劉美花 周向東 李 琪 劉 峰 王 杰 鐘有清

(海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，?？?70102)

·中醫(yī)中藥與免疫·

苦味類中藥成份藉苦味受體途徑對(duì)氣道炎癥過程的遏制效應(yīng)①

劉美花 周向東 李 琪 劉 峰 王 杰 鐘有清

(海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，海口570102)

目的：探討苦味受體(Bitter taste receptor，TAS2Rs)在苦味類中藥組份治療慢性氣道炎癥中的抗炎效應(yīng)。方法：實(shí)驗(yàn)分為三組(n=8)，即空白對(duì)照組、PM2.5組(霧化吸入PM2.5懸液復(fù)制大鼠慢性氣道炎癥模型)和PM2.5+檸檬苦素組(陳皮提取物干預(yù))，分別以ELISA、RT-PCR和Westem blot檢測(cè)各組大鼠支氣管/肺組織炎癥因子及TAS2Rs mRNA和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：PM2.5刺激組炎癥因子TNF-α和IL-13的mRNA和蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組明顯增高，TAS2R14的mRNA和蛋白表達(dá)變化不明顯；檸檬苦素干預(yù)組炎癥因子TNF-α和IL-13的mRNA和蛋白表達(dá)水平較PM2.5組降低，TAS2R14的mRNA和蛋白表達(dá)水平則明顯增高。結(jié)論：苦味類中藥組份吸入治療可遏制慢性炎性氣道的炎癥因子產(chǎn)生及釋放，并刺激肺部TAS2Rs的表達(dá)增加，故認(rèn)為苦味類中藥組份激活氣道TAS2Rs可能是其發(fā)揮抗炎效應(yīng)的重要機(jī)制。

苦味受體;苦味中藥;炎癥因子;氣道炎癥

氣道的慢性炎性過程是慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary desease,COPD)形成及發(fā)展的重要表征，多種炎癥細(xì)胞和細(xì)胞因子參與該過程[1,2]，目前的抗炎治療藥物雖能有效地減少炎癥因子的分泌，但由于存在副作用多及缺乏器官特異性等問題而不夠理想?？辔妒荏w(Bitter taste receptors,TAS2Rs )是與人體感受苦味物質(zhì)密切相關(guān)的一類G蛋白偶聯(lián)受體，近幾年研究發(fā)現(xiàn)人體呼吸系統(tǒng)也表達(dá)部分苦味受體[3]。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)肺部TAS2Rs的支氣管舒張作用研究較多，而對(duì)其抗炎效應(yīng)涉及甚少，鑒于臨床上多數(shù)具抗炎作用的中藥組份具有突出的苦味，故認(rèn)為苦味受體的激活可能在氣道慢性炎癥的形成過程中起著拮抗作用，但其確切機(jī)制尚不得知。本研究采用臨床上常用的苦味類中藥陳皮的苦味成分檸檬苦素為刺激因素，研究TAS2Rs的激活對(duì)慢性氣道炎癥的作用，以期為TAS2Rs在慢性氣道炎癥的治療作用提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料、試劑 TH-150C型大容量大氣總顆粒物智能采樣器(Andersen公司，美國(guó))；石英纖維膜(Whatman公司，美國(guó))；Wistar大鼠，SPF級(jí)，雌雄不限，4～6周齡，體質(zhì)量(200±20)g[廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(粵)2013-0002]；中藥單體化合物：檸檬苦素(質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.5%)，購(gòu)自西安開來生物工程有限公司；TNF-α、IL-13 ELISA試劑盒(名勁生物科技有限公司，上海)；兔抗鼠β肌球蛋白(β-Actin)多克隆抗體(碧云天生物技術(shù)有限公司，上海)；HRP標(biāo)記的羊抗兔多克隆IgG抗體(SantaCruz，美國(guó))；RNA抽提試劑盒，MMLV(重組鼠白血病病毒反轉(zhuǎn)錄酶)第一鏈cDNA合成試劑盒，實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(貨號(hào)：DRR820A，TaKaRa公司，日本)；RIPA裂解液(由碧云天生物技術(shù)有限公司提供，上海)；兔抗鼠TAS2R14多克隆抗體(Abcam公司，英國(guó))；兔抗鼠TNF-α、IL-13、GAPDH一抗(均Calbiochem公司)；所有引物合成均由上海生物工程有限公司完成。

1.2方法

1.2.1PM2.5 的采集及懸浮液的制作 到建筑工地附近，用TH-150C型大容量大氣總顆粒物智能采樣器采集大氣中的PM2.5顆粒物，將顆粒物采集在20 cm×20 cm的玻璃纖維濾膜上，連續(xù)采樣24 h，采集連續(xù)1個(gè)月，剪短吸附PM2.5的纖維濾紙，對(duì)折后侵入超純水，以超聲低溫震蕩30 min，用紗布過濾洗脫液后，濾液于4℃、10 000 r/min下20 min離心3次，棄上清液，稱其質(zhì)量后保存于-20℃冰箱，用生理鹽水配成40 μg/ml顆粒物懸液，超生震蕩15 min后混合均勻，保存于4℃冰箱備用。

1.2.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組、染毒 大鼠觀察喂養(yǎng)3 d無異常情況后隨機(jī)分為三組(n=8)分組實(shí)驗(yàn)條件如下：①空白對(duì)照組：以生理鹽水(6 ml)霧化吸入。②PM2.5組：以PM2.5的顆粒物懸液(40 μg/ml)6 ml經(jīng)超聲霧化吸入進(jìn)行毒染，約30 min/次，1次/d，染毒溫度37℃，染毒時(shí)間持續(xù)4周，制成慢性氣道炎癥的動(dòng)物模型。③PM2.5+檸檬苦素組：在給予PM2.5毒染1 h后給予霧化吸入20 μmol/L的檸檬苦素溶液(6 ml)，約30 min/次，1次/d。第28天處死大鼠，均在最后一次染毒實(shí)驗(yàn)處理結(jié)束24 h后處死，剪開大鼠頸部皮膚，暴露氣管，分別收集肺泡灌洗液，剝離氣管和肺臟，將肺臟和氣管收集于-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3ELISA法檢測(cè)支氣管肺泡灌洗液(BALF)中TNF-α、IL-13的含量 各組大鼠經(jīng)腹腔麻醉后，頸部切開插入氣管導(dǎo)管，用4℃無鈣鎂Hanks液10 ml分2次灌洗，使回收的BALF不少于5 ml，經(jīng)1 000 r/min離心10 min，取BALF上清液備用。標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋和加樣：按試劑盒說明書進(jìn)行。加樣：各實(shí)驗(yàn)分組設(shè) 有3個(gè)復(fù)孔，另設(shè)置1個(gè)空白孔，分別吸取BALF上清液0.1 ml包被酶標(biāo)板，4℃過夜，封閉采用含1%牛血清白蛋白的PBS(0.01%mol/L)-Tween 20(0.05%)于室溫下封閉1 h，一抗以1∶500倍稀釋，取抗大鼠氣道TNF-α、IL-13單抗RTEll 100 ml，37℃孵育1 h，辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG以1∶1 000稀釋，取100 μl，37℃孵育1 h，底物溶液100 μl，于37℃顯色15 min后停止反應(yīng)。最后于492 nm處測(cè)光密度值作為TNF-α、IL-13含量的相對(duì)值(OD值)。

1.2.4RT-PCR法檢測(cè)支氣管肺組織中TAS2R14和TNF-α、IL-13 mRNA含量 采用Trizol法分別抽提各組動(dòng)物肺組織總的RNA，經(jīng)核酸檢測(cè)儀測(cè)定RNA的濃度和在260 nm和280 nm的吸光度(A)值，樣品A260/A280比值均介于1.8～2.0，樣品的總RNA做初步定量后，保存于-20℃?zhèn)溆?。隨后采用兩步法進(jìn)行RT-PCR。參照試劑盒說明書合成cDNA第一鏈。引物序列見表1。滅菌PCR管中依次加入Mgcl2：(25 mmol/L) 4.0 μl、10×PCR反應(yīng)緩沖液5.0 μl、上、下游引物各1.0 μl、dNTP 4.0 μl、cDNA 2.0 μl、Taq酶(5×106U/L) 0.5 μl，定容至50.0 μl，輕輕混勻離心后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。先于94℃ 預(yù)變性3 min，后緊跟34個(gè)循環(huán)，循環(huán)參數(shù)：94℃ 45 s，54℃ 30 s，70℃ 60 s，后72℃延伸5 min補(bǔ)齊末端。PCR產(chǎn)物均經(jīng)1.5%瓊脂糖電泳鑒定，結(jié)果經(jīng)光密度面積積分分析，均以與管家基因GAPDH mRNA的比值作為目的基因mRNA的相對(duì)值。

表1RT-PCR各目的基因引物序列

Tab.1PrimersequencoftargetgenesforRT-PCR

TargetgeneForwardReverseTAS2R145'-TGCTGCTTCTTGTGACTTCGGTCT-3'5'-GTGTGCTGCATCTTCTTGCGATGT-3'TNF-α5'-TTTGATCCCTGACATCTGGA3'5'-GGCCTAAGGTCCACTTGTGT-3'IL-135'-ACTTGCTTGCCTTGGTGGTC-3'5'-TAGGGGAGTCTGGTCTTGTG-3'GAPDH5'-CATGTTCGTCATGGGTGTGAACCA-3'5'-AGTGATGGCATGGACTGTGGTCAT-3'

1.2.5Western blot法檢測(cè)TAS2R14和TNF-α、IL-13的蛋白含量 各組大鼠肺和氣管組織分別稱取0.1 g，加入1 ml含20 μl，100 μg/ml的PMSF和10 μl 磷酸酶抑制劑RIPA裂解液勻漿10 min，后置冰上裂解10 min，4℃ 12 000 r/min離心10 min，取上清液，采用Brad-ford法對(duì)上清液進(jìn)行蛋白定量并分裝后，于-20℃保存?zhèn)溆谩７謩e取各組蛋白樣品，經(jīng)過含有12%丙烯酰胺的SDS-PAGE及含5%丙烯酰胺的SDS-PAGE分離-濃縮膠電泳分離，印跡轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用5%脫脂牛乳(PBS稀釋)于搖床上封閉1 h后，加入兔抗鼠TAS2R14(1∶500)多克隆抗體，TNF-α、IL-13和β-actin單克隆抗體稀釋比均為(1∶1 000)，置于4℃冰箱孵育過夜，第二天取出于搖床上孵育1 h，洗膜3次后加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG (1∶2 000)，室溫孵育1 h。經(jīng)徹底洗滌后ECL顯色，加反應(yīng)液與入底物，暗室曝光5 min。結(jié)果經(jīng)密度面積積分分析，均以與內(nèi)參β-actin的產(chǎn)物條帶的比值作為相對(duì)含量。

2 結(jié)果

2.1ELISA檢測(cè)BALF中TNF-α、IL-13蛋白表達(dá)情況 PM2.5吸入刺激后， TNF-α、IL-13蛋白表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組；而與PM2.5刺激組比較，PM2.5+檸檬苦素組的TNF-α、IL-13蛋白表達(dá)水平下降。該結(jié)果表明，PM2.5可誘導(dǎo)氣道炎癥因子的產(chǎn)生增加，而檸檬苦素對(duì)PM2.5誘導(dǎo)的氣道炎癥因子的產(chǎn)生有抑制作用。見表2。

GroupsTNF-αIL-13Controlgroup0.39±0.020.23±0.03PM2.5group0.78±0.041)0.51±0.081)PM2.5+limoningroup0.63±0.062)0.38±0.032)

Note：1)P<0.01 compared with the control group;2)P<0.05 compared with PM2.5 group.

2.2Real-time PCR檢測(cè)支氣管/肺組織TAS2R14和TNF-α、IL-13 mRNA的轉(zhuǎn)錄情況 PM2.5刺激后，TNF-α、IL-13 mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組明顯升高；而與PM2.5組相比，PM2.5 +檸檬苦素組的TNF-α、IL-13 mRNA表達(dá)水平則顯著下降，同時(shí)TAS2R14 mRNA表達(dá)水平明顯升高。該結(jié)果提示，檸檬苦素可激活肺部TAS2R14的mRNA 表達(dá)，從而遏制PM2.5引起的炎癥因子的轉(zhuǎn)錄。見表3，圖1。

2.3Western blot檢測(cè)支氣管/肺組織中TAS2R14和TNF-α、IL-13蛋白表達(dá)情況 PM2.5吸入刺激后，氣道的TNF-α、IL-13蛋白表達(dá)量較對(duì)照組明顯升高；而與PM2.5組相比，檸檬苦素干預(yù)組的TNF-α、IL-13蛋白表達(dá)水平則顯著下降，同時(shí)TAS2R14 mRNA表達(dá)水平明顯升高。該結(jié)果表明，檸檬苦素可激活肺部TAS2R14的蛋白表達(dá)，其激活可進(jìn)一步抑制PM2.5誘導(dǎo)的炎癥因子的表達(dá)。見表4，圖2。

GroupsTNF-αIL-13TAS2R14Controlgroup0.27±0.060.27±0.090.25±0.09PM2.5group0.75±0.101)0.72±0.111)0.27±0.07PM2.5+limoningroup0.31±0.012)0.35±0.042)0.53±0.072)

Note：1)P<0.01 compared with the control group;2)P<0.05 compared with PM2.5 group.

圖1 各組炎癥細(xì)胞因子和苦味受體的mRNA表達(dá)水平Fig.1 mRNA expression levels of inflammatory cytokines and bitter taste receptorNote: 1.Control group；2.PM2.5 group；3.PM2.5+ limonin group.

GroupsTNF-αIL-13TAS2R14Controlgroup0.29±0.070.29±0.120.27±0.01PM2.5group0.64±0.051)0.63±0.041)0.30±0.03PM2.5+limoningroup0.32±0.012)0.34±0.052)0.52±0.062)

Note：1)P<0.05 compared with the control group;2)P<0.05 compared with PM2.5 group.

圖2 各組炎癥細(xì)胞因子和苦味受體的蛋白水平Fig.2 Protein levels of inflammatory cytokines and bitter taste receptor in each groupNote: 1.Control group；2.PM2.5 group；3.PM2.5+ limonin group.

3 討論

炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)是慢性氣道炎癥性疾病的主要病理特征之一，各類炎癥細(xì)胞侵潤(rùn)所釋放的大量炎癥因子和炎癥介質(zhì)是疾病發(fā)生發(fā)展的始發(fā)環(huán)節(jié)，亦是引起黏液高分泌并導(dǎo)致氣道阻塞的重要事件[4]。COPD急性加重期的患者常伴有如TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-13等炎癥因子的大量釋放，從而導(dǎo)致氣道炎癥加重，氣道水腫加重，氣道阻塞，甚者出現(xiàn)缺氧和二氧化碳潴留[5,6]。中醫(yī)中藥輔助抗炎治療已獲肯定，臨床上常用的抗炎清熱、止咳化痰類中藥如陳皮、桔梗、遠(yuǎn)志、前胡、款冬花等多數(shù)帶有苦味成分，“苦”物質(zhì)可以抗炎，這是廣泛認(rèn)可的，但“苦”為何能抗炎卻眾說紛紜，無確切的解釋。

TAS2Rs是一類表達(dá)于味覺感受細(xì)胞的G蛋白偶聯(lián)受體，味覺細(xì)胞的TAS2Rs被苦味物質(zhì)激活后，可與G蛋白發(fā)生偶聯(lián)，通過G蛋白的經(jīng)典信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，使味覺細(xì)胞發(fā)生去極化并釋放神經(jīng)遞質(zhì)，將信號(hào)傳給大腦，從而感知苦味[7,8]。自國(guó)外研究證實(shí)TAS2Rs在氣道表達(dá)之后，相繼的研究結(jié)果顯示氣道上皮TAS2Rs的激活可產(chǎn)生舒張支氣管及促進(jìn)纖毛擺動(dòng)作用[9,10]，而其對(duì)氣道炎癥的作用涉及甚少。已有研究通過篩選發(fā)現(xiàn)，陳皮的藥效成分檸檬苦素和白果藥效物質(zhì)蘆丁、奎寧對(duì)TAS2Rs的亞型TAS2R14受體具有顯著的激動(dòng)作用[11]。據(jù)此認(rèn)為“苦”物質(zhì)可能借激活氣道上的TAS2Rs發(fā)揮其抗炎效應(yīng)。

本研究采用PM2.5為誘導(dǎo)因素，制成大鼠的慢性氣道炎癥模型，以具代表性的苦味中藥陳皮的苦味單體“檸檬苦素”為干預(yù)刺激因素，并選取在呼吸道及肺組織高表達(dá)的TAS2R14為靶目標(biāo)進(jìn)行研究。結(jié)果顯示：PM2.5刺激后，炎癥因子TNF-α及IL-13的mRNA和蛋白表達(dá)水平升高，說明PM2.5可誘導(dǎo)炎癥因子的產(chǎn)生進(jìn)而形成慢性氣道炎癥。以檸檬苦素對(duì)PM2.5誘導(dǎo)的氣道炎癥進(jìn)行干預(yù)后，炎癥因子TNF-α及IL-13的mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯下降，表明苦味單體檸檬苦素對(duì)炎癥因子的產(chǎn)生具有遏制作用。此外，對(duì)各組的TAS2R14檢測(cè)結(jié)果表明，檸檬苦素干預(yù)組TAS2R14的基因轉(zhuǎn)錄及翻譯表達(dá)較未干預(yù)組明顯升高，提示中藥苦味組份刺激可引起支氣管/肺組織的TAS2R14的激活表達(dá)，說明TAS2R14參與了苦味質(zhì)的抗炎效應(yīng)過程。

本實(shí)驗(yàn)選擇TNF-α和IL-13作為炎癥反應(yīng)強(qiáng)度的觀察指標(biāo)，是因?yàn)門NF-α是由單核巨噬細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的一種代表性炎性細(xì)胞因子，對(duì)炎癥、感染及免疫源性反應(yīng)產(chǎn)生首發(fā)性應(yīng)答效應(yīng)[12]，具有多種前炎性介質(zhì)的功能，是重要的細(xì)胞因子啟動(dòng)子，能啟動(dòng)其他炎性介質(zhì)如IL-1β等釋放及促進(jìn)中性粒細(xì)胞脫顆粒，對(duì)炎癥過程起瀑布性放大作用[13,14]。而另一指標(biāo)IL-13作為白細(xì)胞介素家族的代表，其主要由活化的Th細(xì)胞分泌，可激活B細(xì)胞的增殖和IgE的產(chǎn)生，屬多效能細(xì)胞因子。IL-13是至今為止所知的重要炎性因子之一，其可導(dǎo)致呼吸道炎癥、黏液分泌增加和杯狀細(xì)胞增生等多種呼吸道病理改變[15]。由于炎癥因子與COPD患者的病情進(jìn)展和預(yù)后密切相關(guān)，故本實(shí)驗(yàn)著重觀察苦味素受體的激活與炎癥反應(yīng)強(qiáng)度的關(guān)系，結(jié)果提示肺部TAS2Rs的激活不僅可減少TNF-α介導(dǎo)相關(guān)炎性細(xì)胞因子的釋放及阻遏白細(xì)胞的聚集，亦可削弱炎性因子誘導(dǎo)的杯狀細(xì)胞增生及促黏液高分泌形成等作用，還能進(jìn)一步抑制由中性粒細(xì)胞脫顆粒產(chǎn)生對(duì)細(xì)胞外蛋白的分解效應(yīng)，從而阻遏炎癥應(yīng)答、血管生成和組織纖維化的發(fā)生。

目前研究已證實(shí)苦味質(zhì)可激活氣道上皮的TAS2Rs產(chǎn)生舒張支氣管及促進(jìn)纖毛擺動(dòng)作用，而本實(shí)驗(yàn)則進(jìn)一步證實(shí)了TAS2Rs的活化還具有抗炎效應(yīng)，表明TAS2Rs對(duì)呼吸道具有多種有益效應(yīng)。這不僅為臨床上苦味類中藥發(fā)揮抗炎效應(yīng)提供了客觀的解釋依據(jù)，亦為其他“苦”味類藥物的治療提供了新的詮釋機(jī)制及藥物干預(yù)靶點(diǎn)。

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[收稿2017-04-11 修回2017-05-09]

(編輯 許四平 劉格格)

ContainmenteffectsofbittertastenativeingredientfromtraditionalChinesemedicineonairwayinflammationprocessviabittertastereceptorpathway

LIUMei-Hua,ZHOUXiang-Dong,LIQi,LIUFeng,WANGJie,ZHONGYou-Qing.

DepartmentofRespiratoryMedicine,theFirstAffiliatedHospitalofHainanMedicalCollege,Haikou570102,China

Objective:To investigate the anti-inflammatory effects of bitter taste receptor (TAS2Rs) in the treatment of chronic airway inflammation by bitter Chinese medicine.Methods: The experiment was divided into three groups (n=8),namely blank control group,PM2.5 group (the rat models of chronic airway inflammation were established by aerosolized PM2.5 suspension ) and PM2.5+limonin group (intervening with the extract from Tangerine peel).The expression of mRNA and protein of inflammatory cytokines and TAS2Rs in bronchial/pulmonary tissue were detected by ELISA,RT-PCR and Western blot respectively.Results: The mRNA and protein expression levels of TNF-α and IL-13 in PM2.5 stimulated group were significantly higher than those in control group,while the TAS2R14 were not significantly changed.The mRNA and protein expression levels of TNF-α and IL-13 in the limonin intervention group was lower than that in the PM2.5 group,and the TAS2R14 were significantly increased.Conclusion: The production and release of inflammatory cytokines in the chronic inflammatory airway can be curbed by inhaling the components of bitter Chinese herbal medicine.And then,the TAS2Rs in the lungs can be activated by the bitter components to increase its expression.Therefore,it is considered that bitter Chinese herbal medicine to play the airway anti-inflammatory effect is achieved through the activation of the airway TAS2Rs.

Bitter taste receptor;Bitter Chinese herbal;Inflammatory cytokines;Airway inflammation

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.09.011

①本文為國(guó)家自然科學(xué)基金(81660010，81611530713)、海南省自然科學(xué)基金(2016-8305)、海南省教育廳科研課題(Hnky2016-35)和海南醫(yī)學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新課題。

劉美花(1990年-)，女，在讀碩士，主要從事慢性氣道炎癥性疾病的發(fā)生及干預(yù)方面的研究。

及指導(dǎo)教師：周向東(1963年-)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事慢性氣道炎癥性疾病的發(fā)生及干預(yù)方面研究，E-mail:zxd999@263.net。

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