許素文

譚 岸2

金晨鐘1,3

胡一鴻1,3

(1. 湖南人文科技學(xué)院農(nóng)藥無(wú)害化應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 婁底 417000；2. 湖南伍星生物科技有限公司，湖南 雙峰 417700；3. 湖南省農(nóng)田雜草防控技術(shù)與應(yīng)用協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 婁底 417000)

硫酸軟骨素脫蛋白工藝優(yōu)化

許素文1

譚 岸2

金晨鐘1,3

胡一鴻1,3

(1. 湖南人文科技學(xué)院農(nóng)藥無(wú)害化應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 婁底 417000；2. 湖南伍星生物科技有限公司，湖南 雙峰 417700；3. 湖南省農(nóng)田雜草防控技術(shù)與應(yīng)用協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 婁底 417000)

為了提高硫酸軟骨素的品質(zhì)，采用Sevag試劑對(duì)硫酸軟骨素提取液進(jìn)行脫蛋白處理，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)脫蛋白工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳條件為：氯仿與異戊醇體積比2∶1，Sevag試劑用量為硫酸軟骨素提取液體積的1/2，處理時(shí)間25 min，處理次數(shù)3。各因素對(duì)脫蛋白效果影響大小依次為氯仿異戊醇比例>處理時(shí)間>處理次數(shù)> Sevag試劑用量。在該最佳條件下，硫酸軟骨素保留率為87.98%，脫蛋白率52.15%。經(jīng)190～350 nm紫外掃描，未見280 nm處蛋白質(zhì)特征吸收峰；經(jīng)紅外光譜分析，硫酸軟骨的構(gòu)型未發(fā)生變化，說(shuō)明該方法穩(wěn)定可靠，適合于工業(yè)化硫酸軟骨素的脫蛋白。

Sevag試劑；硫酸軟骨素；脫蛋白；紅外光譜

硫酸軟骨素廣泛存在于動(dòng)物組織中，是組成軟骨、肌腱、血管壁等器官所必需的黏性蛋白多糖[1]。硫酸軟骨素由重復(fù)單位的葡萄糖醛酸和乙酰半乳糖胺二聚體與蛋白質(zhì)核心相連形成糖蛋白[2]，具有增加骨密度[3]、促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞分裂與發(fā)育[4]、消炎[5]與免疫[6]等功能，已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥和保健食品等領(lǐng)域。硫酸軟骨素可作為食品添加劑成分，也可在臨床上應(yīng)用于關(guān)節(jié)炎的治療[7-8]。

硫酸軟骨素按葡萄糖醛酸和乙酰半乳糖胺的羥基硫酸化程度分為A、C、D、E等不同構(gòu)型。其中，A型與C型硫酸軟骨素由于硫酸化程度低、活性高而受到廣泛歡迎。硫酸軟骨素的多聚糖與蛋白質(zhì)共價(jià)連接，工業(yè)上制備高純度硫酸軟骨素的關(guān)鍵技術(shù)是在保持其天然構(gòu)型的基礎(chǔ)上盡量去除蛋白質(zhì)。多糖類物質(zhì)中蛋白質(zhì)去除常采用Sevag法和三氯乙酸(trichloroacetic acid，TCA)法等[9-10]。其中，TCA法沉淀蛋白質(zhì)效果好，但該試劑會(huì)造成多糖降解且溶于水，在最終產(chǎn)品中的殘留難以去除[11]；常規(guī)的Sevag法去除效率較低[12-13]，但其去除效率仍可達(dá)85%[14]，且該方法條件溫和，是脫蛋白的經(jīng)典方法[15]。目前，在生產(chǎn)上大都采用稀堿、蛋白酶、等電點(diǎn)沉淀等方法對(duì)原料進(jìn)行處理，去除蛋白效果不佳，最終產(chǎn)品的純度通常在93%以下。中國(guó)是硫酸軟骨的生產(chǎn)和出口大國(guó)，占全球產(chǎn)量的80%[5]，但國(guó)內(nèi)純化工藝水平較低，目前也未見Sevag法去除硫酸軟骨素中蛋白質(zhì)的相關(guān)報(bào)道。因此，本試驗(yàn)擬以硫酸軟骨素提取液為原料，采用在常溫下水溶性低的Sevag試劑(氯仿和異戊醇)進(jìn)行脫蛋白處理，考察硫酸軟骨素保留率與脫蛋白率，以期為硫酸軟骨素的生產(chǎn)工藝改進(jìn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 試驗(yàn)原料

硫酸軟骨素提取液：硫酸軟骨素含量為0.068 mg/mL，湖南伍星生物科技有限公司。

1.1.2 試劑與儀器

硫酸軟骨素A標(biāo)準(zhǔn)品：生物試劑(BR級(jí))，美國(guó)Sigma公司；

間苯三酚：分析純，美國(guó)Sigma公司；

KBr：光譜純，天津金貝爾科技有限公司；

其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；

紫外掃描分光光度計(jì)：UVmini-1240型，日本島津公司；

FT-IR光譜儀：Nicolet iS50型，美國(guó)熱電公司；

冷凍離心機(jī)：L530型，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；

電子分析天平：AUY120型，日本島津公司；

空氣恒溫振蕩器：HZQ-C型，北京東聯(lián)儀器公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 硫酸軟骨素制備流程

牛軟骨→弱堿煮沸→冷卻→粗過(guò)濾→蛋白酶水解→離心→超濾→等電點(diǎn)沉淀→雙氧水氧化→陰離子交換樹脂純化→硫酸軟骨素提取液

1.2.2 蛋白質(zhì)含量與硫酸軟骨素含量測(cè)定

(1) 蛋白質(zhì)含量測(cè)定：采用微量考馬斯亮藍(lán)法[16]。取1.6 mL待測(cè)樣品溶液，加入0.4 mL考馬斯亮蘭G250溶液，搖勻后靜置2 min，測(cè)定A595。以20～100 μg的牛血清蛋白為樣品采用相同方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

(2) 硫酸軟骨素含量測(cè)定：參照高華等[17]的方法，在具塞試管中加入0.4 mL待測(cè)樣品溶液，加入3 mL間苯三酚溶液，沸水浴30 min，測(cè)定A558。間苯三酚溶液配方：取30 mL冰醋酸、40 mL鹽酸與10 mL 50 mg/mL的間苯三酚乙醇溶液混合。以0～16 μg硫酸軟骨素標(biāo)準(zhǔn)品為樣品采用相同方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 硫酸軟骨素脫蛋白 參照張雅利等[12]的方法，采用一定比例的氯仿異戊醇混合溶液作為Sevag脫蛋白試劑。

脫蛋白率與硫酸軟骨素保留率按式(1)和(2)計(jì)算：

(1)

(2)

式中：

d——脫蛋白率，%；

A1——脫蛋白前溶液中蛋白質(zhì)含量，μg/mL；

A2——脫蛋白后溶液中蛋白質(zhì)含量，μg/mL；

r——硫酸軟骨素保留率，%；

B1——脫蛋白前溶液中硫酸軟骨素含量，μg/mL；

B2——脫蛋白后溶液中硫酸軟骨素含量，μg/mL。

1.2.4 紫外掃描檢測(cè)硫酸軟骨素 參照Chen等[18]的方法，取硫酸軟骨素溶液1 mL，加入蒸餾水2 mL，混勻后于波長(zhǎng)190～350 nm范圍掃描，檢測(cè)280 nm處是否有蛋白質(zhì)吸收峰。

1.2.5 紅外光譜(FTIR)檢測(cè)硫酸軟骨素 醇沉硫酸軟骨素提取液，制備無(wú)水硫酸軟骨素成品[19-20]：取200 mL硫酸軟骨素提取液，加入無(wú)水酒精使酒精體積分?jǐn)?shù)達(dá)到75%，攪拌2 min，靜置15 min后，再攪拌2 min，然后靜置2 h，去掉酒精，保留含絮狀沉淀的溶液。往沉淀中加入無(wú)水酒精，使酒精體積分?jǐn)?shù)達(dá)到90%，攪拌2 min，靜置15 min后，攪拌2 min，靜置2 h。靜置期間每隔0.5 h測(cè)定酒精體積分?jǐn)?shù)，當(dāng)其值低于90%時(shí),加入無(wú)水酒精至酒精體積分?jǐn)?shù)達(dá)到90%。然后5 000 r/min離心10 min，沉淀物于88 ℃干燥3.5 h，密封包裝備用。

硫酸軟骨素的紅外光譜檢測(cè)：參照Wang等[21]的方法，將無(wú)水硫酸軟骨素與KBr按質(zhì)量比1∶100均勻混合，研磨成粉末，粉末置于20 MPa壓力壓片，透射法檢測(cè)，發(fā)射波長(zhǎng)400～4 000 cm-1，分辨率4 cm-1，掃描數(shù)32。

1.2.6 單因素試驗(yàn)

(1) 氯仿與異戊醇體積比：在5個(gè)錐形瓶中各加入15 mL的硫酸軟骨素提取液，固定Sevag試劑用量1/3倍硫酸軟骨素提取液體積、處理時(shí)間20 min、處理次數(shù)1，分別在氯仿與異戊醇體積比為2∶1，3∶1，4∶1，5∶1，6∶1的條件下，測(cè)定上相溶液的蛋白質(zhì)和硫酸軟骨素含量，計(jì)算脫蛋白率和硫酸軟骨素保留率。

(2) Sevag試劑用量：在5個(gè)錐形瓶中各加入15 mL硫酸軟骨素提取液，固定氯仿與異戊醇體積比3∶1、處理時(shí)間20 min、處理次數(shù)1，分別在Sevag試劑用量1，1/3，1/4，1/5，1/6倍硫酸軟骨素提取液體積條件下，測(cè)定上相溶液的蛋白質(zhì)和硫酸軟骨素含量，計(jì)算脫蛋白率和硫酸軟骨素保留率。

(3) 處理時(shí)間：在5個(gè)錐形瓶中各加入15 mL硫酸軟骨素提取液，固定氯仿與異戊醇體積比3∶1、Sevag試劑用量1/3倍硫酸軟骨素提取液體積、處理次數(shù)1，分別在處理時(shí)間15，20，25，30，35 min條件下，測(cè)定上相溶液的蛋白質(zhì)和硫酸軟骨素含量，計(jì)算脫蛋白率和硫酸軟骨素保留率。

(4) 處理次數(shù)：在錐形瓶中加入15 mL硫酸軟骨素提取液，固定氯仿與異戊醇體積比3∶1、Sevag試劑用量1/3倍硫酸軟骨素提取液體積、處理時(shí)間20 min，以上試驗(yàn)分別做1，2，3，4，5次，測(cè)定上相溶液的蛋白質(zhì)和硫酸軟骨素含量，計(jì)算脫蛋白率和硫酸軟骨素保留率。

1.2.7 正交試驗(yàn) 通過(guò)單因素試驗(yàn)，選取Sevag試劑中氯仿與異戊醇體積比、Sevag試劑用量、處理時(shí)間、處理次數(shù)為考察因素，以硫酸軟骨素脫蛋白率和硫酸軟骨素?fù)p失率為考察指標(biāo)，設(shè)計(jì)4因素3水平正交試驗(yàn)，采用綜合加權(quán)法評(píng)分優(yōu)選工藝條件，設(shè)脫蛋白率和硫酸軟骨素保留率2項(xiàng)指標(biāo)各占0.5權(quán)重，然后以最佳條件進(jìn)行驗(yàn)證。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用mean ± SD (n=3)表示，采用SPSS 19.0的單向方差分析進(jìn)行差異比較(P<0.05)(LSD法)，以小寫字母標(biāo)注顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)及硫酸軟骨素含量標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

2.1.1 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線 以牛血清蛋白濃度x(μg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1，得到蛋白質(zhì)含量測(cè)定的回歸方程為：y=0.004 2x-0.001 3，相關(guān)系數(shù)R2=0.996 2。

圖1 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.2 硫酸軟骨素標(biāo)準(zhǔn)曲線 以硫酸軟骨素濃度x(μg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制硫酸軟骨素標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2，得到硫酸軟骨素含量測(cè)定的回歸方程為：y=0.036 7x+0.006 3，相關(guān)系數(shù)R2=0.996 9。

圖2 硫酸軟骨素標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 氯仿與異戊醇體積比對(duì)硫酸軟骨素脫蛋白的影響

由圖3可知，氯仿與異戊醇體積比為3∶1時(shí)，硫酸軟骨素保留率最高，為80.65%，而此時(shí)脫蛋白率仍達(dá)到40.46%，但隨著氯仿比例的上升，脫蛋白的效果急劇變差，氯仿與異戊醇體積比為4∶1時(shí)，脫蛋白率僅為24.44%。可能是分離時(shí)振蕩頻率較高，異戊醇用量少會(huì)產(chǎn)生泡沫影響了蛋白質(zhì)變性效果。氯仿與異戊醇體積比為5∶1和6∶1時(shí)，脫蛋白率卻略有上升，但與4∶1時(shí)相比均無(wú)顯著差異。因此采用氯仿與異戊醇體積比為3∶1。

2.2.2 Sevag試劑用量對(duì)硫酸軟骨素脫蛋白的影響 由圖4可知，Sevag試劑用量逐漸減少，硫酸軟骨素保留率逐漸上升，但脫蛋白的效果變差。Sevag試劑用量較大時(shí)，脫蛋白效果較好，但可能會(huì)使共價(jià)連接的蛋白質(zhì)變性，造成硫酸軟骨素保留率下降。因此采用的Sevag試劑用量為硫酸軟骨素提取液體積的1/3。

不同字母表示差異顯著(P<0.05)

不同字母表示差異顯著(P<0.05)

2.2.3 處理時(shí)間對(duì)硫酸軟骨素脫蛋白的影響 由圖5可知，處理時(shí)間越長(zhǎng)，脫蛋白越徹底，但硫酸軟骨素的保留率越低，可能是處理時(shí)間延長(zhǎng)時(shí)蛋白質(zhì)變性形成的膠絮狀物與蛋白多聚糖共沉淀，硫酸軟骨素保留率下降[12]。當(dāng)處理時(shí)間大于25 min時(shí)，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，硫酸軟骨素保留率顯著下降，而其脫蛋白率差異不顯著。因此處理時(shí)間采用25 min。

2.2.4 處理次數(shù)對(duì)硫酸軟骨素脫蛋白的影響 由圖6可知，隨脫蛋白次數(shù)的增加，硫酸軟骨素保留率呈下降趨勢(shì)，脫蛋白率呈上升趨勢(shì)。脫蛋白次數(shù)超過(guò)3次時(shí)，硫酸軟骨素保留率開始急劇下降。脫蛋白次數(shù)達(dá)到5次時(shí)，脫蛋白率達(dá)到63.26%，但硫酸軟骨素保留率僅為24.86%。每次去除蛋白時(shí)，不可避免地造成了糖蛋白的損失；硫酸軟骨素保留率急劇下降的原因可能是經(jīng)過(guò)多次脫除蛋白的操作，游離蛋白質(zhì)沉淀后，多聚糖蛋白與氯仿的分子接觸機(jī)率增大蛋白變性加劇[22]。因此處理次數(shù)采用2次。

不同字母表示差異顯著(P<0.05)

不同字母表示差異顯著(P<0.05)

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素的試驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)的正交試驗(yàn)因素水平見表1，正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

通過(guò)表2直觀分析顯示，Sevag法脫蛋白的最佳條件為A1B1C2D3，影響脫蛋白效果的因素大小為氯仿與異戊醇體積比>處理時(shí)間>處理次數(shù)>Sevag試劑用量。

表1 正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果?

? 加權(quán)綜合評(píng)分以脫蛋白率與硫酸軟骨素保留率之和最大值的試驗(yàn)行作為參照計(jì)算。

以極差值最小的B因素為誤差項(xiàng)[23]，對(duì)表2結(jié)果進(jìn)行方差分析和F檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)氯仿與異戊醇體積比、處理時(shí)間各水平存在顯著性差異，Sevag試劑用量、處理次數(shù)的影響不顯著(見表3)。

表3 正交試驗(yàn)方差分析?

? a表示誤差列；*表示差異顯著；-表示差異不顯著(a=0.05)。

在優(yōu)化的工藝條件下，進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，脫蛋白率為(52.15±1.18)%，硫酸軟骨素保留率為(87.98±1.36)%，加權(quán)綜合評(píng)分達(dá)1.066。

2.4 紫外掃描與FTIR檢測(cè)驗(yàn)證

將脫蛋白后的硫酸軟骨素用蒸餾水稀釋2倍，在波長(zhǎng)190～350 nm掃描，發(fā)現(xiàn)280 nm處無(wú)蛋白特征吸收峰(圖7)，說(shuō)明該條件下脫蛋白效果良好。

圖7 脫蛋白后硫酸軟骨素溶液紫外光譜

將無(wú)水硫酸軟骨素成品進(jìn)行KBr壓片，F(xiàn)TIR透射法檢測(cè)吸收光譜。FTIR光譜檢測(cè)顯示，3 500～3 200 cm-1的寬峰為O—H伸縮振動(dòng)，3 000～2 800 cm-1的峰為糖的C—H伸縮振動(dòng)[24]；1 300～900 cm-1的峰為SO3的特征光譜，其中，稍弱的峰為SO3的反相伸縮振動(dòng)，稍強(qiáng)的峰為SO3的同相伸縮振動(dòng)；930，851，724 cm-1為硫酸軟骨素的特征峰[25-26]，見圖8。由圖8可知，脫蛋白前與脫蛋白后的硫酸軟骨素SO3的特征光譜圖一致，而且硫酸軟骨素的特征峰強(qiáng)度增大，說(shuō)明經(jīng)Sevag試劑脫蛋白后，硫酸軟骨素的構(gòu)型沒有發(fā)生變化，硫酸軟骨素純度增大。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，結(jié)合正交試驗(yàn)及方差分析，得到了Sevag試劑對(duì)硫酸軟骨素提取液脫蛋白處理的最佳工藝條件。在該試驗(yàn)條件下，脫蛋白率達(dá)到52.15%，硫酸軟骨素保留率達(dá)到87.98%，硫酸軟骨素的構(gòu)型沒有變化，品質(zhì)有所提高，說(shuō)明Sevag法不僅適用于去除蛋白多糖中的雜蛋白[22]，而且適用于去除糖胺聚糖硫酸軟骨素中的雜蛋白。本試驗(yàn)得出的最佳工藝參數(shù)在高純度硫酸軟骨素的開發(fā)中具有重要的參考價(jià)值。

圖8 硫酸軟骨素的FTIR檢測(cè)光譜

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Optimization of deproteinization technology on chondroitin sulfate with Sevag method

XUSu-wen1

TANAn2

JINChen-zhong1,3

HUYi-hong1,3

(1.KeyLaboratoryofPesticideHarmlessApplication,HunanUniversityofHumanities,ScienceandTechnology,Loudi,Hunan417000,China; 2.HunanWuxingBiotechnologyCo.,Ltd,Shuangfeng,Hunan417700,China)3.HunanProvincialCollaborativeInnovationCenterforFieldWeedsControl,HunanUniversityofHumanities,ScienceandTechnology,Loudi,Hunan417000,China;

In order to promote the quality of chondroitin sulfate, Sevag reagent was used to deprotein the extraction of chondroitin sulfate through the single factor and the orthogonal tests to optimize the process of deproteinization. The optimal conditions were ratio of chloroform to isoamyl alcohol 2∶1 (V/V), Sevag reagent dosage 1/2 fold compared with the volume of chondroitin sulfate extraction, treated for 25 min and repeated treatment for 3 times. The factors influenced the extraction in the order of ratio of chloroform to isoamyl alchohol,treatment time , treatment times, and Sevag reagent dosage. Under the optimal conditions, the retention rate of chondroitin sulfate was 87.98%, and the deproteinization rate was 52.15%. No specific absorption of 280 nm was observed with ultraviolet (UV) scanning from 190 to 350 nm, and the configuration of chondroitin sulfate was confirmed untransformed with Fourier-transform infrared spectroscopy (FTIR) analysis. The results suggested that this deproteinization method was stable, reliable and suitable for deproteinization of chondroitin sulfate in industry.

Sevag reagent; orthogonal test; chondroitin sulfate; deproteinization; Fourier-transform infrared spectroscopy (FTIR)

湖南省科技計(jì)劃重點(diǎn)研發(fā)與技術(shù)創(chuàng)新項(xiàng)目(編號(hào)：2016NK3093)

許素文，女，湖南人文科技學(xué)院在讀碩士研究生。

胡一鴻(1965—)，男，湖南人文科技學(xué)院教授，博士。 E-mail:huyhongwangyi@163.com

2017—03—03

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.07.040