陳 煒，翁育偉，何文祥，朱 穎，黃 萌，張擁軍，謝劍鋒，鄭奎城，嚴(yán)延生

DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2017.09.003

2011-2014年福建省手足口病相關(guān)病原柯薩奇病毒A組4型的分子流行病學(xué)分析

陳 煒，翁育偉，何文祥，朱 穎，黃 萌，張擁軍，謝劍鋒，鄭奎城，嚴(yán)延生

目的分析福建省手足口病患者中柯薩奇病毒A組4型(Coxsackievirus A4, CVA4)的流行病學(xué)、基因變異及遺傳進(jìn)化等特征。方法應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)方法獲得病毒分離株，RT-PCR方法進(jìn)行分子分型及擴(kuò)增CVA4血清型完整VP1區(qū)全長序列，并進(jìn)行序列變異及遺傳進(jìn)化分析。結(jié)果2011-2014年，從福建省手足口病其它腸道病毒病例標(biāo)本中分子分型33例CVA4病例，在407例的其它腸道病毒病例中的構(gòu)成比為8.1%，其中2012年31例，2014年2例。CVA4病例在性別、年齡組分布特征，與一般手足口病流行特征相比，沒有特異性。VP1區(qū)序列差異比較表明，2011-2014年福建省CVA4分離株之間VP1核苷酸及氨基酸序列相似性分別在92.6%～100%、95.7%～100%；與原型株及國外地方株的核苷酸序列相似性較低，分別為 83.7%～85.4%、82.1%～89.1%，氨基酸序列相似性分別為96.1%～99.0%、90.4%～99.6%；與國內(nèi)地方株核苷酸及氨基酸序列相似性較高，分別為87.9%～99.2%、96.1%～100%。進(jìn)化樹結(jié)果表明福建CVA4分離株與原型株及國外代表株的遺傳距離遠(yuǎn)，與國內(nèi)代表株的遺傳距離近。福建CVA4分離株在進(jìn)化樹的分布呈多個(gè)分支。結(jié)論CVA4已成為近年來福建省除EV71、CVA16、CVA6、CVA10外導(dǎo)致手足口病的又一重要病原體。福建CVA4分離株與國內(nèi)地方株同進(jìn)化共循環(huán)，在福建省各個(gè)地區(qū)同時(shí)流行多條親緣關(guān)系接近的傳播鏈。

手足口病；柯薩奇病毒A4；分子流行病學(xué)

手足口病(Hand, foot and mouth disease, HFMD)是由多種型別腸道病毒感染引起的5歲以下患兒常見傳染病，除腸道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)及柯薩奇病毒16型(Coxsackievirus A 16,CVA16)作為主要病原體外，其它腸道病毒在病原譜構(gòu)成中也占有部分比例[1-4]。

2008年5月份，手足口病被列入我國丙類法定傳染病進(jìn)行疫情網(wǎng)絡(luò)直報(bào)。福建省手足口病疫情網(wǎng)絡(luò)直報(bào)系統(tǒng)顯示，2008-2010年，EV71與CVA16的感染是福建省手足口病的主要病原體，而最近幾年其它腸道病毒在病原譜中的構(gòu)成比例上升顯著。但是目前國家手足口病監(jiān)測方案要求在開展手足口病病原學(xué)檢測項(xiàng)目中，只對總腸道病毒、EV71和CVA16進(jìn)行檢測，未進(jìn)一步分型鑒定其它腸道病毒。本研究在對福建省2011-2014年手足口病其它腸道病毒專項(xiàng)分型鑒定研究中，發(fā)現(xiàn)33例柯薩奇病毒A4(CVA4)感染病例，次于柯薩奇病毒A6(CVA6)柯薩奇病毒A10(CVA10)。本文對福建省2011-2014年手足口病相關(guān)病原CVA4開展流行病學(xué)、基因變異及遺傳進(jìn)化等分子流行病學(xué)特征進(jìn)行調(diào)查研究。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本 來源于2011-2014年福建省福州、泉州、漳州、寧德、龍巖、南平等地區(qū)按照福建省手足口病監(jiān)測實(shí)施方案要求上送至福建省疾病預(yù)防控制中心的其它腸道病毒手足口病標(biāo)本(咽拭子、糞便等)，合計(jì)1 525例其它腸道病毒手足口病病例(2011-2014年分別為268例、622例、450例、182例)。

1.2 病毒分離培養(yǎng) 按照《手足口病實(shí)驗(yàn)室手冊》[5]方法和標(biāo)準(zhǔn)對標(biāo)本分別用人橫紋肌肉瘤細(xì)胞(Human Rhabdomyosarcoma, RD)和人喉癌上皮細(xì)胞(Human Laryngeal Carcinoma，HEp-2進(jìn)行兩代分離培養(yǎng)，收獲細(xì)胞培養(yǎng)上清。RD細(xì)胞和HEp-2細(xì)胞均由中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所脊髓灰質(zhì)炎實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 RNA提取 使用QIAamp viral RNA mini kit(QIAGEN, Germany)試劑盒提取病毒的RNA，從140 μL的細(xì)胞培養(yǎng)上清中獲得50 μL的總RNA溶液，提取的RNA保存在-20 ℃待用。

1.4 分子分型 上述RNA樣本采用One step RT-PCR Kit(QIAGEN, Germany)試劑盒和應(yīng)用腸道病毒通用引物PE1/PE2[5]進(jìn)行進(jìn)行腸道病毒篩查。一步法RT-PCR反應(yīng)體系配置參照試劑盒說明書。擴(kuò)增反應(yīng)程序與關(guān)于CVA6、CVA10的報(bào)道[8-9]一致。得到的RT-PCR產(chǎn)物取5μL經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后觀察。

腸道病毒篩查陽性的病例標(biāo)本采用Access one step RT-PCR Kit (Promega, USA)試劑盒和應(yīng)用292/222引物[6]進(jìn)行一步法RT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系參照試劑盒說明書。擴(kuò)增反應(yīng)程序與關(guān)于CVA6、CVA10報(bào)道[8-9]一致。取5 μL RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后觀察，陽性產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化測序，得到的序列應(yīng)用http://www.rivm.nl/mpf/enterovirus/typingtool網(wǎng)站進(jìn)行病毒血清型別的分型確定。

1.5 完整VP1區(qū)基因序列的獲取 血清型別為CVA4的病例標(biāo)本使用One step RT-PCR Kit(QIAGEN, Germany)試劑盒和應(yīng)用引物486/488, 487/489[7]分段擴(kuò)增整個(gè)VP1區(qū)基因。擴(kuò)增反應(yīng)程序參照關(guān)于CVA6、CVA10的報(bào)道[8-9]。取5 μL RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后觀察，陽性產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化測序。

1.6 生物信息學(xué)分析 采用DNASTAR軟件對CVA4型病毒進(jìn)行核苷酸與氨基酸序列分析及同源性比較，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹采用Mega 6.0軟件的鄰接法(Neighbor-Joining)方式。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況 共收集了福建省2011-2014年1 525例病例的其它腸道病毒標(biāo)本(絕大部分為咽拭子，極少數(shù)為肛拭子)，上述標(biāo)本分別經(jīng)過兩種細(xì)胞(RD/Hep-2細(xì)胞)兩代次的細(xì)胞分離培養(yǎng)及分子分型鑒定，共獲得407例其它腸道病毒病例毒株，其中33例鑒定為柯薩奇病毒A4(CVA4)，為8.1%，次于柯薩奇病毒A6(CVA6)，為48.9%(199例)和柯薩奇病毒A10(CVA10)，為25.3%(103例)。

2.2 CVA4流行病學(xué)特征

2.2.1 時(shí)間分布 2011-2014年33例CVA4病例主要分布在2012年(31例)和2014年(2例)，2011年及2013年未檢測到CVA4病例。2012年的31例CVA4病例分別分布在4月份(6例)、5月份(12例)、6月份(8例)、8月份(2例)、9月份(3例)

2.2.2 地區(qū)分布 2012年的31例 CVA4病例分別分布在寧德(16例)，漳州(7例)，南平(6例)，福州(2例)；2014年2例分別分布在福州和南平地區(qū)。

2.2.3 人群分布

2.2.3.1 性別分布分析，33例的CVA4手足口病病例中，21例男性患者，12例女性患者，男女性別比為1.75∶1，而2008-2014年福建省手足口病總體疫情中的男女病例性別比約為1.7∶1(342 708 /202 172)，兩者之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=0.01,P=0.93>0.05)。

2.2.3.2 年齡組分布 根據(jù)0歲組、1歲組、2歲組、3歲組、4歲組、5歲組及以上6個(gè)年齡組進(jìn)行分組，2011-2014年福建省33例CVA4手足口病病例的年齡組分布與手足口病總體病例的年齡組分布相似，主要分布于4歲組及以下年齡的幼兒，占97.0%(32/33)，而福建省2008-2014年手足病總體病例中4歲組及以下患兒的構(gòu)成比為94.3%(514 000/544 880)，兩者之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=0.08,P=0.78>0.05)。

2.2.4 病例類型分布 按照疾病嚴(yán)重程度分類，2011-2014年福建省33例CVA4手足口病病例中，30例普通病例，3例重癥病例，無死亡病例。CVA4感染導(dǎo)致重癥和死亡的頻率為9.1%(3/33)，而2008-2014年福建省手足口病實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測數(shù)據(jù)得到的EV71感染導(dǎo)致重癥和死亡的頻率為16.3%(1 376/8 449)，兩者之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=1.25,P=0.26>0.05)；與CVA16感染導(dǎo)致重癥和死亡的頻率(3.2%，115/3 630)相比，也無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=2.03,P=0.16>0.05)。

2.3 VP1區(qū)核苷酸及編碼氨基酸序列分析 對2011-2014年福建省33株CVA4病毒株分兩段RT-PCR擴(kuò)增完整VP1區(qū)后測序拼接，得到24株CVA4毒株(其中2012年22株，2014年2株)的完整VP1區(qū)核苷酸序列，長度為915個(gè)堿基，與原型株(CVA4-High Point)相比，未發(fā)現(xiàn)核苷酸的缺失和插入。

2011-2014年福建省的24株CVA4分離株之間的VP1核苷酸序列相似性在92.6%～100%之間，氨基酸序列相似性在95.7%～100%之間。與原型株(CVA4-High Point)的核苷酸序列相似性在83.7%～85.4%之間，氨基酸序列相似性在96.1%～99.0%之間。與1999-2014年國外美國、俄羅斯、印度、日本、肯尼亞等地方分離株的VP1核苷酸序列相似性在82.1%～89.1%之間，氨基酸序列相似性在90.4%～99.6%之間。與1998-2014年的國內(nèi)吉林、山東、安徽、寧夏、重慶、湖南、上海、廣東、云南等地方分離株的VP1核苷酸序列相似性在87.9%～99.2%之間，氨基酸序列相似性在96.1%～100%之間。

將VP1完整編碼區(qū)翻譯成氨基酸序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)2011-2014年福建省的24株CVA4分離株氨基酸序列的第18、34、44、200、281和304位置，是氨基酸變異的頻繁區(qū)域，詳見圖1。

圖1 福建省CVA4病毒分離株VP1區(qū)氨基酸序列差異Fig.1 Amino acid sequence differences in VP1 regions of Fujian CVA4 viruses

2.4 遺傳進(jìn)化分析 采用Mega 6.0軟件，以鄰接法(Neighbor-Joining)方式，選取CVA16原型株為外群，基于VP1區(qū)基因，將福建省2011-2014年24株CVA4地方分離株與從GenBank檢索的50株國內(nèi)外CVA4型代表株構(gòu)建CVA4種系進(jìn)化樹(圖2)。遺傳進(jìn)化分析顯示，福建省2011-2014年24株CVA4地方分離株及從GenBank下載的50株國內(nèi)外CVA4型病毒代表株，可以劃分成6個(gè)進(jìn)化分支(A～F)，F(xiàn)分支又分為F1～F2兩亞分支。CVA4原型株(CVA4-High Point)及1999年肯尼亞株(Kenya11023.1/1999)分別獨(dú)自組成A分支與B分支；1999-2002年的美國株、2007-2009年印度株及2013年俄羅斯株組成C分支； 2002年、2004年日本地方株及2014年俄羅斯株組成D分支；中國CVA4地方分離株集中分布于E分支及F分支，E分支則由1998年的山東地方株及2006年的吉林地方株組成，而2006年之后的國內(nèi)地方株，如吉林、山東、安徽、寧夏、重慶、湖南、上海、廣東、云南等地方分離株包括2011-2014年的24株CVA4福建分離株共同組成F分支；5株2012年福建分離株(2012FJND180、2012FJND303、2012FJFZ052、2012FJZZ128、2012FJZZ147)與一株2012年重慶地方株組成F1亞分支，其余17株2012年福建分離株及兩株2014年福建分離株與多數(shù)2006年之后的國內(nèi)地方株形成F2亞分支。另外，從進(jìn)化樹顯示，2011-2014年24株CVA4福建分離株與原型株(CVA4-High Point)及1999-2014年國外(美國、俄羅斯、印度、日本、肯尼亞等)分離株的遺傳距離較遠(yuǎn)，親緣關(guān)系遠(yuǎn)，與2006-2014年國內(nèi)地區(qū)(如吉林、山東、安徽、寧夏、重慶、湖南、上海、廣東、云南等)分離株的遺傳距離近，親緣關(guān)系近。24株CVA4福建分離株相互之間的遺傳距離較近，親緣關(guān)系近。另外，種系進(jìn)化樹顯示，2011-2014年福建省的24株CVA4分離株中，不同地區(qū)的CVA4分離株在某個(gè)亞分支或某一簇沒有明顯的集中分布，而是分散分布。

● 2012 Fujian isolates; ▲ 2014 Fujian isolates圖2 福建省CVA4病毒分離株VP1區(qū)基因序列種系進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree in VP1 regions of Fujian CVA4 viruses

3 討 論

本研究對福建省2011-2014年共計(jì)1 525例其它腸道病毒手足口病病例的標(biāo)本開展病毒分離培養(yǎng)后分子分型檢測，共確定407例其它腸道病毒病例，其中柯薩奇病毒A4(CVA4) 的病例為33例，構(gòu)成比為8.1%，位居第三位。構(gòu)成比前兩位分別為：柯薩奇病毒A6(CVA6)48.9%(199例)和柯薩奇病毒A10(CVA10)25.3%(103例)，關(guān)于CVA6及CVA10已做相應(yīng)的研究報(bào)道[8-9]。

福建省2011-2014年33例CVA4手足口病病例的三間分布及病例類型分布等流行病學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析表明，2008-2010年福建省手足口病病原譜以EV71和CVA16為主，從2011年開始福建省手足口病病原譜發(fā)生明顯變化，EV71及CVA16的構(gòu)成比降低，CVA6、CVA10、CVA4等其它腸道病毒在病原譜的構(gòu)成比上升，與EV71及CVA16共同成為近些年手足病流行的主要型別。CVA4的時(shí)間分布分析顯示，雖然CVA4在2011-2014年福建省總體手足口病病原普構(gòu)成比不及CVA6及CVA10，位居第三位，但在某些年份，CVA4在手足口病病原普的構(gòu)成比也相對較高，如2012年CVA4構(gòu)成比與CVA10相當(dāng)。地區(qū)分布分析顯示，雖然2011-2014年福建省各個(gè)地區(qū)手足口病病原譜變遷情況較為類似，手足口病新增加的主要病原型別為CVA6、CVA10，但某些年份部分地區(qū)，CVA4也成為手足口病主要病原，如2012年寧德地區(qū)的CVA4構(gòu)成比甚至超過CVA6、CVA10，2012年漳州地區(qū)CVA4的構(gòu)成比與CVA10相當(dāng)。同時(shí)，近些年國內(nèi)外也有關(guān)于手足口病疫情相關(guān)病原CVA4的研究報(bào)道[10-15]。這些提示，CVA4已成為近年來國內(nèi)外及福建省除EV71、CVA16、CVA6、CVA10外導(dǎo)致手足口病的又一重要病原體。人群分布比較結(jié)果顯示，CVA4在性別、年齡組的分布特征與總體手足口病病例的性別、年齡組分布特征類似，兩者之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。病例嚴(yán)重程度分布比較結(jié)果顯示， CVA4感染導(dǎo)致重癥和死亡的頻率為9.1%，處在EV71(16.3%)和CVA16(3.2%)的中間區(qū)域，與EV71和CVA16均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，考慮是由于樣本量較少，尚不能反映其真實(shí)的水平，今后將持續(xù)加強(qiáng)監(jiān)測以獲得更多的病例數(shù)據(jù)資料。

VP1編碼區(qū)是病毒中和抗體的決定因子，對于病毒的抗原性和病毒血清的遺傳多樣性具有重要意義。基于VP1區(qū)擴(kuò)增測序分析，已成為腸道病毒分型鑒定的主要方法，對VP1全部或部分基因序列分析已廣泛應(yīng)用于腸道病毒感染的分子流行病學(xué)研究[1-2,6]。本研究分別通過擴(kuò)增部分VP1區(qū)基因及擴(kuò)增完整VP1區(qū)基因，來分型鑒定我省其它腸道病毒及分析我省其它腸道病毒的分子流行病特征。

福建省2011-2014年24株CVA4地方分離株的VP1區(qū)核苷酸序列及氨基酸序列分析結(jié)果顯示，福建省的24株CVA4地方分離株與CVA4原型株(CVA4-High Point)在核苷酸序列及氨基酸序列均存在較大差異。遺傳進(jìn)化分析結(jié)果顯示，福建省的24株CVA4地方分離株與原型株(CVA4-High Point)及1999-2014年國外地區(qū)分離株的遺傳距離較遠(yuǎn)，親緣關(guān)系遠(yuǎn)，與1998-2014年國內(nèi)地區(qū)分離株的遺傳距離近，親緣關(guān)系近。因此，福建省2011-2014年24株CVA4地方分離株并不是獨(dú)立進(jìn)化，而是與國內(nèi)其它地區(qū)的CVA4地方分離株存在同進(jìn)化共循環(huán)的關(guān)聯(lián)；此外，福建省2011-2014年24株CVA4地方分離株，集中分布于F1、F2亞分支，以及福建省不同地區(qū)的CVA4分離株在某個(gè)亞分支或某一簇沒有明顯的集中分布，而是分散分布，提示福建省及福建不同地區(qū)存在多條親緣關(guān)系接近的CVA4傳播鏈同時(shí)流行，F(xiàn)2亞分支則為近年來國內(nèi)及福建省CVA4分離株的主要流行分支。此外，將24株福建省CVA4分離株的VP1完整編碼區(qū)翻譯成氨基酸序列后結(jié)合系統(tǒng)進(jìn)化分析，我們發(fā)現(xiàn)，分布在F1非主要流行亞分支上的福建省5株分離株(2012FJND180、2012FJND303、2012FJFZ052、2012FJZZ128、2012FJZZ147)與分布在F2主要流行亞分支上的福建省其它19株分離株在VP1區(qū)氨基酸第18、34、44、200、281和304等位點(diǎn)存在不同程度的差異。特別是在第18個(gè)氨基酸位點(diǎn)，F(xiàn)1非主要流行亞分支上的福建省5株分離株的氨基酸均為K，而F2主要流行亞分支上的福建省其它19株分離株均為R；在第34個(gè)氨基酸位點(diǎn)，F(xiàn)1非主要流行亞分支上的福建省5株分離株的氨基酸均為A，而F2主要流行亞分支上的福建省其它19株分離株多數(shù)為T。這些氨基酸位點(diǎn)上的差異特別是在第18個(gè)氨基酸位點(diǎn)(R / K)是否與CVA4的傳播力強(qiáng)弱等方面有關(guān)有待進(jìn)一步的深入研究。

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MolecularepidemiologyofHFMD-associatedpathogencoxsackievirusA4inFujianProvince,2011-2014

CHEN Wei, WENG Yu-wei, HE Wen-xiang, ZHU Ying, HUANG Meng, ZHANG Yong-jun, XIE Jian-feng, ZHENG Kui-cheng, YAN Yan-sheng

(FujianCenterforDiseaseControlandPrevention,Fuzhou350001,China)

To analyze the epidemiology, genetic variation and genetic evolution of coxsackievirus A4 (CVA4) in patients with hand, foot and mouth disease in Fujian, the virus isolates were molecular typed and amplified the whole VP1 region by RT-PCR, then the genetic variation and evolution were studied. The results showed that 33 CVA4 cases (8.1%) were confirmed from the 407 non-EV71 non-CVA16 HFMD cases in Fujian Province during 2011 and 2014, accounting for 31 cases in 2012 and 2 cases in 2014. Compared with common characteristics of the HFMD epidemic, no specificity in the distribution of CVA4 cases was found between gender and age groups. Sequence analysis of VP1 nucleotide sequences of Fujian CVA4 isolates showed that the nucleotide and amino acid sequences similarity were 92.6%-100% and 95.7%-100% respectively, low similarity with the prototype (83.7%-85.4%, 96.1%-99.0%) and abroad isolates (82.1%-89.1%, 90.4%-99.6%) both in nucleotide and amino acid sequences, high similarity with domestic isolates both in nucleotide and amino acid sequences, with the similarity of 87.9%-99.2% and 96.1%-100%. The results from phylogenetic tree showed that the genetic distance between Fujian CVA4 isolates and the prototype and abroad strains was far, and the genetic distance was close to domestic isolates in China. The distribution of the phylogenetic trees of Fujian CVA4 strains showed multiple branches. Therefore, CVA4 is the major HFMD associated-pathogen other than EV71, CVA16, CVA6, and CVA10 in Fujian Province from 2011 to 2014. CVA4 strains from Fujian Province is co-circulating and co-evolving with other domestic isolates. There is existence of multiple closely related CVA4 transmission chains in various regions of Fujian.

hand, foot and mouth disease (HFMD); coxsackievirus A4 (CVA4); molecular epidemiology

Yan Yan-sheng, Email: yysh@fjcdc.com.cn

福建省自然科學(xué)基金(No.2016J01350)與福建省衛(wèi)計(jì)委青年科研課題(No.2014-1-25)聯(lián)合資助

嚴(yán)延生，Email：yysh @fjcdc. com. cn

福建省疾病預(yù)防控制中心，福州 350001

R373.2

：A

：1002-2694(2017)09-0768-06

2017-02-08編輯：梁小潔

Support by the Provincial Natural Science Foundation of Fujian (No. 2016J01350) and the Youth Scientific Research Program of Fujian Provincial Health and Family Planning Commission (No. 2014-1-25)