbiol, 2004, 42(07): 3000-3011. DOI: 10.1128/JCM.42.7.3000-3011.2004

[6] Hall L, Doerr KA, Wohlfiel SL, et al. Evaluation of the MicroSeq system for identification of mycobacteria by 16S ribosomal DNA sequencing and its integration into a routine clinical mycobacteriology laboratory[J]. J Clin Microbiol, 2003, 41(04): 1447-1453.

[7] Guan QH, Qian AD. New report of non-tuberculous mycobacteria clinical isolates[J]. Chin J Zoonoses, 2016, 32(07): 651-658. DOI: 10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2016.07.012 (in Chinese)

管清華, 錢愛東. 新報道非結(jié)核分枝桿菌臨床分離株[J]. 中國人獸共患病學(xué)報. 2016, 32(07): 651-658. DOI: 10. 3969/cjz. j. issn. 1002-2694. 2016. 07. 012

[8] Hou XN, Su YX, Hu MF, et a1. A case ofMycobacteriumtuberculosis[J]. Chin J Lab Med, 1994, 17(05): 315. (in Chinese)

侯曉娜,蘇躍新,胡明芬,等. 偶發(fā)分枝桿菌敗血癥一例[J]. 中華醫(yī)學(xué)檢驗雜志,1994, 7(05): 315.

[9] Huang LH, Wang DC,Zhu ZY. The infection and research progress ofMycobacteriumfortuitum[J]. Foreign Med Sci, 2001, 22(03): 148-149. (in Chinese)

黃梁滸, 王德春, 朱忠勇. 偶發(fā)分枝桿菌的感染與實驗研究進(jìn)展[J]. 國外醫(yī)學(xué)，2001, 22(03): 148-149.

[10] Hadjiliadis D, Adlakha A, Prakash UB. Rapidly growing mycobacterial lung infection in association with esophageal disorders[J]. Mayo Clin Proc, 1999, 74(01): 45-51.

[11] Esteban J, Gutierrez F, Farina MC, et al. Clinical significance of the isolation of rapidly growing mycobacteria[J]. Enferm Infect Microbiol Clin, 1997, 15(05): 260-263.

[12] Lai CC, Tan CK, Chou CH, et al. Increasing incidence of nontuberculous mycobacteria, Taiwan, 2000-2008[J]. Emerg Infect Dis, 2010, 16(02): 294-296. DOI: 10.3201/eid1602.090675

[13] Umrao J, Singh D, Zia A, et al. Prevalence and species spectrum of both pulmonary and extrapulmonary nontuberculousMycobacteriaisolates at a tertiary care center[J]. Int J Mycobacteriol, 2016, 5(03): 288-293. DOI: 10.1016/j.ijmyco.2016.06.008

[14] Chandanwale SS, Gulati I, Baravkar DS, et al. Multiple lumps in the breast due toMycobacteriumfortuitum[J]. Indian J Tuberc, 2016, 63(02): 126-129. DOI: 10.1016/j.ijtb.2015.07.016[15] Xiao HP. Guidelines for the diagnosis and treatment ofnontuberculousmycobacteria[J]. Chin J Tuberculosis Respir Dis, 2000, 23(11): 650-653. (in Chinese)

肖和平. 非結(jié)核分支桿菌病診斷與處理指南[J]. 中華結(jié)核和呼吸雜志,2000, 23(11): 8-11.

[16] Han MQ, Yu YH, Huang JS, et al. Histopathologic characteristics ofmycobacteriumfortuituminfection[J]. Chin J Diagnostic Pathol, 2000, 7(01): 10-11. (in Chinese)

韓明其,余英豪,黃金生,等.偶發(fā)分枝桿菌感染的組織病理學(xué)特征[J].診斷病理學(xué)雜志,2000, 7(01): 15-16.

[17] Brown BA, Springer B, Steingrube VA, et al.Mycobacteriumwolinskyisp. nov. andMycobacteriumgoodiisp. nov., two new rapidly growing species related toMycobacteriumsmegmatisand associated with human wound infections: a cooperative study from the International Working Group onMycobacterialtaxonomy[J]. Int J Syst Bacteriol, 1999, 49: 1493-1511.

[18] Butler WR, Jost KC, Kilburn JO. Identification of mycobacteria by high-performance liquid chromatography[J]. J Clin Microbiol, 1991, 29(11): 2468-2472.

[19] Murray PR, Baron EJ, Pfaller MA, et al. Manual of clinical microbiology[M]. Washington: ASM Press, 2003: 560-578.

[20] Zhang X, Cai J, Jiang Y, et al. Species identification on 43 clinical non-tuberculosisMycobacteriaisolates from Gansu Province, China[J]. Chin J Zoonoses, 2017, 33(02): 173-177. DOI: 10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2017.02.015 (in Chinese)

張鑫, 蔡靜 ,姜元, 等. 43株甘肅臨床分離非結(jié)核分枝桿菌分類鑒定[J]. 中國人獸共患病學(xué)報,2017, 33(02): 173-177. DOI: 10. 3969/cjz. j. issn. 1002-2694. 2017.02.015

[21] Escobar-Escamilla N, Ramírez-González JE, González-Villa M, et al. Hsp65 phylogenetic assay for molecular diagnosis of nontuberculousMycobacteriaisolated in Mexico[J]. Arch Med Res, 2014, 45(01): 90-97. DOI: 10.1016/j.arcmed.2013.12.004

[22] Lima AS, Duarte RS, Montenegro LM, et al. Rapid detection and differentiation of mycobacterial species using a multiplex PCR system[J]. Rev Soc Bras Med Trop, 2013, 46(04): 447-452. DOI: 10. 1590/0037-8682-0097-2013

[23] Liu LL, Chen SJ, Long H, et al. Establishment of multiplex PCR method for rapid detection of nontuberculousMycobacteriumsinfection in the hand[J]. Natl Med J Chin, 2016, 96(14): 1116-1119.

[24] Lian LL, Jiang Y, Zhao XQ, et al. Identification of 44 suspicious clinical isolates of non-tuberculosisMycobacteriain Gansu, China[J]. Chin J Zoonoses, 2013, 29(04): 343-348. DOI: 10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2013.04.006 (in Chinese)

連璐璐, 姜元, 趙秀芹, 等. 44株甘肅疑似非結(jié)核分枝桿菌臨床分離株的菌種鑒定[J]. 中國人獸共患病學(xué)報. 2013, 29(04): 343-348. DOI: 10. 3969/cjz. j. issn. 1002-2694. 2013.04.006

[25] Cui ZL, Sha W, Huang XC, et al. Application of SAT technology in rapid detection ofMycobacteriumtuberculosisin sputum[C]. Proceedings of National Academic Conference of Chinese Antituberculosis Association in 2011,2011: 309-310. (in Chinese)

崔振玲, 沙巍, 黃曉辰, 等. SAT技術(shù)在快速檢測痰液的結(jié)核分枝桿菌中的應(yīng)用[C].2011年中國防癆協(xié)會全國學(xué)術(shù)會議論文集. 2011: 309-310.

RapididentificationforMycobacteriumfortuitumwithRNAisothermaltranscription-mediatedamplificationandreal-timedetectionassay

PANG Wen-hui1,2, LI Yuan-yuan2, HU Zhong-yi2, FAN Lin2, ZHAO Yang-guo1, CUI Zhen-ling2

(1.SchoolofEnvironmentalScienceandEngineering,OceanUniversityofChina,Qingdao266100,China; 2.ShanghaiKeyLaboratoryofTuberculosis,ShanghaiPulmonaryHospital,TongjiUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200433,China)

The aim of the study is to establish and evaluate a RNA isothermal transcription-mediated amplification and real-time detection assay (RIARD-MF) for the identification ofMycobacteriumfortuitumin clinical isolates. RNA probes and specific primers of reverse transcription and amplification for T7 promoter were designed based on the sequence ofM.fortuitum16S rRNA. The isothermal successive cycles of amplification were performed for real-time detection by using T7 RNA polymerase at 42 ℃. Five non-mycobacteriumstrains, 20Mycobacteriumstrains and 259 clinical strains were detected by the established assay to evaluate the specificity and sensitivity, and the results were compared with those of PCR sequencing. In the test of 5 non-mycobacteriumstrains and 20Mycobacteriumstrains, onlyM.fortuitumwas positive, and the remaining 24 strains of bacteria were negative, which was consistent with PCR gene sequencing. The sensitivity and specificity of RIARD-MF reached 60 CFU/mL and 100%. In the test of 259 strains of clinical isolates, 5 strains were identified to beM.fortuitum, the remaining 254 strains were not identified to beM.Fortuitum, which was also consistent with PCR gene sequencing. Both the specificity and sensitivity reached up to 100% in the detection of clinical isolates. It suggested that the RIARD-MF established in this study is a specific, sensitive, accurate and rapid method for the identification ofM.Fortuitumand it may be hopeful for rapid identification ofM.fortuitumin clinical isolates.

RNA isothermal amplification; identification;MycobacteriumfortuitumFunded by the National Twelfth Five-year Major Subject of Infectious Diseases (No. 2013ZX10003001-003) and the Shanghai Municipal Natural Science Foundation (No. 17ZR1423400)

Cui Zhen-ling, Email:cuizhenling@163.com

國家十二五傳染病重大專項課題 (2013ZX10003001-003)；上海市自然基金課題(17ZR1423400)

崔振玲，Email: cuizhenling@163.com

1.中國海洋大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，青島 266100； 2.同濟(jì)大學(xué)附屬上海市肺科醫(yī)院/上海市結(jié)核病(肺)重點實驗室，上海 200433

R378.91

：A

：1002-2694(2017)09-0763-05

2017-02-23編輯：張智芳